СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБИНА Российский патент 2012 года по МПК C12N9/74 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и может быть использовано для промышленного получения естественного компонента свертывающей системы крови фактора IIа фермента тромбина из плазмы крови человека или фракции II+III по Кону плазмы крови человека или плазмы крови крупного рогатого скота.

Конечный продукт технологии тромбин может использоваться в качестве компонента тест-систем для диагностики патологии системы гемостаза при гемофилии, дисфибриногенемии, тромбозах, тромбоэмболии, синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания.

При дополнительной очистке известными способами тромбин может использоваться в качестве лекарственного препарата. В частности, как местное гемостатическое (кровоостанавливающее) средство при кровотечениях, а также в качестве компонента при производстве гемостатических губок.

Разработка эффективных способов получения тромбина является ключевой задачей в решении проблем промышленного получения недорогих тест-систем для диагностики нарушений системы гемостаза и эффективных средств для уменьшения кровопотери при хирургических вмешательствах, травмах, заболеваниях крови и ожогах.

Известен способ получения тромбина «Improved thrombin preparations» (патент № ЕР 0277096, World intellectual property organization, 07.08.1992) путем двухэтапной хроматографии плазмы крови человека. На первом этапе используют диэтиламиноэтилсефарозу, на втором этапе используют карбоксиметилсефарозу. Тромбин элюируют из колонки с использованием ацетатного буфера 0,05 М в 0,45М-растворе NaCl при рН 5,0; либо при использовании фосфатного буфера 0,05 М в 0,45М-растворе NaCl при рН 6,0. В продукт - тромбин добавляют ацетатный (рН 5,0) или фосфатный (рН 6,5) буфер, а также глицерин от 25 до 50% от массы.

Полученный тромбин отличается высокой стабильностью и при дальнейшей антивирусной обработке может использоваться в качестве местного кровоостанавливающего средства, однако недостатками известного способа являются:

1. использование двух видов сорбента сефарозы, что ведет к удорожанию продукта;

2. использование глицерина в качестве стабилизатора делает невозможным использование тромбина в диагностических целях;

3. невозможность лиофилизации тромбина для длительного хранения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому техническому результату является «Способ крупномасштабного производства устойчивой при хранении композиции тромбина терапевтической степени чистоты» (патент №2144081).

По известному способу плазму крови (сырье) подготавливают разбавлением водой и фосфатным или композиционным буфером (рН 5,3), затем подготовленную плазму крови центрифугируют. Полученный центрифугат является промежуточным продуктом, а тромбин получают посредством катионообменной хроматографии на сульфопропилсферодексе. Превращение выделяемого протромбина в тромбин осуществляют путем растворения промежуточного продукта, содержащего протромбин в растворе натрия хлорида (рН 7,0), и инкубирования с раствором кальция хлорида в течение 2 ч. Реакционную смесь центрифугируют и получают суспензию тромбина. Тромбин проходит несколько ступеней очистки: обработка противовирусным средством, ионообменная очистка, мембранные противовирусные фильтры.

Известный способ позволяет обеспечить выход тромбина до 180 тыс. ед. из 5 л сырья (плазма крови человека), тромбин отличается высокой антивирусной чистотой (для использования в лечебных целях) и сохраняет активность до 6 месяцев при +4°С в лиофилизированном состоянии без существенной потери активности тромбина, однако недостатком известного способа является относительно невысокий выход получения тромбина.

Техническим результатом заявляемого способа являются повышение выхода получения тромбина до 40-60 тыс. NIH единиц активности тромбина из 1 л плазмы крови человека или фракции II+III по Кону плазмы крови человека или плазмы крови крупного рогатого скота и улучшение стабильности при хранении раствора тромбина до 12 месяцев при +4°С и лиофилизированного тромбина до 36 месяцев при +4°С без потери активности тромбина.

Технический результат достигается подготовкой сырья добавлением раствора гепарина из расчета 50-800 ME на 1 л сырья, добавлением полиэтиленгликоля 6000 в количестве 0,75-1,25% от массы суспензии тромбина и доведением рН суспензии тромбина до величины 5,25-5,75 добавлением 10% или 20% раствора уксусной кислоты.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом. Результаты экспериментов представлены в таблицах 1-3. В таблице 1 представлено влияние добавления раствора гепарина разной активности в сырье на выход продукта при добавлении на этапе получения суспензии тромбина полиэтиленгликоля 6000 в количестве 1% от массы суспензии и доведении рН суспензии до величины 5,5.

В таблице 2 представлено влияние добавления различных концентраций полиэтиленгликоля 6000 в суспензию тромбина на выход продукта при добавлении в сырье раствора гепарина из расчета 400 ME на 1 л сырья и доведении рН суспензии тромбина до величины 5,5.

В таблице 3 представлено влияние различных величин рН суспензии тромбина на выход продукта при добавлении в сырье раствора гепарина из расчета 400 ME на 1 л сырья и добавлении в суспензию тромбина полиэтиленгликоля 6000 в количестве 1% от массы суспензии.

В заявляемом способе используют:

Оборудование

1. Центрифуга рефрижираторная ЦР-6 (Россия) - 1 шт.

2. Коагулометр Минилаб 701 (Юнимед, Россия) - 1 шт.

3. рН-метр WTW 315i (WTW, Германия) - 1 шт.

4. Термометр ртутный стеклянный (диапазон измерямых темератур: 0-100°С) - 1 шт.

5. Термостат типа ТР (Данфорсс, Германия) - 1 шт.

6. Штатив - 1 шт.

7. Емкость 1 л - 1 шт.

8. Емкость 3 л - 1 шт.

9. Емкость 5 л - 1 шт.

10. Емкость 10 л - 3 шт.

11. Емкость 50 л - 1 шт.

Вещества и материалы (на 30 л сырья)

1. Натрия хлорид х.ч. (Реахим, Россия) - 10 кг.

2. Гепарин 5000 МЕ/мл (Акционерное Курганское общество медицинских препаратов и изделий «Синтез», Россия) - 2,5 мл.

3. Бария сульфат х.ч. (Реахим, Россия) - 600 г.

4. Кальция хлорид 0,5 М (Технология-Стандарт, Россия) - 150 мл.

5. Трис-HCl буфер 1 М (Технология-Стандарт, Россия) - 500 мл.

6. Натрия цитрат (лимоннокислый) 5,5 водный х.ч. (Реахим, Россия) - 300 г.

7. Аммония сульфат х.ч. насыщенный раствор (Реахим, Россия) - 150 мл.

8. Полиэтиленгликоль 6000 (Panreac, Applichem, Германия) - 150 г.

9. Полиэтиленгликоль 10000 (Fluka, Merck, Германия) - 300 г.

10. Диэтиламиноэтилцеллюлоза (Sigma-Aldrich, Германия) - 500 г.

11. Альбумин бычий сухой (Biowest, Великобритания) - 15-20 г.

12. Альбумин человеческий (Россия) 10-20 г.

13. Уксусная кислота ледяная х.ч. (Реахим, Россия) - 1 мл.

14. Фиккол 400 х.ч. (Merck, Германия) - 50 г.

15. Сахароза ч.д.а. (Реахим, Россия) - 50 г.

16. Мертиолат х.ч. (Merck, Германия) - 4 г.

17. Гемодиализная колонка (Hemoflow, Германия) - 1 шт.

Контрольные материалы

1. Концентрат тромбопластина 5 мл, лиофилизированный (Технология-Стандарт, Россия) - 60 фл.

2. Нормальная плазма человека РНП 1 мл, лиофилизированная (Технология-Стандарт, Россия) - 2 фл.

Во время подготовки сырья в плазму крови человека или фракцию II+III по Кону плазмы крови человека или в плазму крови крупного рогатого скота добавляют раствор гепарина из расчета 400 ME на 1 л сырья. В подоготовленное сырье добавляют водный 20% раствор бария сульфата, из расчета 100 мл раствора бария сульфата на 1 л полупродукта. Перемешивают и центрифугируют при 2000g в течение 7 минут. Полученный осадок содержит белки протромбинового комплекса. Осадок ресуспензируют 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 0,12 л раствора на количество осадка, полученного из 1 л сырья. Суспензию центрифугируют при 2000g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость утилизируют, а осадок используют на дальнейших стадиях. Осадок ресуспензируют 0,05М-раствором трис-HCl буфера с температурой 40°С из расчета 0,12 л раствора на количество осадка, полученного из 1 л сырья. Суспензию инкубируют при температуре 37°С в течение 30 минут. В суспензию вносят 150 мл насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивают и охлаждают до комнатной температуры. В суспензию добавляют 300 г полиэтиленгликоля 10000, перемешивают и инкубируют при комнатной темературе в течение 30 минут. Суспензию центрифугируют при 2000 g в течение 15 минут. Осадок утилизируют. Надосадочную жидкость, содержащую растворенные белки протромбинового комплекса, используют на следующих стадиях. Надосадочную жидкость переносят в раствор, содержащей 45 л дистиллированной воды и 1 кг геля, содержащего 500 г диэтиламиноэтилцеллюлозы в 500 мл дистиллированной воды. Полученную смесь перемешивают и инкубируют в течении 60 минут при комнатной температуре, перемешивая с интервалом 10-15 минут. Надгелевую жидкость утилизуют. Гель содержит компоненты протромбинового комплекса и используется на следующих стадиях.

Активацию протромбина (перевод протромбина в тромбин) осуществляют добавлением в гель 150 мл 0,5М-раствора кальция хлорида, 100 мл 1M-раствора трис-HCl буфера, 1 г тромбопластина в 150 мл дистиллированной воды. Гель перемешивают. Каждые 15 минут в надгелевой жидкости коагулометрически оценивают активность тромбина. Нарастание активности тромбина в растворе свидетельствует о начале фазы активации (превращение протромбина в тромбин). В варианте получения тромбина из плазмы крови человека или фракции II+III по Кону плазмы крови человека после начала активации реакционную смесь инкубируют 14-18 часов при комнатной температуре. В варианте получения тромбина из плазмы крупного рогатого скота через 10 минут после начала активации каждые 15 минут в течение 40-60 минут, пока активность тромбина в надгелевой жидкости перестанет возрастать в суспензию тромбина добавляют 200 мл дистиллированной воды, содержащей 2 мл 20% раствора уксусной кислоты. После завершения фазы активации коагулометрически оценивают конечную активность тромбина в 1 мл полупродукта в надгелевой жидкости и сливают в другую емкость.

В полученную на предыдущей стадии суспензию тромбина из расчета на 1 л вносят 20 мл 10% раствора альбумина человека или 5 г сухого бычьего альбумина. Добавляют 0,75-1,25% от массы суспензии сухой полиэтиленгликоль 6000 и доводят величину рН суспензии 10% или 20% раствором уксусной кислоты до рН 5,25-5,75.

Диализ суспензии тромбина осуществляют на гемодиализной колонке дистиллированной водой. Параметры диализа: расход дистиллированной воды 2,3 л/мин, расход суспензии тромбина 1,3 л/ч. В полученный после диализа раствор тромбина из расчета на 1 л добавляют 10 мл 1М трис-буфера, 10 г сахарозы, 20 г лактозы моногидрата, 10 г фиколла 400, 1 г мертиолата. В варианте получения тромбина из бычьей крови в полученный раствор тромбина из расчета на 1 л вносят 10 г полиэтиленгликоля 6000 и доводят рН раствора тромбина до величины 5,5 добавлением 10% или 20% раствора уксусной кислоты. Полученный на предыдущих стадиях раствор тромбина разливают в необходимом объеме во флаконы и осуществляют лиофильную сушку.

Величины активности добавляемого раствора гепарина в сырье, количество добавляемого в суспензию тромбина полиэтиленгликоля 6000 и величину рН суспензии тромбина установлены в процессе эксперимента. Результаты экспериментов представлены в таблицах 1-3. В таблице 1 представлены результаты экспериментов влияния добавления раствора гепарина различной активности в сырье на выход тромбина. В таблице 2 представлены результаты экспериментов влияния добавления поолиэтиленгликоля 6000 в суспензию тромбина на выход тромбина. В таблице 3 представлены результаты экспериментов влияния рН суспензии тромбина на выход тромбина.

Заявляемый способ позволяет повысить выход получения тромбина до 40-60 NIH ед./л активности из 1 л крови человека или крупного рогатого скота и повысить стабильность тромбина при хранении раствора тромбина до 12 месяцев при +4°С и лиофилизированного тромбина до 36 месяцев при +4°С без существенной потери активности тромбина.

Таблица 1 Способ промышленного получения тромбина Активность гепарина, добавляемого в 1 л сырья, ME Активность тромбина из 1 л сырья, тыс. NIH ед./л 50 45 100 49 200 54 300 56 400 60 500 57 600 52 700 49 800 46

Таблица 2 Концентрация полиэтиленгликоля в суспензии тромбина, % Активность тромбина из 1 л сырья, тыс. NIH ед./л 0,75 49 0,85 51 0,95 56 1 60 1,05 55 1,15 51 1,25 44

Таблица 3 Способ промышленного получения тромбина Величина рН суспензии тромбина Активность тромбина, тыс. NIH ед./л 5,25 40 5,35 53 5,45 57 5,50 60 5,55 56 5,65 50 5,75 41

Способ промышленного получения тромбина предусматривает подготовку сырья, получение комплекса белков, содержащих протромбин, активацию протромбина и превращение его в тромбин, очистку диализом и лиофильную сушку раствора тромбина. При этом в сырье вносят раствор гепарина из расчета 50-800 ME на 1 л сырья. При использовании в качестве сырья плазмы крови человека или фракции II+III по Кону плазмы крови человека после начала активации протромбина суспензию тромбина инкубируют при 14-18 ч, добавляют полиэтиленгликоль 6000 в количестве 0,75-1,25% от массы суспензии тромбина, доводят рН суспензии тромбина до величины 5,25-5,75 добавлением 10% или 20% раствора уксусной кислоты. При использовании в качестве сырья плазмы крови крупного рогатого скота после начала активации протромбина через 10 минут каждые 15 минут в течение 40-60 минут добавляют 200 мл дистиллированной воды, содержащей 2 мл 20%-раствора уксусной кислоты, добавляют 0,75-1,25% полиэтиленгликоля 6000 от массы суспензии, доводят рН суспензии тромбина до величины 5,25-5,75 добавлением 10% или 20% раствором уксусной кислоты. Изобретение обеспечивает повышение выхода тромбина и улучшение стабильности тромбина при хранении. Выход тромбина составляет 40-60 тыс. NIH единиц активности тромбина из 1 л плазмы крови. 2 н.з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ промышленного производства тромбина, заключающийся в подготовке сырья, получении комплекса белков, содержащих протромбин, активации протромбина и превращении его в тромбин, очистке и лиофильной сушке раствора тромбина, отличающийся тем, что в качестве сырья используют плазму крови человека или фракцию II+III по Кону плазмы крови человека, в которое добавляют раствор гепарина из расчета 50-800 ME на 1 л сырья, после начала активации протромбина суспензию тромбина инкубируют при 14-18 ч, добавляют полиэтиленгликоль 6000 в количестве 0,75-1,25% от массы суспензии тромбина, доводят рН суспензии тромбина до величины 5,25-5,75 добавлением 10%- или 20%-ного раствора уксусной кислоты, для очистки раствора тромбина используют диализ.

2. Способ промышленного производства тромбина, заключающийся в подготовке сырья, получении комплекса белков, содержащих протромбин, активации протромбина и превращении его в тромбин, очистке и лиофильной сушке раствора тромбина, отличающийся тем, что в качестве сырья используют плазму крови крупного рогатого скота, в которое добавляют раствор гепарина из расчета 50-800 ME на 1 л сырья, после начала активации протромбина через 10 мин каждые 15 мин в течение 40-60 мин добавляют 200 мл дистиллированной воды, содержащей 2 мл 20%-ного раствора уксусной кислоты, добавляют 0,75-1,25% полиэтиленгликоля 6000 от массы суспензии, доводят рН суспензии тромбина до величины 5,25-5,75 добавлением 10%- или 20%-ного раствора уксусной кислоты, для очистки раствора тромбина используют диализ.