СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА ТИПА 1 В ПОПУЛЯЦИЯХ НАРОДОВ БАШКОРТОСТАНА Российский патент 2009 года по МПК A61B10/00 C12Q1/68 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для прогнозирования развития сахарного диабета типа 1 (СД типа 1) у татар и русских Республики Башкортостан.

В настоящее время наблюдается рост заболеваемости СД типа 1 во всем мире. Это обусловлено рядом факторов, в том числе увеличением продолжительности жизни больных диабетом вследствие улучшения диагностической и лечебной помощи, повышением фертильности и ухудшением экологической ситуации.

СД типа 1 требует огромных финансовых затрат со стороны государства. Во-первых, это связано с необходимостью постоянной заместительной гормонотерапии дорогостоящими препаратами инсулина. Во-вторых, СД типа 1 приводит к уменьшению числа трудоспособного населения (ранней инвалидизации и летальности), что обусловлено поздними сосудистыми осложнениями диабета, в числе которых - микроангиопатии (ретинопатия и нефропатия), макроангиопатии (инфаркт миокарда, инсульт, гангрена нижних конечностей), невропатии. Сахарный диабет - очень частая причина слепоты, смерти от уремии. У больного диабетом велик риск развития сердечно-сосудистых заболеваний.

Самым эффективным и экономичным направлением в диабетологии считают профилактику заболевания. Первичная профилактика предполагает формирование групп риска СД типа 1 с использованием молекулярно-генетических маркеров заболевания и меры предупреждения развития болезни. Применение разработанного способа обеспечит выявление лиц с высоким риском развития СД типа 1 для того, чтобы осуществить мероприятия по профилактике развития данной патологии.

Эндокринологическим научным центром РАМН разработаны методические рекомендации №2000/70 по медико-генетическому консультированию в семьях больных СД типа 1. В них предлагаются следующие методы определения повышенного генетического риска развития СД типа 1:

1. Эмпирический метод. Он предполагает определение абсолютного риска развития СД типа 1 у консультируемого лица по таблицам оценки эмпирического риска, созданным на основе многолетнего наблюдения за семьями больных СД типа 1.

2. Метод гаплоидентичности. Позволяет оценить риск развития СД типа 1 у здоровых лиц, имеющих а) больных СД типа 1 сибсов или б) родителей. Для этого необходимо провести молекулярно-генетическое исследование полиморфизма генов HLA-DRB1 и HLA-DQB1 а) консультируемого лица, больного сибса и их родителей б) консультируемого лица и больного родителя. При идентичности консультируемого лица с а) больным сибсом или б) больным родителем по двум гаплотипам риск развития СД типа 1 у консультируемого лица оценивают как «высокий», по одному гаплотипу - «средний», по О гаплотипам - «низкий».

3. Метод HLA-типирования. Предполагает проведение у консультируемого лица молекулярно-генетического или серологического типирования генов (или антигенов) HLA-DRB1 (HLA-DR) и/или HLA-DQB1 (HLA-DQ) и/или DQA1 (HLA-DQ). При выявлении определенных аллелей (антигенов) или их комбинаций констатируют наличие «высокого», «среднего» или «низкого» риска развития СД типа 1 у консультируемого лица.

Вышеперечисленные методы дают возможность прогнозировать развитие СД типа 1 как в семьях больных, так и в общей популяции в целом. Методы доступны по реактивам и оборудованию.

Однако данные методы имеют существенные недостатки:

1. Метод гаплоидентичности отличается высокой дороговизной и трудоемкостью, поскольку предполагает проведение молекулярно-генетического исследования одновременно двух высокополиморфных генетических локусов (HLA-DRB1, HLA-DQB1) у 2-4 лиц.

2. Методы гаплоидентичности и метод HLA-типирования не позволяют оценить риск развития СД типа 1 в количественном отношении.

3. Все три метода разработаны на основе изучения генетической предрасположенности к СД типа 1 в русской популяции г.Москвы, и поэтому не приемлемы для медико-генетического консультирования по СД типа 1 в других регионах, в частности в Башкортостане. Это обусловлено тем, что генетическая предрасположенность к СД типа 1, как и к другим многофакторным заболеваниям, формируется в зависимости от особенностей популяционно-генетической структуры этноса. Поэтому для проведения медико-генетического консультирования целесообразно проводить генотипирование с учетом этнической принадлежности пациента.

Прототипом изобретения является способ прогнозирования развития СД типа 1 в популяциях народов Башкортостана, заключающийся в выделении ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, амплифицикации специфичности гена HLA класса II DQB1, при выявлении аллеля DQB1*03 02/07/08 и генотипа DQB1*02/DQB1*03 у башкир, аллеля DQB1*0302/08 у русских, специфичности DQB1*02 и аллеля DQB1*03 02/08 у татар прогнозируют риск развития СД типа 1 у обследуемого (патент на RU 2285921, 2005). Предложенный способ позволяет с высокой информативностью в количественном отношении оценить риск возникновения данного заболевания у башкир, русских и татар, проживающих в Башкортостане. Недостатками данного метода являются трудоемкость и дороговизна.

Задачей данного изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного, нетрудоемкого и недорогостоящего способа прогнозирования развития СД типа 1 у башкир, русских и татар, проживающих в Башкортостане.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности и уменьшение стоимости и трудоемкости прогнозирования СД типа 1 у башкир, русских и татар, проживающих в Башкортостане.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования развития сахарного диабета типа 1, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, амплификацию гена HLA методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, согласно изобретению проводят генотипирование по полиморфному локусу 252A/G гена LTA HLA класса III, при выявлении генотипа *A/*G у татар и генотипа *G/*G у русских прогнозируют риск развития СД типа 1 у обследуемого.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0,48% лимонной кислоты, 1,32% цитрата натрия, 1,47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 6 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используют метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA // Methods in Molecular Biology / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press. - 1984. - V.2. - P.31-34):

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-НСl (pH 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4000 об./мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, pH 8,0, суспензируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 37°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трис-HCl до pH 7,8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂О; раствор хранят при -20°С.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПНР) для амплификации нужного фрагмента гена LTA. Амплификацию изученных локусов проводят на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Для определения нуклеотидных замен используют метод анализа ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов).

Используют реакционную смесь объемом 12,5 мкл, содержащую 50 мМ трис-HCl-буфера (pH-8.8, 5 мМ MgCl₂, 15 мМ (NH₄)₂SO₄), 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP no 200 мкл каждого), ДНК-полимеразу Termus aquaticus (производства фирмы «Силекс», г.Москва) и следующие локусспецифичные олигонуклеотидные праймеры:

5'-CCG TGC TTC GTG GTT TGG ACT A-3'

5'-AGA GGG GTG GAT GCT TGG GTT С-3'

Последовательность праймеров подобрана с помощью программы PrimerSelect 5.05 с использованием базы данных snpper.chip.org.

Количество праймера в 30 мкл амплификационной смеси рассчитывают по следующей формуле:

V=(0.137·L)/C_pr, где L - длина праймера, C_pr - концентрация праймера в оптических единицах на 1 мл.

Для проведения амплификации использовали программы, приведенные для амплификатора типа МС2, запрограммированного на объем 10 или 15 мкл в режиме точного регулирования.

После денатурации (4 мин при 94°С) выполняют 26 циклов амплификации по схеме: денатурация - 20 секунд при 94°С, отжиг праймеров - 20 сек при 63°С, синтез ДНК -20 сек при 72°С. Затем 1 цикл заключительного синтеза ДНК при 72°С 5 мин.

К 10 мкл реакционной смеси добавляют 5 единиц рестриктазы NcoI (5 ед/мкл) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 24 часов.

После ПЦР-ПДРФ проводят электрофорез в 2% агарозном геле с целью определения длины ампликонов. Электрофорез проводят в 0.5хТВЕ (0.089 М трис; 0.089 М борная кислота; 0.002 М ЭДТА, pH=8.0) в камере для горизонтального электрофореза («Хеликон») с использованием источника постоянного тока с напряжением PowerPack НС, 5-250 В, 300 Вт (Bio Rad). Пробы, перед тем как нанести на гель, смешивают в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25% бромфеноловый синий, 0,25% ксиленцианол и 15% фикол. Электрофорез проводят при напряженности поля около 15 В/см, помещая гель стартовыми лунками к катоду (-) в течение 1 часа. В качестве маркера размера фрагментов используют ДНК плазмиды pUC19, рестрицированную MspI.

После окончания электрофореза гель окрашивают раствором бромистого этидия (концентрация раствора 0,5 мкг/мл, окрашивание в течение 5-10 мин) с последующей промывкой в дистиллированной воде и фотографировали при УФ-освещении с использованием гель-документирующей системы («Vilber Lourmat», Франция 365/254 DI20×20). Продукт амплификации виден в виде светящейся полосы. Аллель LTA 252*А идентифицируют по длине ампликона в 331 пару оснований, а аллель LTA252*G - по наличию двух фрагментов ампликона (234 и 97 пар оснований).

Нами были исследованы образцы ДНК у 368 больных СД типа 1. Контрольная группа включала 655 здоровых добровольных доноров без клинических и лабораторных признаков сахарного диабета и имеющих неотягощенный семейный анамнез по изучаемому заболеванию.

В группе больных СД типа 1 башкир (n=124) по сравнению со здоровыми лицами той же этнической принадлежности (n=66) не установлены достоверные различия по распределению частот аллелей и генотипов полиморфизма 252*A/*G гена LTA (OMIM 153440, 6р21.3). Среди больных СД типа 1 русских (n=122) достоверно чаще встречаются обладатели генотипа *G/*G (15,6% относительно 6,8% в контрольной выборке лиц (n=352) той же этнической принадлежности, Р<0,05). В когорте татар, страдающих СД типа 1 (n=122), в сравнении со здоровыми представителями той же этнической группы (n=237) обнаружено большее количество людей, имеющих генотип *A/*G (48,4% и 37,1% соответственно, P<0,05).

Таким образом, повышенный генетический риск СД типа 1 у русских ассоциирован с генотипом *G/*G полиморфизма LTA252A/G, у татар - с генотипом *A/*G, у башкир ассоциации полиморфизма 252A/G гена. LTA с СД типа 1 отсутствуют.

Для количественной оценки относительного риска развития заболевания для каждого из вышеуказанных генетических маркеров мы вычислили показатель соотношения шансов (odds ratio - OR). Для этого использовали формулу, предложенную Бландом (Bland, J.M. The odds ratio / J.M.Bland, D.G.Altman // Br. Med. J. - 2000. - Vol.320. - P.1468):

OR=(a×d)/(b×c),

где а - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера (аллеля или генотипа) среди больных; c и d - число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых. Повышенный риск развития СД типа 1 констатируют при OR>1.

Приводим пример конкретного расчета. В группе больных СД типа 1 татар идентифицировано 59 человек, имеющих генотип *A/*G, т.е. а=59. У 63 больных СД типа 1 генотип *A/*G не идентифицирован, поэтому b=63. В выборке здоровых татар выявлено 88 лиц с генотипом *A/*G, следовательно, с=88. Среди татар контрольной группы генотип *A/*G не обнаружен у 149 человек, это значит, что d=149. Подставив эти значения в вышеприведенную формулу, получим:

OR=(59×149)/(63×88)=8791/5544=1,59.

Следовательно, у татар, имеющих генотип *A/*G, риск развития СД типа 1 повышен в 1,59 раз по сравнению с лицами, обладающими любым другим генотипом. Вычисленные по результатам исследования показатели OR в дальнейшем используются в ходе медико-генетического консультирования по СД типа 1.

Полученные в нашем исследовании показатели OR при наличии маркерных генотипов по полиморфизму 252A/G гена LTA представлены в таблице.

Пример 1.

К., 23 года, обратилась в центр медико-генетического консультирования для определения наследственной предрасположенности к СД типа 1.

Анамнез: старший брат страдает СД типа 1, получает постоянную заместительную инсулинотерапию по интенсифицированной схеме.

Жалобы: не предъявляет. Жажду, учащенное мочеиспускание, похудание не отмечает.

Соматический статус: без патологии.

Таблица
Генетические маркеры СД типа 1 и показатели соотношения шансов развития заболевания в популяциях Башкортостана Популяция Маркеры СД типа 1 OR Русские Генотип *G/*G полиморфизма 252 A/G гена LTA 2,52 Татары Генотип *A/*G полиморфизма 252 A/G гена LTA 1,56

Лабораторные исследования: гликемия натощак 3,9 ммоль/л, удельный вес мочи 1020, глюкозурия не обнаружена, кетонурия не выявлена.

Клинический диагноз: здорова.

Результаты генотипирования: для выявления генотипа по полиморфизму 252A/G гена LTA гена HLA класса III у консультируемой было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией участков гена LTA, содержащих полиморфизм 252A/G. Амплификацию проводили в реакционной смеси объемом 12,5 мкл, содержащую 50 мМ трис-HCl-буфера, 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP, ДНК-полимеразу и локусспецифичные олигонуклеотидные праймеры. Электрофорез фрагментов ДНК проводили в агарозном геле при постоянном напряжении. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия в течение 10 мин и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. У консультируемой К. изучение аллелей гена LTA позволило выявить наличие генотипа *G/*G. Учитывая этническую принадлежность пациентки (русская), показатель соотношения шансов развития СД типа 1 составил для нее 2,52 (см. таблицу.).

Вывод: учитывая отягощенный семейный анамнез, у наблюдаемой пациентки был проведен генетический анализ на доклиническом уровне СД типа 1, что позволило определить высокий риск развития данного патологического состояния и вовремя принять профилактические меры для предупреждения развития как самого заболевания, так и его острого осложнения (кетоацидоз).

Пример 2.

Пациентка М., 25 лет, больна СД типа 1 в течение 2 лет, состоит на учете у эндокринолога одной из поликлиник г.Уфы. Обратилась к врачу - генетику с просьбой оценить риск развития СД типа 1 у ее трехлетней дочери. Супруг здоров, больных СД типа 1 родственников не имеет.

Результат генотипирования ребенка: для выявления - генотипа гена HLA класса II DQB1 у ребенка было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией полиморфизма 252A/G гена LTA гена HLA класса III. Амплификацию проводили в реакционной смеси объемом 12,5 мкл, содержащую 50 мМ трис-HCl-буфера, 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP, ДНК-полимеразу и локусспецифичные олигонуклеотидные праймеры. Электрофорез фрагментов ДНК проводили в агарозном геле при постоянном напряжении. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия в течение 10 мин и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. У консультируемого ребенка изучение аллелей гена LTA позволило выявить наличие генотипа *A/*G. Учитывая этническую принадлежность обследуемого (татарка), показатель соотношения шансов развития СД типа 1 составил для нее 1,56 (см. таблицу).

Вывод: учитывая повышенный генетический риск СД типа 1 у ребенка, родителям были предложены превентивные мероприятия, включающие исключение из рациона ребенка продуктов с нитрозосодержащими консервантами и красителями, профилактический прием никотинамида (20-25 мг/кг массы тела в сутки).

Катамнез: предложенные превентивные мероприятия осуществляются в течение 1 года. При ежегодном иммунологическом, гормональном и метаболическом мониторинге ребенка данных за раннюю доклиническую фазу СД типа 1 не выявлено.

Таким образом, полученные данные указывают на несомненную связь между полиморфизмом 252A/G гена LTA с генетической предрасположенностью к СД типа 1 у жителей Башкортостана, что дает возможность прогнозировать риск возникновения данного заболевания и проводить превентивную терапию.

Предложенный способ современен и позволяет с высокой степенью достоверности прогнозировать развитие СД типа 1.

Изобретение относится к области медицины, а именно к эндокринологии. Выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, проводят генотипирование по полиморфному локусу 252A/G гена LTA HLA класса III. При выявлении генотипа *A/*G у татар и генотипа *G/*G у русских прогнозируют риск развития СД типа 1 у обследуемого. Способ обеспечивает получение точного, объективного прогноза развития заболевания. 1 табл.

Способ прогнозирования развития сахарного диабета типа 1, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование по полиморфному локусу 252A/G гена LTA HLA класса III методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, при выявлении генотипа *A/*G у татар и генотипа *G/*G у русских прогнозируют риск развития СД типа 1 у обследуемого.