Монокатионный хлориновый фотосенсибилизатор для фотодинамической инактивации опухолевых клеток Российский патент 2023 года по МПК C07D487/22 A61K31/409 A61P35/00 A61P35/02 

Изобретение относится к фотодинамической терапии в онкологии и предназначено для повышения степени фотодинамической инактивации опухолевых клеток с использованием водорастворимого хлоринового монокатионного фотосенсибилизатора, обладающего высоким сродством к липопротеинам низкой плотности и содержащего в 13 положении макрогетероцикла одну катионную триметилэтиламмонийную группу.

Фотодинамическая терапия (ФДТ) является малоинвазивной альтернативой традиционным методам лечения опухолей и локализованных инфекций, которая также может быть использована в качестве эффективного дополнения к хирургическому вмешательству или химиотерапии, поскольку наряду с эффективной элиминацией патологического процесса, позволяет проводить флуоресцентную диагностику границ опухоли и вызывать ощутимый иммунный ответ, имеющий большое значение для достижения стойкой ремиссии.

ФДТ представляет собой уникальную комбинацию трех компонентов лечения - фотосенсибилизатора (ФС), молекулярного кислорода ³О₂ и видимого света, которые по отдельности не токсичны для живого организма, но объединенные в рамках одной процедуры вызывают гибель малигнизированных клеток. ФДТ опухолей представляет собой двухэтапную процедуру и состоит из локального или системного введения ФС, который избирательно удерживается в опухолях, с последующим локальным их облучением светом с определенной длиной волны, что приводит к запуску каскада фотохимических реакций, связанных с образованием высокореактивного синглетного кислорода ¹О₂ и/или различных радикальных форм а также перекиси водорода (Кустов А.В., Березин Д.Б., Стрельников А.И., Лапочкина Н.П. Противоопухолевая и антимикробная фотодинамическая терапия: механизмы, мишени, клинико-лабораторные исследования. Практическое руководство. Под ред. А.К. Гагуа. Москва: Ларго. 2020. 108 с.). Эти реакции, протекающие в непосредственной близости от активированного светом ФС, опосредуют клеточную токсичность в опухолевой ткани и связанной с ней сосудистой сети, а также вызывают местную воспалительную реакцию, тесно связанную с иммунным ответом организма.

Основные требования к фотосенсибилизатору для проведения ФДТ опухолей включают (Патент RU №2535097, заявл. 07.08.2013, МПК А61К 31/409. Фотосенсибилизатор и способ его получения):

1) низкую темновую токсичность и слабую световую токсичность после проведения лечения;

2) высокую селективность накопления в опухолях, при которой содержание ФС в несколько раз превышает его концентрацию в нормальной ткани;

3) интенсивное поглощение в области окна «оптической прозрачности ткани», то есть в спектральном диапазоне 600-850 нм, где видимый свет обладает наибольшей глубиной проникновения, а энергии фотонов достаточно для активации молекул ФС и генерации синглетного кислорода;

4) высокий квантовый выход синглетного кислорода и/или радикальных форм in vivo;

5) доступность и приемлемую стоимость получения, а также однородный и воспроизводимый химический состав;

6) растворимость в водных средах или разрешенных для внутривенного введения субстанциях или кровезаменителях;

7) стабильность при хранении.

В настоящее время в Российской Федерации зарегистрирован и используется ряд ФС для ФДТ.

ФС «Аласенс» представляет собой гидрохлорид 5-аминолевулиновой кислоты, который в процессе метаболизма в организме превращается в протопорфирин-IX. Однако его существенным недостатком, как и ФС первого поколения на основе порфиринов, является достаточно короткая длина волны возбуждения ~ 630 нм и очень низкая интенсивность поглощения в Q-полосе, что обуславливает малую глубину проникновения света в опухолевую ткань и, следовательно, ограниченную эффективность для больших по размеру опухолей.

ФС «Фотосенс» представляет собой смесь водорастворимых комплексов алюминия с фталоцианином с разной степенью сульфирования и длиной волны возбуждения около 675 нм. Существенным его недостатком являются присутствие нескольких соединений в составе ФС, очень длительное время выведения из организма и, соответственно, высокая остаточная световая токсичность.

Наиболее часто для проведения ФДТ опухолей в России используют анионные хлориновые ФС, получаемого из природного хлорофилла, такие как «Радахлорин» (Патент RU №2183956, заявл. 30.03.2001, МПК А61К 31/409, А61Р 35/00 Фотосенсибилизатор и способ его получения) и «Фотодитазин» (Патент RU №2276976, заявл. 10.08.2004, МПК А61К 31/409 Фотосенсибилизатор и способ его получения). Оба представляют собой соли хлорина е₆: первый ФС представляет собой трина-триевую соль, второй является смешанной солью хлорина е₆ с метилг-люкамином и ионом натрия, взятых в мольном соотношении 2:1.

Однако «Радахлорин» не обладает достаточной степенью чистоты, что может приводить к размыванию четкой границы между опухолью и близкорасположенной здоровой тканью, снижая эффективность ФДТ. «Фотодитазин», как фотосенсибилизатор, представляет собой индивидуальное вещество и наиболее полно клинически исследован. Однако его водные растворы недостаточно устойчивы из-за протекания радикальных процессов, приводящих к частичной деструкции макроцикла, и обладают ограниченным сроком хранения даже при низкой температуре.

Главный недостаток обоих анионных ФС заключается в том, что они сильно полярны. В этой связи, как «Радахлорин», так и «Фотодитазин» при внутривенном введении переносятся в основном сывороточным альбумином (Biophysics, 2000; 45: 305-311; Photodiagnosis Photodyn. Ther. 2005; 2: 91-106), а не липопротеинами низкой плотности (ЛПНП), что ограничивает селективность накопления препаратов в опухолевых клетках, имеющих большое число рецепторов к ЛПНП вследствие аномально высокой скорости роста (Int. J. Biochem. 1993; 25:1369-754; Photodiagnosis Photodyn. Ther. 2006; 3: 214-226).

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому изобретению является фотосенсибилизатор «Фоторан е₆» (российский аналог созданного в Беларуси ФС «Фотолон» (Патент RU №2152790, заявл. 12.05.1999, МПК А61К31/79, G01N33/52. Средство для фотодинамической диагностики и терапии онкологических заболеваний)), представляющий собой тринатриевую соль хлорина е₆ в смеси с поливинилпирролидоном, который выступает в качестве дезагрегирующего агента при внутривенном введении и, как считается, способствует повышению селективности накопления в опухолях (W.Ch.W. Lim, Photosensitizing effects of chlorin е₆ - polyvinylpyrrolidone for fluorescence guided photodynamic therapy of cancer. PhD Diss. Singapore Nat. Univ, 2009. 222 p.).

Однако как и все многозарядные анионные ФС, в организме он транспортируется в основном сывороточным альбумином (Biophysics 2000; 45: 305-311; Photodiagnosis Photodyn. Ther. 2005; 2: 91-106), а его водные растворы недостаточно стабильны.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении степени фотодинамической инактивации опухолевых клеток с использованием водорастворимого хлоринового монокатионного фотосенсибилизатора, обладающего высоким сродством к липопротеинам низкой плотности и содержащего в 13 положении макрогетероцикла одну катионную триметилэтиламмонийную группу.

Технический результат достигается за счет того, что фотосенсибилизатор имеет 95% чистоты и растворяется в водном растворе с концентрацией 0,0014 моль/кг при 25°С, при исследовании способности фотосенсибилизатора к генерации синглетного кислорода установлено, что в жидком 1-октаноле, моделирующем липидное окружение фотосенсибилизатора в организме, он генерирует синглетный кислород с величиной квантового выхода 0,63±0.04, при исследовании характеристик равновесного распределения фотосенсибилизатора между белками плазмы in vitro обнаружено, что он имеет в 11 раз более высокую степень связывания с липопротеинами низкой плотности, при исследовании фотодинамической инактивации клеток лейкемической линии миелоидного происхождения К 562 с концентрацией клеток 1⋅10⁶ клеток/мл, концентрацией фотосенсибилизатора 2⋅10^-7 моль/л, температурой 37°С и при величине дозы 0,66 Дж/см² установлено, что число погибших клеток в растворе фотосенсибилизатора в 7 раз выше.

Сведения, подтверждающие возможность воспроизведения изобретения

Пример 1. Анализ физико-химических характеристик ФС1

Степень чистоты полученного нами по методике (Macroheterocycles 2014; 7: 414-6; Dyes & Pigm. 2018; 149: 553-559) фотосенсибилизатора определялась методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектированием. Как видно из табл. 1, фотосенсибилизатор является чистым соединением, и содержание основного вещества с молекулярной массой 709.4050 г/моль составляет более 95 мас.%.

Исследование растворимости фотосенсибилизатора показало, что он растворяется в водном растворе с концентрацией 0,0014 моль/кг при 25°С, что достаточно для практического использования.

Исследование способности фотосенсибилизатора к генерации синглетного кислорода химическим методом показало, что в жидком 1-октаноле, моделирующем его липидное окружение в организме, фотосенсибилизатор генерирует синглетный кислород с величиной квантового выхода 0,63±0,04, что выше, чем значение у прототипа (тринатриевой соли хлорина е₆), которое составляет 0,56±0.03.

Пример 2. Взаимодействие с белками плазмы in vitro

Определение характеристик равновесного распределения фотосенсибилизатора и прототипа между белками плазмы in vitro проводили с использованием техники колоночной гель-хроматографии. Результаты связывания фотосенсибилизатора с белками, приведенные в табл. 2, показывают, что основными переносчиками фотосенсибилизатора являются липопротеины низкой и высокой плотности (ЛПВП). Сывороточный альбумин, который играет основную роль в транспорте тринатриевой соли хлорина е₆, его практически не связывает. Из табл. 2 видно, что 57% молекул фотосенсибилизатора переносится ЛПНП, в то время как у прототипа эта величина составляет всего лишь 5%, то есть степень связывания ФС с ЛПНП в 11 раз больше.

Пример 3. Фотодинамическая инактивация опухолевых клеток in vitro

Исследовалась фотодинамическая инактивация клеток лейкемической линии миелоидного происхождения К 562.

Концентрация клеток в пробах составляла 1⋅10⁶ клеток/мл, концентрация фотосенсибилизатора и прототипа - 2".10^-7 моль/л, температура -37°С. Фотодинамическую инактивацию проводили диодным лазером ИЛМ-660-0,5 с длиной волны λ=660 нм и плотностью мощности (дозой облучения) 0,22 Дж/см², 0,44 Дж/см² и 0,66 Дж/см², соответственно.

При облучении в отсутствие ФС число погибших клеток не превышало 1% для всех трех доз светового излучения.

Как видно из табл. 3, при всех дозах светового облучения эффективность фотосенсибилизатора оказалась значительно выше, чем у прототипа. При этом при величине световой дозы 0,66 Дж/см² число погибших клеток в растворе фотосенсибилизатора составило 74,8%, а в растворе прототипа - 10,2%, то есть фотодинамическая эффективность ФС в 7 раз выше.

Изобретение относится к фотодинамической терапии в онкологии, а именно к применению монокатионного хлоринового фотосенсибилизатора, содержащего в 13 положении макрогетероцикла одну катионную триметилэтиламмонийную группу:

,

в концентрации 2⋅10^-7 моль/л при температуре 37°С и при величине световой дозы 0,66 Дж/см² для фотодинамической инактивации клеток лейкемической линии миелоидного происхождения К562. Изобретение позволяет повысить степень фотодинамической инактивации опухолевых клеток с использованием водорастворимого хлоринового монокатионного фотосенсибилизатора, обладающего высоким сродством к липопротеинам низкой плотности и содержащего в 13 положении макрогетероцикла одну катионную триметилэтиламмонийную группу. 3 табл., 3 пр.

Применение монокатионного хлоринового фотосенсибилизатора, содержащего в 13 положении макрогетероцикла одну катионную триметилэтиламмонийную группу:

,

в концентрации 2⋅10^-7 моль/л при температуре 37°С и при величине световой дозы 0,66 Дж/см² для фотодинамической инактивации клеток лейкемической линии миелоидного происхождения К562.