СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2002 года по МПК A61K39/395 A61K35/16 

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам, содержащим белковые вещества, и может быть использовано при получении комплексного иммуноглобулинового препарата для энтерального применения.

Препараты, содержащие несколько классов иммуноглобулинов, а именно IgA, IgM, IgG - высокоэффективные средства лечения и профилактики различных инфекционных заболеваний, представляющие собой концентраты антител, опсонизирующая, нейтрализующая и комплементсвязывающая активность которых является основным фактором их клинической эффективности.

В настоящее время в мире выпускаются и применяются в клинике иммуноглобулиновые препараты, обогащенные IgM и IgA, для профилактики и лечения тяжелых бактериальных инфекций, сепсиса, иммунодефицитных заболеваний. Такие препараты применяются энтерально, так как энтеральный способ введения имеет ряд преимуществ перед парэнтеральным, а именно простота применения; непосредственная доставка препарата в очаг поражения; возможность увеличения объема вводимого препарата; хорошая переносимость; возможность добавления в пищу. В России таким препаратом является комплексный иммуноглобулиновый препарат, который содержит иммуноглобулины трех основных классов IgA (15-25%), IgM (15-25%), IgG (50-75%)/ФС N 42-3347-97/.

Известен способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата с использованием фосфата кальция и каприловой кислоты с дальнейшей обработкой на DEAE-Sephadex А-50 и бета-пропиолактоном.

Такой способ получения является сложным, многостадийным, требующим специализированного оборудования, а его использование возможно в основном только в лабораторных условиях /US 5.075.425/.

В 1995 г. был запатентован метод получения иммуноглобулинового препарата, содержащего более чем 5% IgM и 10% IgA, с помощью ионообменной хроматографии /US 5.410.025/.

Недостатками данного метода являются: низкое содержание IgM и IgA; высокая трудоемкость; возможность использования метода только в лабораторных условиях.

Существует способ получения иммуноглобулин-обогащенной фракции, содержащей IgG, IgM, IgA с использованием сульфата меди из сыворотки животных. Этот метод позволяет получить только коллоидный раствор, который может быть использован в ветеринарии /US 5.087.695/.

Известен метод получения фракции иммуноглобулинов G, М, А путем непрерывного электрофореза с предварительным спиртовым фракционированием плазмы крови. Он является трудоемким, его проведение возможно только при наличии специального оборудования, а полученный препарат является частично комбинированным /US 4.246.085/.

В литературе имеются сведения о получении фракции, содержащей иммуноглобулины А, М и G спиртовым осаждением сыворотки или плазмы крови с последующей обработкой гидроксидом алюминия /Патент DE 2.404.265/. Недостатком этого способа является то, что при фракционировании большая часть иммуноглобулинов удаляется с балластными примесями, а использование гидроoкиси алюминия требует трудоемкой работы по ее удалению из получаемого препарата. Кроме того, фракционирование этанолом оказывает денатурирующее воздействие на белковый раствор и вызывает дополнительную агрегацию иммуноглобулинов.

Существует метод получения гамма-глобулиновых препаратов с увеличенным содержанием IgA или IgM из осадка Б /III фракция по Кону/. Метод предусматривает обработку ацетатного экстракта осадка Б раствором соли цинка и этанола с последующим двойным осаждением фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем и диализом для удаления солей цинка /US 3.808.189/.

Препараты, полученные указанным способом, не являются комплексными, так как обогащены только IgM или IgA.

Известен способ получения комплексного препарата, содержащего (40-50%) IgG, (15-20%) IgA и (20-25%) IgM (M. Steinbuch, 1973). Препарат получают из осадка Б /III фракция по Кону/ каприлатно-спиртовым фракционированием. Недостатком данного метода является то, что конечный продукт содержит значительную примесь бета-глобулинов, содержание которых превышает 3%, т.е. выше уровня их содержания в обычных препаратах иммуноглобулинов по принятым техническим условиям.

Следует также отметить, что применение этанола оказывает денатурирующее воздействие на белковый раствор и требует специального оборудования, обеспечивающего возможность работы при минусовых температурах.

Наиболее близким к заявленному является способ получения КИП для энтерального применения /RU 2084229/, включающий получение солевого экстракта из осадка Б /III фракции по Кону/ в 0,9%-ном растворе хлорида натрия (в десятикратном объеме), обработку экстракта хлороформом (конечная концентрация 10%) с целью удаления липопротеидов и последующее осаждение фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем (конечная концентрация - 12%). Препарат, полученный по этому способу, содержит (50-75%) IgG, (15-25%) IgA и (15-25%) IgM, в нем обнаружены повышенные титры антител против ряда энтеробактерий и вирусов /ФС N 42-3347-97/.

Однако комплексный иммуноглобулиновый препарат, получаемый по методу, в котором в качестве основного фракционирующего агента используется хлороформ, экономически невыгоден. Длительная обработка хлороформом иммуноглобулиновой фракции неприемлема, так как приводит к потерям эффекторных функций иммуноглобулинов, снижению титра антител и полимеризации. Необходимо также отметить, что использование хлороформа требует специального оборудования, а высокая концентрация хлороформа оказывает токсическое действие на персонал. Поэтому целесообразно уменьшение концентрации и времени обработки иммуноглобулиновой фракции хлороформом, а при возможности и полная замена данного фракционирующего агента.

Задачей изобретения является повышение биологической активности целевого продукта путем увеличения содержания иммуноглобулина класса М, уменьшения примеси липопротеинов, сокращения времени контакта хлороформа и иммуноглобулинов; упрощение технологического процесса за счет уменьшения действующей концентрации токсичного агента - хлороформа и отсутствия процесса осаждения фракции иммуноглобулинов ПЭГом.

Поставленная задача осуществляется путем последовательной обработки экстракта осадка Б /III фракция по Кону/ 0,1-3%-ным хлороформом и сульфатом меди в концентрации от 0,1 до 2% при величине pH 6-8, а выделение целевого продукта осуществляют методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений.

Преимущества предлагаемого способа получения комплексного иммуноглобулинового препарата доказаны в специальной серии экспериментов.

Образцы препарата были проанализированы методами электрофореза, иммуноэлектрофореза. Содержание иммуноглобулинов определяли с помощью реакции преципитации и методом радиальной иммунодиффузии согласно методическим рекомендациям Чернохвостовой Е.В. и соавт., 1984. Количество ионов меди определяли в соответствии с ГФ XI. Определение титра антител против сальмонелл и шигелл осуществляли методом РПГА согласно ФС 422-3347-97. Для определения токсичности препарата использовали 5 белых мышей массой 18-20 г, которым вводили по 0,5 мл раствора препарата внутрижелудочно. Наблюдение за животными вели в течение 5 дней /ФС 42-3347-97/. Содержание общих липидов определяли с помощью "Bio-la-test" Lachema.

Установлено, что активность полученного препарата выше в 2-3 раза по сравнению с прототипом, в нем полностью отсутствуют следы фосгена и полиэтиленгликоля, так как содержание хлороформа снижено при проведении технологического процесса в 5-10 раз и полностью отсутствует полиэтиленгликоль как реагент. Содержание общих липидов в готовом препарате снизилось в 2-3 раза. Введение комплексообразующих соединений, таких как натриeвая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) или тритоном Х-100 позволяет полностью связать и удалить ионы меди, что приводит к повышению стабильности целевого продукта, разрушению возможно присутствующих вирусов.

Комплексный иммуноглобулиновый препарат получают следующим образом. Осадок Б экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия при комнатной температуре с постоянным перемешиванием. После полной экстракции осадка осуществляется осаждение липопротеидов обработкой раствором 0,1-3%-ного хлороформа при перемешивании смеси в течение 5-10 мин. Снижение концентрации хлороформа и уменьшение времени его воздействия позволяет снизить негативные влияния этого агента на иммуноглобулины.

Балластные примеси удаляют методом центрифугирования в режиме 3000-6000 об/мин в течение 15-20 мин. Далее осуществляют обработку фракции иммуноглобулинов сульфатом меди с конечной концентрацией 0,1-2% в смеси, рН которой составляет 6-8.

Раствор центрифугируют и обрабатывают раствором ЭДТА в конечной концентрации (1-0,2)% для предотвращения влияния экстрагирующих агентов на белок и его стабилизации. Диализ для удаления низкомолекулярных примесей и концентрирования до содержания белка 6% осуществляют методом ультрафильтрации на ультрафильтрационной установке. В концентрат добавляют стабилизаторы, такие как глицин, глюкоза, мальтоза, для восстановления молекулярного биэлектрического слоя иммуноглобулинов, который может быть частично разрушен вследствие химического и физического воздействия. Стабилизированный препарат подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации, сублимационной сушке согласно производственному регламенту на комплексный иммуноглобулиновый препарат, сухой для энтерального применения (КИП) (введен 30 мая 1996 г.).

Обоснование выбранных параметров способа
Концентрация хлороформа 0,1-3% выбрана вследствие того, что последовательная обработка экстракта двумя различными осадителями позволяет значительно уменьшить содержание хлороформа в смеси. Диапазон содержания ионов меди в растворе объясняется тем, что при более низкой концентрации сульфата меди в растворе происходит неполное осаждение липопротеидов, при более высокой концентрации - частичная или полная денатурация белка, уменьшение выхода и снижение титра антител.

Анализ качества препарата, проведенный согласно ГФ XI и ФС 42-3347-97 на препарат КИП, доказывает преимущество заявленного способа (см. таблицу).

Анализ полученных препаратов позволяет выявить преимущества заявляемого способа получения КИП. Так, биологическая специфическая активность препарата была выше в 2 раза по сравнению с прототипом; содержание иммуноглобулина класса М увеличено в 2 раза; содержание общих липидов в готовом продукте более чем в 5 раз меньше по сравнению с прототипом.

Пример 1. К 400 г спиртового осадка Б (III фракция по Кону) добавляют 4000 мл раствора хлорида натрия с концентрацией 0,9% при постоянном перемешивании. После растворения объем суспензии составляет 4400 мл, а содержание белка 2,2%.

К суспензии осадка Б добавляют хлороформ до конечной концентрации 1% в суспензии. Смесь перемешивают в течение 10 мин и центрифугируют.

Объем центрифугата I составляет 3600 мл.

Центрифугат I титруют до рН 6-8.

Для более полной очистки иммуноглобулиновой фракции к центрифугату I добавляют сульфат меди до конечной концентрации 0,5% в смеси. Осадок липопротеидов отделяют центрифугированием. Объем центрифугата II составляет 3200 мл.

Для связывания ионов металла в центрифугат II вводят ЭДТА до конечной концентрации в растворе 0,5%. После этого проводят концентрирование иммуноглобулиновой фракции методом ультрафильтрации до содержания белка 6%. К концентрату добавляют стабилизаторы: глицин 1%, глюкозу 2%. Препарат подвергается осветляющей и стерилизующей фильтрации на мембранах фирмы Millipoer с диаметром пор 0,8-0,45-0,22 нм.

Объем полученного препарата составляет 400 мл с концентрацией белка 6,1%.

Соотношение иммуноглобулинов при этом составляет: IgG - 56%, IgM - 27%, IgA - 27%, титр антител к сальмонеллам и шигеллам - 1:1280, электрофоретическая чистота препарата - 99%. Общее содержание липидов - 0,137 г/л.

Пример 2. 800 г спиртового осадка Б (III фракция по Кону) экстрагировали в растворе хлорида натрия с концентрацией 0,9% в соотношении 1:10.

После полной экстракции раствор обрабатывался хлороформом в концентрации 0,1% в течение 10-15 мин.

В суспензии установлен рН 7,5, добавлен сульфат меди 2% при постоянном перемешивании в течение 10 мин, методом центрифугирования выделена иммуноглобулиновая фракция.

Раствор иммуноглобулиновой фракции обработан тритоном Х-100 с конечной концентрацией 0,01% и раствором ЭДТА конечной концентрацией 1% в смеси, а затем очищен от ионов меди с помощью метода ультрафильтрации и сконцентрирован.

Концентрат был стабилизирован мальтозой в конечной концентрации 2%, осветлен, стерилизован и лиофилизирован.

Полученный препарат имел следующие характеристики. Объем полученного препарата составляет 300 мл с концентрацией белка 6,5%.

Соотношение иммуноглобулинов при этом составляет IgG 55,15%, IgM 28,45%, IgA 16,5%, активность против сальмонел и шигелл 1:1280, электрофоретическая чистота препарата 98%. Общее содержание липидов 0,308 г/л.

Пример 3. 400 г спиртового осадка Б (III фракция по Кону) экстрагировали в растворе хлорида натрия с концентрацией 0,9% в соотношении 1:10.

После полной экстракции раствор подвергался обработке хлороформом в концентрации 3% в течение 10-15 мин.

Суспензия отцентрифугирована и разделена на фракции.

К жидкой иммуноглобулиновой фракции добавлен сульфат меди 0,1% при постоянном перемешивании после предварительного титрования рН до 6,5 и методом центрифугирования иммуноглобулиновая фракция очищена от балластных примесей.

Иммуноглобулиновая фракция обработана раствором ЭДТА с конечной концентрацией 1% в смеси, подвергнута ультрафильтрации и концентрированию.

Концентрат стабилизирован глюкозой 2%, осветлен, стерилизован и лиофилизирован.

Полученный препарат имел следующие характеристики.

Объем полученного препарата составляет 350 мл с концентрацией белка 5,8%. Соотношение иммуноглобулинов при этом составляет IgG 52,4%, IgM 30,55%, IgA 18,5%, активность против сальмонелл и шигелл 1:1280, электрофоретическая чистота препарата 97,5%. Общее содержание липидов 0,117 г/л.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

RU (11) 2051054 (13) C1
RU (11) 2110279 (13) C1
RU (11) 2060034 (13) С1
RU (11) 93032577 (13) А
RU (11) 2073525 (13) C1
RU (11) 2084229 (13) C1
RU (11) 94025645 (11) А1
RU (11) 95119174 (13) А
US 3.808.189
US 5.075.425
US 5.410.025
US 5.087.695
US 4.246.085
DE 2.404.265
М.: Государственная фармакопея, Медицина, 1968. Х издание.

Фармакопейная статья на препарат КИП N 42-3347-97.

Производственный регламент на комплексный иммуноглобулиновый препарат, сухой для энтерального применения (КИП) (введен 30 мая 1996 г.).

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам, содержащим белковые вещества, и касается способа получения иммуноглобулинового препарата. Изобретение осуществляется путем последовательной обработки экстракта осадка Б (III фракция по Кону) хлороформом в концентрации от 0,1 до 3% и сульфатом меди в концентрации от 0,1 до 2% при величине рН 6-8, а выделение целевого продукта осуществляют методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений. Преимущество изобретения заключается в повышении биологической активности целевого продукта за счет увеличения содержания иммуноглобулина класса М, уменьшении примеси липопротеидов и упрощении технологического процесса. 1 табл.

Способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата, включающий стадию экстрагирования осадка Б (III фракция по Кону) раствором хлористого натрия, удаление балластных примесей и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что удаление балластных примесей осуществляют путем последовательной обработки экстракта хлороформом в концентрации от 0,1 до 3% и центрифугирования, и последующей обработки иммуноглобулиновой фракции для удаления липопротеидов сульфатом меди в концентрации от 0,1 до 2% при рН 6-8, а выделение целевого продукта осуществляют ультрафильтрацией в присутствии комплексообразующих соединений.