Способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения Российский патент 2017 года по МПК A61K39/395 A61P31/00 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается способа получения иммуноглобулиновых препаратов, очищаемых от примесей солями металлов из экстрактов осадка Б (III фракции по Кону).

У человека существует пять классов антител - IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Основную массу из их общего количества составляет IgG - до 70%, в меньших количествах содержится IgA - 10-15% и IgM - 5-10%, наименьшее количество приходится на оставшиеся IgD и IgE - одинаково по 0,2%.

Некоторые функции отдельных классов иммуноглобулинов дублируются, например активация комплемента и усиление фагоцитоза у IgG и IgM, но это дублирование является лишь следствием проявления индивидуальных свойств каждого.

IgA - основной класс антител в секретах (молоке, слюне, слезах, желчи, секретах дыхательных путей, кишечного тракта и влагалища), защищает слизистые оболочки и нейтрализует вирусы и бактериальные токсины.

IgD - единственная известная его функция - роль рецептора для антигена.

IgE - защищает слизистые оболочки, контактирующие с окружающей средой. Молекулы иммуноглобулина прикрепляются к специфическим рецепторам поверхности тучных клеток и базофилов, и если происходит связывание с антигеном, то образуется комплекс, стимулирующий освобождение из клеток медиаторов аллергических реакций.

IgG - единственные антитела, переходящие от матери к плоду через плаценту, иммуноглобулин производится в больших количествах при вторичном иммунном ответе. Помимо активации системы комплемента молекулы IgG связываются с макрофагами и нейтрофилами. Эти фагоцитирующие клетки могут связывать, поглощать и разрушать внедрившиеся микроорганизмы, покрытые IgG-антителами, которые вырабатываются в ответ на инфекцию.

IgM - основной класс антител, выделяемых в кровь на ранних стадиях первичного иммунного ответа. Присоединение антигена к молекуле IgM индуцирует его связывание с системой комплемента и его активацию. Если антиген расположен на поверхности внедрившегося микроорганизма, то в результате активации система комплемента осуществляет биохимическую атаку, приводящую к гибели микроорганизма [1].

Иммуноглобулины IgD и IgE по причине их малого количества очень трудно выделить, и при производстве иммуноглобулиновых препаратов на них, как правило, не обращают внимания. Поэтому основной целью производителей является создание препаратов, содержащих или один IgG (для внутривенного введения) или комплекс IgG, IgA, IgM в разных сочетаниях (для перорального и назального применения).

Как следует из анализа функциональных свойств классов иммуноглобулинов, препараты, предназначенные для лечения слизистых человека, должны содержать в больших количествах IgA и IgM.

IgA - как обеспечивающий защиту слизистых от внедрения патогенных агентов. Если же проникновение инфекционного начала уже произошло, то как блокирующий дальнейшее поступление бактерий или вирусов через «входные ворота инфекции» и нейтрализующий их.

IgM - как пусковой механизм первичного иммунного ответа организма и активатор системы комплемента.

Содержание IgG также необходимо в препарате, но его необязательно должно быть много, так как его недостаток в препарате с лихвой компенсируется вторичным иммунным ответом организма на инфекцию. В данном случае гораздо важнее на начальном этапе инфекционного процесса помочь организму организовать оборону посредством функциональных особенностей IgA и IgM.

В последнее время расширяется область применения иммуноглобулиновых препаратов для лечения инфекционных заболеваний человека. Помимо энтерального применения комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП) в борьбе с острыми кишечными инфекциями предложено использовать его для лечения острых респираторных заболеваний у детей [2, 3]. Применяется КИП также местно в комбинированных препаратах с интерфероном [4].

Известен способ получения иммуноглобулиновых композиций, состоящих из IgG, IgA, IgM, для внутривенного применения, включающий гомогенизацию осадка Б в 0,01 М фосфатном буферном растворе (PBS) с рН 7,6, добавление в него соли ртути (мертиолата) до конечной концентрации 0,1%, отделение осадка иммуноглобулинов с последующей гомогенизацией, обработку протамином и очистку полученного раствора от нерастворимых примесей [5].

Основным недостатком этого изобретения является то, что оно может быть использовано только для получения иммуноглобулинов для тест-систем.

Известен способ получения иммуноглобулинового препарата для перорального применения, в соответствии с которым осадок Б экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия при комнатной температуре и постоянном перемешивании 0,1-3,0% хлороформом, удаляют балластные примеси центрифугированием, обрабатывают фракции иммуноглобулинов сульфатом меди с конечной концентрацией 0,1-2,0% при рН раствора 6-8, раствор центрифугируют и обрабатывают раствором ЭДТА в концентрации 0,2-1,0%, диализируют и концентрируют методом ультрафильтрации до концентрации белка 6%, стабилизируют, подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации и высушивают сублимацией [6].

Однако препарат, полученный по известному способу [6], не предназначен для наружного использования (местного применения на слизистых), в том числе в качестве глазных капель, для назального применения. Использование хлороформа при его получении оказывает токсическое действие на пациента и персонал, снижает биологическую эффективность целевого продукта. Известный способ предполагает повышение концентрации только иммуноглобулина класса М.

В качестве прототипа нами выбран способ получения иммуноглобулинов, обладающих антибактериальной и антивирусной активностью, предназначенных для применения в виде назальных капель [7]. Известное средство создано на основе комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП) с использованием глицерина.

Однако использование фармацевтически приемлемых добавок, в том числе глицерина, сопровождается снижением содержания иммуноглобулинов классов А и М и, соответственно, повышением иммуноглобулина класса G. Снижены также возможности применения препарата на других слизистых, так наличие глицерина не позволяет использовать его в офтальмологии.

Нами поставлена задача разработать способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения, обладающего повышенным содержанием иммуноглобулинов классов А и М и высокой биологической активностью при упрощении технологического процесса стадии удаления балластных примесей.

Технический результат, получаемый при осуществлении изобретения, заключается в:

- повышении клинической эффективности иммуноглобулинового препарата для наружного применения за счет повышения содержания иммуноглобулинов классов А и М, сохранения специфической биологической активности антител препарата путем совершенствования технологии осаждения балластных примесей;

- исключении токсического воздействия на пациента и персонал путем исключения использования при осаждении примесей хлороформа и полиэтиленгликоля.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения включает стадию экстракции осадка Б (III фракция по Кону) раствором хлористого натрия, удаление балластных примесей и выделение целевого продукта методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений. При этом удаление балластных примесей осуществляют путем последовательной обработки экстракта сначала мертиолатом в концентрации 0,1%, а затем сульфатом меди в концентрации 0,005-0,06%) при величине рН 8,0.

Повышенное содержание иммуноглобулинов классов А и М в препарате обеспечивается использованием для выделения примесных белков предлагаемых нами солей металлов.

Нами впервые показано, что сочетание мертиолата с сульфатом меди при рН, равном 8, обеспечивает комплексное повышенное содержание (более 30%) в препарате иммуноглобулинов IgA и IgM, что повышает эффективность местного применения препарата, например на слизистых глаз. Кроме того, такое сочетание исключает необходимость введения в препарат консервантов и стабилизаторов. Близкий к нейтральному рН препарата при использовании 0,85%-ного раствора хлорида натрия исключает необходимость введения дополнительных веществ для обеспечения изотоничности препарата.

Мягкая очистка препарата в предлагаемом способе позволяет сохранить специфическую активность его антител. Используемые соли металлов (предлагаемая последовательность их использования и указанная величина рН) позволяют уменьшить содержание примесных белков и липопротеинов в целевом продукте, произвести его эффективную очистку.

Осуществление способа должным образом раскрыто в примерах.

Преимущества предлагаемого способа получения иммуноглобулинового препарата доказаны в специальной серии экспериментов. Содержание иммуноглобулинов определяли в реакции преципитации и методом радиальной иммунодиффузии по методическим рекомендациям Чернохвостовой Е.В. с соавт., 1984. Количество ионов меди определяли в соответствии с ГФ XI. Определение титра антител против сальмонелл и шигелл осуществляли методом РИГА согласно ФС 422-3347-97, а содержание общих липидов - с помощью «Bio-la-test» Lachema.

Пример 1. Осадок Б растворяли в 0,85%-ном растворе хлорида натрия при соотношении 1:10. Полученный белковый раствор подвергали очистке от нерастворимых примесей и титрованию до рН 8,0. Фракционирование проводили в два этапа. На первом этапе удаляли основное количество примесных белков введением в смесь мертиолата в конечной концентрации 0,1% и центрифугированием. На втором этапе доочищали иммуноглобулиновую фракцию обработкой супернатанта сульфатом меди в конечной концентрации 0,005% в смеси. Отделение иммуноглобулиновой фракции осуществляли гравитационным осаждением. Затем концентрат иммуноглобулинов разводили 0,85%-ным раствором хлорида натрия с добавлением 0,1 М ЭДТА и диализировали.

Концентрация белка в препарате составляла 8%. Содержание иммуноглобулинов: IgG - 40%, IgM - 30%, IgA - 30%. Титр антител к сальмонеллам - 1:1280 и шигеллам - 1:640. Электрофоретическая однородность - 99%.

Пример 2. Осадок Б растворяли в 0,85%-ном растворе хлорида натрия при соотношении 1:10. Полученный белковый раствор подвергали очистке от нерастворимых примесей и титрованию до рН 8,0. Фракционирование проводили в два этапа. На первом этапе удаляли основное количество примесных белков введением в смесь мертиолата в конечной концентрации 0,1% и центрифугированием. На втором этапе доочищали иммуноглобулиновую фракцию обработкой супернатанта сульфатом меди в конечной концентрации 0,03% в смеси. Отделение иммуноглобулиновой фракции осуществляли гравитационным осаждением. Затем концентрат иммуноглобулинов разводили 0,85%-ным раствором хлорида натрия с добавлением 0,1 М ЭДТА и диализировали.

Концентрация белка в препарате составляла 8%. Содержание иммуноглобулинов: IgG - 38%, IgM - 31%, IgA - 31%. Титр антител к сальмонеллам - 1:1280 и шигеллам - 1:640. Электрофоретическая однородность - 99%.

Пример 3. Осадок Б растворяли в 0,85%-ном растворе хлорида натрия при соотношении 1:10. Полученный белковый раствор подвергали очистке от нерастворимых примесей и титрованию до рН 8,0. Фракционирование проводили в два этапа. На первом этапе удаляли основное количество примесных белков введением в смесь мертиолата в конечной концентрации 0,1% и центрифугированием. На втором этапе доочищали иммуноглобулиновую фракцию обработкой супернатанта сульфатом меди в конечной концентрации 0,06% в смеси. Отделение иммуноглобулиновой фракции осуществляли гравитационным осаждением. Затем концентрат иммуноглобулинов разводили 0,85%-ным раствором хлорида натрия с добавлением 0,1 М ЭДТА и диализировали.

Концентрация белка в препарате составляла 8%. Содержание иммуноглобулинов: IgG - 43%, IgM - 32%, IgA - 25%. Титр антител к сальмонеллам - 1:640 и шигеллам - 1:640. Электрофоретическая однородность - 97%.

Предлагаемый способ обеспечивает повышенное содержание в препарате иммуноглобулинов классов А и М, что позволит использовать препарат для местного применения, например в качестве глазных капель или на других слизистых.

Источники информации

1. Молекулярная биология клетки / Б. Албертс, Д. Брей, Дж. Льюис, М. Рэфф, К. Робертс, Дж. Уотсон: В 3-х тт., 2-е изд., перераб. и доп., Т. 3. Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. - 504 с.

2. Соколов А.Л. Некоторые аспекты применения КИП (Комплексного иммунологического препарата) в педиатрии. – М.: МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 2003. - 64 с.

3. Грачева Н.М., Петрова М.С., Аваков А.А., Партин О.С. Иммуноглобулиновые препараты для энтерального применения в практике лечения детей и взрослых / Новые лекарственные препараты - 2003. - Вып. 4. - С. 33-42.

4. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева, В.В. Поспеловой. - М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002. - 608 с.

5. US 5359038 С1.

6. RU 2189833 С2.

7. RU 2453336 С1.

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается способа получения иммуноглобулиновых препаратов, очищаемых от примесей солями металлов из экстрактов осадка Б (III фракции по Кону). Способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения включает стадию экстракции осадка Б (III фракция по Кону) раствором хлористого натрия, удаление балластных примесей и выделение целевого продукта методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений. При этом удаление балластных примесей осуществляют путем последовательной обработки экстракта сначала мертиолатом в концентрации 0,1%, а затем сульфатом меди в концентрации 0,005-0,06% при величине рН 8,0. Технический результат, получаемый при осуществлении изобретения, заключается в повышении клинической эффективности иммуноглобулинового препарата для наружного применения за счет повышения содержания иммуноглобулинов классов А и М, сохранения специфической биологической активности антител препарата путем совершенствования технологии осаждения балластных примесей; исключении токсического воздействия на пациента и персонал путем исключения использования при осаждении примесей хлороформа и полиэтиленгликоля. 3 пр.

Способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения, включающий стадию экстракции осадка Б (III фракция по Кону) раствором хлористого натрия, удаление балластных примесей и выделение целевого продукта методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений, отличающийся тем, что удаление балластных примесей осуществляют путем последовательной обработки экстракта сначала мертиолатом в концентрации 0,1%, а затем сульфатом меди в концентрации 0,005-0,06% при величине pH 8,0.