СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2009 года по МПК A61K39/395 A61P31/00 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается способа получения иммуноглобулиновых препаратов, выделяемых экстракцией из осадка Б (III фракции по Кону) солями металлов.

Известен способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата для энтерального применения, включающий экстракцию спиртового осадка Б ((III фракции Кона) хлороформом в концентрации 10% в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия с последующим осаждением фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем в концентрации 12% (RU, патент 2084229 C1, А61К 35/14, 20.07.1997).

Основным недостатком этого изобретения является то, что длительная обработка хлороформом приводит к потерям эффекторных функций иммуноглобулинов, их полимеризации и снижению титра антител в продукте.

Наиболее близким по своей сути к заявляемому является способ получения иммуноглобулинового препарата, в соответствии с которым осадок Б экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия при комнатной температуре и постоянном перемешивании 0,1-3,0% хлороформом, удаляют балластные примеси центрифугированием, обрабатывают фракции иммуноглобулинов сульфатом меди с конечной концентрацией 0,1-2,0% при рН раствора 6-8, раствор центрифугируют и обрабатывают раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в концентрации 0,2-1,0%, диализируют и концентрируют методом ультрафильтрации до концентрации белка 6%, стабилизируют, подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации и высушивают сублимацией (RU, патент 2189833 С2, А61К 39/395, 35/16, 27.09.2002).

Основным недостатком прототипа является использование хлороформа для связывания липидов, что малоэффективно, и больших концентраций сульфата меди для осаждения липопротеидов, что приводит к снижению выхода выделяемых из осадка Б иммуноглобулинов.

В основу заявляемого изобретения положена задача исключения из технологического цикла токсичного реагента, повышения выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей.

Задача решена тем, что удаление балластных примесей осуществляют сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С.

В результате проведенных исследований нами впервые показано, что высокой степени очистки растворов иммуноглобулинов от примесей (балластных белков, липопротеидов, липидов) можно добиться, создав такие условия проведения реакции, когда с реагентом будут взаимодействовать только примеси, находящиеся в растворе. Это реализуется при сочетании следующих факторов: реагент - сульфат меди в концентрации 0,003-0,03%, рН проведения реакции 4,9-5,1 и температура смеси 0-5°С. При таком сочетании факторов сульфат меди реагирует только с примесными белками и липопротеидами, а рН и температура раствора способствуют выделению липидов. Кроме того, рН раствора создает условия попадания примесных белков в изоэлектрическую точку, что приводит к их коагуляции, которая усиливается взаимодействием этих белков с ионами меди.

Таким образом, указанное сочетание факторов обеспечивает высокую степень очистки иммуноглобулинового раствора от примесей, что позволило отказаться от использования токсичного реагента - хлороформа.

Применение сульфата меди в концентрации менее 0,003%, так же как изменение рН и температуры реакции, ведет к ухудшению степени очистки растворов иммуноглобулинов от примесей, а превышение концентрации более 0,03% приводит к снижению выхода иммуноглобулинов из осадка Б.

В результате проведенных исследований впервые показана возможность выделения 50-99% иммуноглобулинов из раствора осадка Б посредством осаждения примесных белков и липидов сульфатом меди без использования токсичного реагента - хлороформа.

Согласно изобретению исключение из технологического цикла токсичного реагента, повышение выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей обеспечивается тем, что удаление балластных примесей осуществляют сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С.

Заявляемый способ получения иммуноглобулинового препарата является новым и в литературе не описан.

Техническим результатом заявляемого изобретения является исключение из технологического цикла токсичного реагента, повышение выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей.

Преимущества предлагаемого способа получения иммуноглобулинового препарата доказаны результатами экспериментальных исследований. Содержание иммуноглобулинов определяли в реакции преципитации и методом радиальной иммунодиффузии по методическим рекомендациям Чернохвостовой Е.В. с соавт., 1984. Содержание балластных примесей определяли на биохимическом анализаторе Cobas Integra 400+ по методикам разработчика, а содержание общих липидов - с помощью «Bio-la-test» Lachema. Гравитационное осаждение примесей осуществляли в центрифугах MLW T24D. Ультафильтрацию - на установке с полыми волокнами или фильтрационной установке Millipore.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих исключение из технологического цикла токсичного реагента, повышение выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей при использовании заявляемого способа.

Пример 1

Осадок Б, содержащий иммуноглобулины в количестве 11,9 мг/мл и примесные белки - 11,7 мг/мл, гомогенизировали в 0,85% растворе натрия хлорида с рН 7,0 в соотношении 1:10. Нерастворимые примеси удаляли методом гравитационного осаждения на центрифугах. Из белкового раствора при рН 5,2-5,3 иммуноглобулиновую фракцию выделяли введением приготовленного ранее раствора сульфата меди при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,03 мг/мл (0,003%). При этом рН суспензии снижался до 4,9-5,1. Суспензию перемешивали в течение 15 мин и удаляли образующийся нерастворимый осадок примесей гравитационным осаждением. В полученный супернатант, представляющий собой иммуноглобулиновую фракцию, при перемешивании вводили 0,1 М натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с рН 6,2 в количестве 10% по объему. Перемешивание осуществляли до прекращения изменения цвета раствора (1-5 мин), что характеризовало полное связывание ЭДТА не прореагировавших с примесями ионов меди. Раствор концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 6% и анализировали. При необходимости подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации и обезвоживанию. Результаты представлены в таблице.

Пример 2

Осадок Б, содержащий иммуноглобулины в количестве 11,9 мг/мл и примесные белки - 11,7 мг/мл, гомогенизировали в 0,85% растворе натрия хлорида с рН 7,0 в соотношении 1:10. Нерастворимые примеси удаляли методом гравитационного осаждения на центрифугах. Из белкового раствора при рН 5,2-5,3 иммуноглобулиновую фракцию выделяли введением приготовленного ранее раствора сульфата меди при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,3 мг/мл (0,03%). При этом рН суспензии снижался до 4,8-5,0. Суспензию перемешивали в течение 15 мин и удаляли образующийся нерастворимый осадок примесей гравитационным осаждением. В полученный супернатант, представляющий собой иммуноглобулиновую фракцию, при перемешивании вводили 0,1 М ЭДТА с рН 6,2 в количестве 10% по объему. Перемешивание осуществляли до прекращения изменения цвета раствора (1-5 мин), что характеризовало полное связывание ЭДТА не прореагировавших с примесями ионов меди. Раствор концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 6% и анализировали. При необходимости подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации и обезвоживанию. Результаты представлены в таблице.

Пример 3

Осадок Б, содержащий иммуноглобулины в количестве 11,9 мг/мл и примесные белки - 11,7 мг/мл, гомогенизировали в 0,85% растворе натрия хлорида с рН 7,0 в соотношении 1:10. Нерастворимые примеси удаляли методом гравитационного осаждения на центрифугах. Из белкового раствора при рН 5,2-5,3 иммуноглобулиновую фракцию выделяли введением приготовленного ранее раствора сульфата меди при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,115 мг/мл (0,0115%). При этом рН суспензии снижался до 4,9-5,0. Суспензию перемешивали в течение 15 мин и удаляли образующийся нерастворимый осадок примесей гравитационным осаждением. В полученный супернатант, представляющий собой иммуноглобулиновую фракцию, при перемешивании вводили 0,1 М ЭДТА с рН 6,2 в количестве 10% по объему. Перемешивание осуществляли до прекращения изменения цвета раствора (1-5 мин), что характеризовало полное связывание ЭДТА не прореагировавших с примесями ионов меди. Раствор концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 6% и анализировали. При необходимости подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации и обезвоживанию. Результаты представлены в таблице.

Таблица Характеристики Значения характеристик для прототипа заявляемого способа при концентрации сульфата меди, % осадок Б препарат осадок Б 0,003 0,0115 0,03 Общий белок, мг/мл 35,4 56,0 23,6 60,0 67,0 56,0 Общие Ig, мг/мл 16,9 54,9 11,9 58,5 65,0 54,0 Содержание IgG, IgA, IgM, % 39;35;26 60;23;17 59,28,13 59,25,16 64;24;12 62;24;14 Примесные белки, мг/мл 18,5 1,1 11,7 1,5 2,0 1,0 Доля примесей, % 52,0 1,8 49,6 1,9 1,7 3,0 Альбумин, мг/мл 17,5 1,0 10,8 1,4 1,8 1,0 Трансферрин, мг/мл 0,1 0,1 0,13 0,1 0,1 0,1 Церулоплазмин, мг/м 0,2 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 Холестерол, мг/мл 1,68 0,7 1,5 0,5 0,5 0,2 Триглицериды, мг/мл 1,3 0,3 1,6 0,3 0,3 0,1 Общие липиды, мг/мл 2,07 1,04 2,90 1,04 0,90 0,5 Выход иммуноглобулинов, % - 15 - 97 64 54

Предлагаемый способ позволяет исключить из технологического цикла токсичный реагент, повысить выход выделяемых иммуноглобулинов и степень очистки препарата от примесей при одинаковой производительности с прототипом.

Изобретение относится к области медицины и касается способа получения иммуноглобулинового препарата. Сущность изобретения включает стадию экстракции осадка Б (III фракции по Кону) физиологическим раствором, удаления балластных примесей сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С и выделения целевого продукта методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений. Преимущество изобретения заключается в исключении из технологического цикла токсичного реагента, повышении выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей. 1 табл.

Способ получения иммуноглобулинового препарата, включающий стадии экстракции осадка Б (III фракции по Кону), удаления балластных примесей, выделения целевого продукта методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений, отличающийся тем, что удаление балластных примесей осуществляют сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С.