СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЛАЗМИНОГЕНА Российский патент 2002 года по МПК G01N33/48 G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для исследования крови при нарушениях в системе гемостаза.

Ферментная система, вызывающая расщепление фибриногена и фибрина, известна как фибринолитическая или плазминовая система. Главным ее действующим началом является плазмин - протеаза, содержащаяся в плазме в виде профермента - плазминогена.

Известен способ определения плазминогена на основе гидролиза нитроамидной связи хромогенного субстрата с образованием окрашенного вещества (Момот А.П., Мамаев А.Н., Баркаган З.С., Неведрова О.Е., Макаров В.А., Воющина Т. Л. , Ерин Д.Н.. Метод определения плазминогена и его диагностическое значение.// Проблемы гематологии, 1999. - 1. - С. 17-20).

Недостатком известного способа является трудоемкость, высокая стоимость и необходимость использования специального оборудования для фотометрического анализа. Кроме того, амидолитические методы определения ферментов, как известно, не всегда совпадают с результатами функциональных определений, что может быть связано с недостаточной специфичностью хромогенного субстрата.

Наиболее близким по достигаемому положительному результату (прототип) является способ определения плазминогена по эуглобулиновому лизису при активации стрептокиназой (Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза, 1999. - С. 126-128).

Способ-прототип осуществляют следующим образом.

Предварительно получают бедную тромбоцитами контрольную нормальную плазму и бедную тромбоцитами плазму больного.

1 этап. Получение эуглобулиновой фракции плазмы.

Для получения эуглобулиновой фракции к 8,0 мл дистиллированной воды добавляют 0,15 мл 1% уксусной кислоты и 0,5 мл исследуемой плазмы. Смесь выдерживают при температуре +2...+8^oС в течение 30 мин;
2 этап. Осаждение эуглобулиновой фракции плазмы.

Эуглобулины осаждают центрифугированием при 1500 об/мин (240 g) в течение 7 мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирку осушают опрокидыванием на фильтровальную бумагу.

3 этап. Получение фибринового сгустка эуглобулинов и определение времени его лизиса.

Осадок эуглобулинов разводят в 0,5 мл трис-НCl-буфера (0,1 М, рН 7,4), устанавливают пробирку на водяную баню (+37^oС). Затем, не вынимая пробирку из бани, добавляют 0,1 мл раствора стрептокиназы (300 МЕ/мл) и 0,1 мл раствора тромбина (50 NIH ед/мл), включают секундомер и регистрируют время (ЛИС-и) с момента добавления раствора тромбина кальция до полного растворения сгустка фибрина.

Аналогичным образом исследуют контрольную нормальную плазму, полученный результат времени лизиса обозначают как ЛИС-к.

Определяют индекс резерва плазминогена (ИРП) по формуле

где ЛИС-к - время лизиса эуглобулинов в контрольной нормальной плазме, ЛИС-и - то же в исследуемом образце.

В норме ИРП составляет в среднем 100±10%.

К недостаткам способа-прототипа следует отнести:
1. Трудоемкость, многоэтапность и, связанную с этим, значительную затрату времени при проведении исследования.

2. Невозможность количественного определения плазминогена.

3. Зависимость получаемых результатов не только от концентрации плазминогена, но и от концентрации фибриногена в плазме больного.

Заявляемый способ лишен этих недостатков: выполняется в один этап, что значительно сокращает время исследования, позволяет проводить количественную оценку и не зависит от концентрации фибриногена в исследуемой плазме.

Авторами разработан высокоэффективный способ определения плазминогена, позволяющий определять концентрацию плазминогена по времени лизиса фибринового сгустка, которое не зависит от концентрации фибриногена в исследуемой плазме.

Положительным результатом заявляемого способа является повышение точности определения плазминогена. Положительный результат достигается тем, что в качестве источника образования фибринового сгустка используют фибрин-мономер в концентрации 1,0-10,0 г/л.

Способ осуществляют следующим образом.

Реактивы и оборудование:
1. Цитрат натрия трехзамещенный, 3,8% раствор, получают растворением 3,8 г цитрата натрия в 100 мл дистиллированной воды.

2. Фибрин-мономер из плазмы крови человека (лиофильно высушенный), фирма "Технология-Стандарт", Россия.

3. Стрептокиназа (лиофильно высушенная), 1500 ME, фирма "Технология-Стандарт", Россия.

4. Буфер трис-НCl концентрированный (20:1), 1,0 М, рН 7,3-7,4, фирма "Технология-Стандарт", Россия.

5. Каолин (легкая фракция), взвесь с концентрацией 50 мг/мл дистиллированной воды, фирма "Технология-Стандарт", Россия.

6. Дистиллированная вода.

7. Центрифуга ОПН-8.

8. Термостат для исследования гемокоагуляции (ТПС).

9. Секундомер.

10. Пробирки стеклянные объемом 20 мл.

11. Цилиндр стеклянный мерный на 100 мл.

Приготовление реактивов:
1. Разведение фибрин-мономера: во флакон с лиофильно высушенным фибрин-мономером добавляют 2,0 мл дистиллированной воды и при легком покачивании растворяют реагент в течение 10 мин.

2. Разведение стрептокиназы: во флакон с лиофильно высушенной стрептокиназой добавляют 5,0 мл дистиллированной воды и при легком покачивании растворяют реагент в течение 2 мин.

3. Приготовление рабочего буферного раствора: Концентрированный буфер в объеме 1,0 мл и взвесь каолина в объеме 2,0 мл вносят в мерный цилиндр, и общий объем доводят дистиллированной водой до 100 мл. В результате получают буферный раствор со следующим составом: трис-НCl 0,01 М, рН 7,3-7,4, содержащий каолин в концентрации 1,0 мг/мл.

Подготовка исследуемой плазмы больного и пула контрольной нормальной плазмы крови (взятой у здоровых людей).

Кровь получают из локтевой вены самотеком через иглу в пластиковую пробирку, содержащую 0,1 М раствор цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9: 1). Кровь центрифугируют 5 мин при скорости вращения 1000 об/мин (200 g). Полученную богатую тромбоцитами плазму повторно центрифугируют в течение 20 минут при 4000 об/мин (1200 g). Полученную бедную тромбоцитами плазму используют для проведения исследования.

Для приготовления пула контрольной нормальной плазмы в равной пропорции смешивают образцы бедной тромбоцитами плазмы от 8-10 здоровых людей. Содержание плазминогена в таком пуле плазмы принимают за 100% от нормы.

Ход определения.

В пробирку вносят 0,1 мл исследуемой плазмы и выдерживают на водяной бане 1 мин при +37^oС. Затем последовательно добавляют 0,1 мл раствора стрептокиназы, 0,8 мл буфера (имеющего температуру +37^oС) и 0,1 мл раствора фибрин-мономера, немедленно включают секундомер и инкубируют на водяной бане при +37^oС. Периодически доставая пробирку из водяной бани (не встряхивая) и наклоняя ее, отмечают время от момента добавления раствора фибрин-мономера до окончания лизиса сгустка.

По калибровочной кривой находят содержание плазминогена (в %).

Построение калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой готовят серию разведении контрольной нормальной плазмы в соответствии с таблицей 1.

С каждым из разведении пула контрольной нормальной плазмы определяют время лизиса по указанной выше методике. Все измерения проводят трижды, рассчитывают средний результат. При построении калибровочной кривой по оси ординат откладывают время лизиса (в секундах), по оси абсцисс - уровень плазминогена (в %) в соответствии с указанными выше разведениями. Калибровочная кривая приведена на чертеже.

Оценка полученных результатов. По результатам обследования здоровых людей (45 наблюдений) время лизиса фибринового сгустка составляет 48-55 с (Х= 51,2; σ= 1,65; m=0,34). При этом уровень плазминогена (по калибровочной кривой) колеблется от 86 до 113% (Х=99,8%; m=1,39%; σ=6,84%).

Апробация предлагаемого способа.

Апробация заявляемого способа проведена на 25 больных с острым ДВС-синдромом, в том числе посттравматическим (8), септическим (14), акушерским (3). Данные обследования больных представлены в таблице 2.

Из нее видно, что концентрация плазминогена в плазме больных с острым ДВС-синдромом, характеризующимся потреблением плазминогена, закономерно снижается.

Оценка влияния концентрации фибриногена на показатели способа-прототипа и предложенного способа.

Как известно, в норме концентрация фибриногена в плазме составляет 2,0-4,0 г/л. Пулированную контрольную нормальную плазму прогревали при температуре +56^oС в течение 6 мин, таким образом добивались удаления фибриногена. В эту лишенную фибриногена плазму вносили стандартные количества препарата сухого фибриногена (фирмы Behringer, Германия) с тем, чтобы получить ряд его концентраций в плазме 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 5,0, 6,0 и 7,0 г/л (таблица 3).

Как видно из таблицы 3, ошибка измерений по способу-прототипу в условиях гипофибриногенемии (сравнение результатов при концентрации фибриногена 1,0 и 2,0 г/л) составляет +28,4%, и при гиперфибриногенемии (сравнение результатов при концентрации фибриногена 4,0 и 7,0 г/л) равняется - 26,1%.

В сравнении с этим ошибка определений концентрации плазминогена по предложенному способу при гипофибриногенемии составляет +4,6%, а при гиперфибриногенемии (сравнение результатов при концентрации фибриногена 4,0 и 7,0 г/л) равняется - 0,8%.

Обоснование выбранного диапазона концентрации фибрин-мономера для определения концентрации плазминоногена в предложенном способе.

Для выбора требуемой концентрации фибрин-мономера при определении концентрации плазминогена использовали образцы раствора фибрин-мономера с концентрацией от 0,5 до 12,0 г/л (таблица 4). Установлено, что оптимальные концентрации фибрин-мономера лежат в диапазоне от 1,0 до 10,0 г/л. Снижение концентрации фибрин-мономера ниже 1,0 г/л приводило к тому, что сгусток не образовывался. С другой стороны, использование концентрации фибрин-мономера свыше 10,0 г/л приводило к образованию чрезмерно плотного сгустка, который практически не поддавался лизису.

Специфичность способа и его воспроизводимость.

Таким образом, заявляемый способ отличается высокой точностью при определении концентрации плазминогена. Патологический уровень фибриногена в исследуемой плазме не оказывает влияния на показания заявляемого способа.

Для оценки воспроизводимости заявляемого способа использовали коэффициент вариации CV(%). Коэффициент вариации способа при исследовании в разные дни не превышает 5%.

Способ относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использован для исследования крови при нарушениях в системе гемостаза. Способ включает определение времени лизиса фибринового сгустка при активации плазминогена стрептокиназой, при этом в качестве источника образования фибринового сгустка используют фибрин-мономер в концентрации 1,0-10,0 г/л. Технический результат: способ обладает высокой эффективностью и точностью, позволяет определять концентрацию плазминогена по времени лизиса фибринового сгустка, которое не зависит от концентрации фибриногена в исследуемой плазме. 4 табл., 1 ил.

Способ определения плазминогена, включающий определение времени лизиса фибринового сгустка при активации плазминогена стрептокиназой, отличающийся тем, что в качестве источника образования фибринового сгустка используют фибрин-мономер в концентрации 1,0-10,0 г/л.