ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2009 года по МПК A61K31/409 A61P35/00 

Изобретение относится к области фармакологии, а именно к получению биологически активных соединений хлоринового ряда, в частности производных хлорина e6, и может быть использовано для производства солей хлорина е6, которые могут найти реальное применение в качестве высокоэффективных фотосенсибилизаторов (далее ФС) для фотодинамической терапии рака и других новообразований различного генезиса, а также флюоресцентной диагностики раковых клеток.

Среди многочисленных производных хлоринового ряда, получаемых из природного хлорофилла а и изученных в качестве ФС, только производные хлорина е6 нашли реальное воплощение в медицинской практике и широко применяются в качестве разрешенных препаратов для ФДТ рака и других новообразований (см. структурную формулу ниже)

В настоящее время известны несколько способов получения таких ФС, на базе которых разработана технология создания медицинских препаратов РАДАХЛОРИН (пат. РФ №2183956 от 27.06.2002 и пат. US №6969765 от 29.11.2005), ФОТОЛОН (пат. РФ №2152790 от 20.07.2000), ФОТОДИТАЗИН (пат. РФ №2144538 от 20.01.1998), а также N-аспартил-хлорин е6 (US Pat Appl. №20080021210) (препарат, прошедший регистрацию в Японии, NPe6 или синонимы Laserphyrin, Talaporfin, Talaporfin Sodium).

Так, РАДАХЛОРИН представляет собой смесь натриевых солей по крайней мере двух-трех родственных хлоринов, среди которых хлорин е6 составляет около 80-90% от всей массы ФС, все остальное: пурпурин 5 и хлорин р6. Присутствие примесей хлоринового ряда, по мнению авторов препарата, способствует большей эффективности его как ФС по сравнению с чистым хлорином е6. Наличие примесей хлоринового ряда в препарате РАДАХЛОРИН обусловлено самим методом получения хлорина е6 из феофорбида а, который в принципе не может обеспечить образование хлорина е6 высокой степени чистоты.

Другой ФС - ФОТОЛОН представляет собой комплекс тринатриевой соли хлорина е6 с поливинилпирролидоном (ПВП), причем взаимное содержание хлорина е6 и ПВП может варьировать в очень широких пределах. Помимо хлорина е6 в препарате обнаружены многочисленные хлориновые и порфириновые производные, образование которых также обусловлено методом выделения исходного полупродукта феофитина а из спирулины с содержанием основного вещества не выше 90-95%. Использование такого феофитина а как исходного сырья для синтеза из него хлорина е6 неизбежно приводит к получению конечного препарата, содержащего помимо хлорина е6 также и ряд других родственных хлоринов. Изобретение, по мнению авторов патента, позволяет повысить выход и чистоту продукта до 90-95%. Средство обладает стабильностью при длительном хранении в лиофилизированном состоянии при комнатной температуре и, как предполагают авторы препарата, более высокой специфической активностью по сравнению с чистым хлорином е6 и его солями.

Препарат ФОТОДИТАЗИН представляет собой бис-N-метил-D-глюкаминовую соль хлорина е6 в виде стерильного 0.5%-ного раствора, который представляет собой 0.5%-ный водный раствор N-метил-D-глюкаминовой соли хлорина е6, содержащий поливинилпирролидон. Этот ФС содержит хлорин е6 высокой степени чистоты (97% и выше) с содержанием примесей хлоринового ряда не более 2-2.5%. Однако этот водный раствор недостаточно устойчив и обладает ограниченным сроком хранения (не более 1 года) при хранении в холодильнике при 4-8°С.

И, наконец, ТАЛАПОРФИН, представляет собой тетранатриевую соль N-аспартил-хлорина е6. Этот препарат получают из хлорина е6 в две стадии: 1) обработка хлорина е6 с помощью карбодиимида с выделением промежуточного ангидрида; 2) взаимодействие ангидрида хлорина е6 с водным раствором аспартата натрия и выделение целевого продукта. Добавление в молекулу хлорина е6 остатка аспарагиновой кислоты по-видимому привносит какой-то положительный вклад в биораспределение ФС по органам и тканям во время проведения ФДТ, однако он не такой существенный, чтобы кардинально изменить область применения данного ФС по сравнению с другими ФС на основе хлорина е6.

Все известные ФС на основе хлорина е6 для внутривенного использования представляют собой или водные растворы (концентрация ~ 35 мг хлорина е6 в 10 мл воды, т.е. 0.35%-ный раствор для РАДАХЛОРИНА или 0.5%-ный раствор для ФОТОДИТАЗИНА с последующим разведением до 100 мл), или ФОТОЛОН, приготовленный раствор порошка 100 мг тринатриевой соли хлорина е6 совместно с поливинилпирролидоном в 100 мл воды. Таким образом, концентрация ФС, рассчитанная по содержанию хлорина е6, в инъекционном растворе не превышает 0.3-1.0 мг/мл.

Специальными исследованиями показано, что максимально выраженным фотосенсибилизирующим эффектом обладает хлорин е6, а сопутствующие примеси, которые в основной своей массе легко агрегируют в водных средах, имеют более низкий квантовый выход генерации синглетного кислорода. Эффективность препарата как ФС определяется коэффициэнтом тропности или контрастности. Поэтому присутствующие в препаратах ФОТОЛОН и РАДАХЛОРИН примеси сопутствующих хлоринов размывают четкую границу между раковой опухолью и близрасположенной здоровой тканью, что заметно снижает эффективность ФДТ при работе с данным препаратом, поскольку происходит заметная фотодеструкция и здоровой ткани. Таким образом, наличие примесей даже хлориновой природы заметно снижает эффективность препарата как ФС.

Из всех выше представленных препаратов ФОТОЛОН обладает максимальной устойчивостью при хранении, но в то же время относительно невысокой тропностью, препарат РАДАХЛОРИН обладает примерно такими же потребительскими свойствами как фотолон, а препарат ФОТОДИТАЗИН при высокой тропности обладает низкой устойчивостью при хранении.

Наиболее существенным недостатком лекарственных форм препаратов, основанных на использовании водных растворов, является их относительно невысокая устойчивость при длительном хранении даже при температуре 8-12°С за счет протекания радикальных процессов, приводящих к частичной деструкции и трансформации тетрапиррольного макроцикла.

Поэтому наиболее перспективным для приготовления лекформ препаратов на основе хлоринов является, безусловно, создание лиофильно высушенных форм.

По технической сущности (по своим свойствам) наиболее близким к предлагаемому фотосенсибилизатору является фотосенсибилизатор ФОТОДИТАЗИН для фотодинамической терапии, содержащий хлорин е6 в количестве не менее 98%, N-метил-D-глюкамин в мольном соотношении 1:2 и поливинилпирролидон с молекулярным весом от 9600 до 11500, при этом хлорин е6 имеет определенную структурную формулу (см. пат. RU №2276976, кл. А61K 31/409, от 10.08.2004).

Однако этот фотосенсибилизатор (ФОТОДИТАЗИН) недостаточно устойчив и обладает ограниченным сроком хранения.

По технической сущности наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения фотосенсибилизатора для ФДТ, заключающийся в обработке спирулины неорганической кислотой, перемешивании, фильтрации, с последующим получением производных феофорбида а, растворением их в ацетоне, добавлением неорганического основания в виде водного раствора при нагревании, охлаждением, нейтрализацией соляной кислотой, центрифугированием, отделением осадка, содержащего целевой продукт, и промывки его дистиллированной водой, при этом полученный центрифугированием осадок, содержащий хлорин е6, после промывки дистиллированной водой суспензируют в стерильных условиях в апирогенной воде, рецентрифугируют, растворяют полученный осадок в водном растворе N-метил-D-глюкамина, доводят рН до определенного значения, добавляют нужное количество апирогенной воды, фильтруют раствор и добавляют поливинилпирролидон (см. пат. RU №2276976, кл. А61K 31/409, от 10.08.2004).

Однако использование этого способа позволяет получить только водный раствор ФС, который недостаточно устойчив и обладает ограниченным сроком хранения.

Техническим результатом предлагаемых изобретений является разработка ФС, более устойчивого при длительном хранении даже при комнатной температуре, обладающего повышенными эксплуатационными свойствами и потребительскими качествами, увеличенным сроком хранения его как медицинского препарата и упрощения его практического использования в медицинских учреждениях, а также разработка способа его получения (изготовления), позволяющего получить ФС, обладающий вышеописанными эксплуатационными и потребительскими свойствами.

Достигается это тем, что фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии в лиофильно высушенной форме, согласно изобретению, содержит бис (N-метил-D-глюкаминовую) мононатриевую соль хлорина е6 формулы (1)

и криостабилизатор в соотношении 1:1 весовых частей.

Кроме того, в качестве криостабилизатора берут мальтозу.

Согласно второму техническому решению в способе получения фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии берут хлорин е6 и суспензируют его в апирогенной воде, добавляют при перемешивании вычисленное количество N-метил-D-глюкамина и гидроокиси натрия (Na ОН), полученный раствор солей хлорина е6 фильтруют, добавляют в него вычисленное количество криостабилизатора и лиофилизуют. Кроме того, хлорин е6, N-метил-D-глюкамин и гидроокись натрия берут в следующих мольных соотношениях: 1:2:1, при этом криостабилизатор берут в весовом количестве 1:1 к солям хлорина е6, а в качестве криостабилизатора берут мальтозу.

Сравнение предложенных технических решений с известными позволяет утверждать о соответствии критерию «новизна», а отсутствие в аналогах отличительных признаков говорит о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Предварительные испытания позволяют утверждать о возможности широкого промышленного использования.

По существу предлагается новый способ получения ФС на базе хлорина е6. Данный способ отличается тем, что для получения ФС используется композиция из хлорина е6, который получается химической модификацией метилфеофорбида а, с последующим добавлением N-метил-D-глюкамина (C₇H₁₇NO₅), гидроокиси натрия и криостабилизатора (мальтозы), взятых в определенных соотношениях, которая представляет собой лиофильно высушенный порошок, устойчивый при хранении при комнатной температуре. Этот способ реализуется путем предварительного получения метилфеофорбида а высокой степени чистоты и затем получения фотосенсибилизатора по ниже приведенным методикам.

Соль хлорина е6 имеет следующую структурную формулу

Преимущества:

1. Лиофилизация соли хлорина е6 формулы (1) способствует повышению устойчивости ФС при хранении и облегчает процесс лиофилизации.

2. Добавление криостабилизатора улучшает условия лиофилизации (увеличивает пористость образующейся таблетки, заметно ускоряет процесс лиофилизации, сокращает время растворения при приготовлении инъекционного раствора и заметно повышает устойчивость препарата даже при хранении при комнатной температуре).

3. Лиофилизация ФС позволяет значительно увеличить сохранность медицинского препарата и приготовленных из него лекформ.

4. Использование порошкообразного ФС значительно упрощает приготовление разнообразных рецептур мазей, кремов и гелей, применяемых для ФДТ поверхностных форм рака и других заболеваний в офтальмологии, отолорингологии, стоматологии, гинекологии и др.

Пример. К раствору 4 г метилфеофорбида а в 700 мл ацетона при 40-45°С добавляют 150 мл 10%-ного раствора гидроксида калия (КОН) при интенсивном барбатировании аргона, через 0.5 часа температуру раствора доводят до 60°С, прибавляют 650 мл 10%-ного раствора КОН, выдерживают 1 ч под аргоном, контролируя процесс превращения метилфеофорбида а в хлорин е6 методом ЖХВД (жидкостной хромотографии высокого давления) и после завершения процесса раствор охлаждают до 15-20°С, нейтрализуют реакционную смесь разбавленной соляной кислотой до рН 4.5-5, выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают 5 раз апирогенной дистиллированной водой с последующим рецентрифугированием, затем в стерильных условиях суспендируют осадок в апирогенной воде, к суспензии добаляют 0.5 л раствора N-метил-D-глюкамина и NaOH (вычисленное количество), затем 3.5 г мальтозы и полученный раствор фильтруют через фильтр 0.22 ммк, лиофилизуют во флаконах по 5 мл. Получают ФС в виде пористой таблетки, содержащей во флаконе 35 мг основного вещества (в пересчете на хлорин е6).

Таким образом, в предложенных технических решениях достигается поставленный технический результат.

Таблица хранения, подтверждающая улучшенные свойства заявленного ФС относительно прототипа.

Определение устойчивости фотосенсибилизатора (I) при хранении Исходный раствор Через 3 месяца Через 6 месяцев Через 9 месяцев Через 1 год D раствора 0.455 D=0.450 D=0.450 D=0.445 D=0.445 100% 99% 99% 97.8% 97.8%

Условия хранения - в темноте, в холодильнике при+6-+10°С. Определение процентного содержания фотосенсибилизатора. Растворяют навеску 10 мг сухого фотосенсибилизатора в 400 мл дистиллированной воды, доводят рН раствора до 9.0 и определяют оптическую плотность раствора при 655 нм. При этом за 100% принимают плотность раствора D=0.455, вычисленную исходя из данных коэффициэнта молярной экстинкции для чистого хлорина е6 (мол. вес.596.68) = 36750 для полосы при 655 нм (см. пат. RU 2330037). Заявляемый фотосенсибилизатор содержит бисглюкаминнатриевую соль (мол. вес 1009.1) с таким же коэф. мол. экстинкции и мальтозу в весовом соотношении 1:1, следовательно в 10 мг сухого порошка содержится 2.96 мг хлорина е6.

Заявленный фотосенсибилизатор не уступает прототипу по биологической и фармакологической активности.

Изобретения относятся к области фармакологии, а именно к получению биологически активных соединений хлоринового ряда - фотосенсибилизатора(ФС) для ФДТ. ФС содержит хлорин е6 с N-метил-D-глюкамином и натрием в следующих мольных соотношениях: 1:2:1, и криостабилизатор. ФС имеет структурную формулу (I)

Изобретение раскрывает также способ получения фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии, согласно которому берут хлорин е6 и суспензируют его в апирогенной воде, добавляют при перемешивании N-метил-D-глюкамин и гидроокись натрия (NaOH), полученный раствор солей хлорина е6 фильтруют, добавляют в него вычисленное количество криостабилизатора и лиофилизуют. Указанный ФС более устойчив при длительном хранении, обладает повышенными эксплуатационными свойствами и потребительскими качествами, увеличенным сроком хранения как медицинский препарат. 2 н. и 2 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии в лиофильно высушенной форме, характеризующийся тем, что он содержит бис(N-метил-D-глюкаминовую) мононатриевую соль хлорина е6 формулы (I)

и криостабилизатор в соотношении 1:1 вес. ч.

2. Фотосенсибилизатор по п.1, отличающийся тем, что в качестве криостабилизатора берут мальтозу.

3. Способ получения фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии по п.1 или 2, характеризующийся тем, что берут хлорин е6 и суспензируют его в апирогенной воде, добавляют при перемешивании N-метил-D-глюкамин и гидроокись натрия (NaOH) в следующих мольных соотношениях: хлорин е6, N-метил-D-глюкамин и гидроокись натрия - 1:2:1 соответственно, полученный раствор солей хлорина е6 фильтруют, добавляют в него криостабилизатор в соотношении 1:1 к соли хлорина е6 по весу и лиофилизуют.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве криостабилизатора берут мальтозу.