СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6-О-АЛЬФА-D-ГЛЮКОПИРАНОЗИЛ-D-СОРБИТА Российский патент 2008 года по МПК C12P19/12 C12P19/24 C12N9/04 C12N15/53 C07K16/40 C07K1/16 

Изобретение относится к способу ферментативного получения 6-О-α-D-глюкопиранозил-D-сорбита (далее обозначенного 1,6-GPS) из изомальтулозы или сахарозы и средствам для проведения этого способа.

Известны способы получения 1,6-GPS из сахарозы, которые включают в себя ферментативное превращение сахарозы в изомальтулозу и затем химическое гидрирование полученной изомальтулозы до получения обоих стереоизомеров 1,6-GPS и 1-О-α-D-глюкопиранозил-D-маннит (далее обозначенный 1,1-GPM).

Из патента Германии DE 4414185 C1 известна сахарозоизомераза, которая катализирует превращение сахарозы в изомальтулозу.

Schiweck (alimenta 19 (1980), 5-16) описывает ферментативное превращение сахарозы в изомальтулозу и последующее гидрирование изомальтулозы на катализаторах, представляющих собой никель Ренея, с получением Palatinit® (также называемого изомальтом), почти эквимолярной смеси 1,6-GPS и 1,1-GPM. Эта публикация описывает получение изомальтулозы трансглюкозированием сахарозы с использованием Protaminobacter rubrum. Кроме того, описано, как полученная в присутствии катализаторов, представляющих собой никель Ренея, с использованием микроорганизмов изомальтулоза превращается посредством гидрирования в 1,6-GPS и 1,1-GPM и затем может быть обогащена кристаллизацией при упаривании и охлаждении.

Заявка DE 19701439 A1 описывает способ гидрирования изомальтулозы с использованием связанных с носителем никелевых катализаторов, при котором получают смесь 1,6-GPS и 1,1-GPM.

Заявка DE 19705664 A1 описывает способ получения обогащенных 1,6-GPS или 1,1-GPM смесей. В этой заявке раскрыт способ, при котором получают обогащенные 1,6-GPS и/или 1,1-GPM смеси из гидрированной изомальтулозы или из смесей, содержащих гидрированную изомальтулозу. С использованием этого способа можно получить чистый 1,6-GPS, концентрируя маточный щелок, обогащенный 1,6-GPS, при определенных условиях с последующей кристаллизацией охлаждением.

Заявка DE 19523008 A1 описывает способ получения 1,1-GPM и 1,6-GPS. Этот документ описывает, как при давлении ниже 50 атм использовать различные катализаторы таким образом, чтобы получить посредством гидрирования изомальтулозы смеси из 1,6-GPS и 1,1-GPM. Описанные катализаторы, на которых превращают изомальтулозу, содержат рутений, никель и их смеси.

Из Европейского патента ЕР 0625578 В1 известны способы получения 1,1-GPM- и 1,6-GPS-содержащих смесей сахароспиртов посредством ферментативной перегруппировки сахарозы в изомальтулозу и трегалулозу, а также последующего гидрирования до 1,1-GPM, 1,6-GPS и 1-O-α-глюкопиранозил-D-сорбита (1,1-GPS).

Способы известного уровня техники считаются невыгодными прежде всего по двум причинам. Во-первых, при помощи существовавших до сих пор способов можно получать только смеси из 1,6-GPS и 1,1-GPM, из которых затем посредством дорогостоящих химических и физических способов разделения можно выделить представляющее интерес вещество (1,6-GPS или 1,1-GPM). Во-вторых, невозможно проводить весь способ превращения сахарозы до желаемых продуктов в виде одной стадии способа. Таким образом, в известном уровне техники применяют очень сложные процессы для получения 1,6-GPS из сахарозы, причем приходится использовать различные физические, химические и биологические стадии процесса в различных реакторах. Для гидрирования изомальтулозы, согласно уровню техники, необходимы специальные реакторы гидрирования и технический водород. Существенный недостаток известного гидрирования изомальтулозы до 1,6-GPS и 1,1-GPM состоит, следовательно, в требующихся технических затратах. Часто для гидрирования требуется давление приблизительно от 50 до более 100 атм, что требует специальной аппаратуры. Поскольку полученные продукты, как правило, используются в пищевой промышленности, ход процесса должен быть, кроме того, выбран таким образом, чтобы никакой токсичный материал, например, катализаторы, не попадали в конечные продукты реакции гидрирования. Образующийся продукт является смесью основных компонентов 1,6-GPS и 1,1-GPM, из которой целевой продукт должен быть отделен при помощи химических и химико-физических способов очистки. Таким образом, для получения химически чистого 1,6-GPS или 1,1-GPM требуются после проведенного гидрирования дорогостоящие стадии обогащения и выделения. Выход на этих стадиях часто является неудовлетворительным.

Задача данного изобретения состоит в том, чтобы обеспечить способ и средства для его проведения, которые обеспечивают простое, экономически эффективное и селективное получение 1,6-GPS из изомальтулозы.

Согласно изобретению задача решается способом ферментативного получения 1,6-GPS из изомальтулозы, при котором изомальтулозу подают в водный реакционный раствор, содержащий единицу, имеющую сорбитолдегидрогеназную (SDH)-активность, инкубируют и извлекают 1,6-GPS из реакционного раствора. Таким образом, данное изобретение позволяет гидрировать изомальтулозу биохимически или ферментативно до 1,6-GPS с использованием имеющей SDH-активность единицы. Имеющая SDH-активность единица восстанавливает изомальтулозу специфически до 1,6-GPS. Имеющая SDH-активность единица отличается тем, что она способна превращать изомальтулозу или содержащие ее смеси ферментативно до 1,6-GPS или содержащих 1,6-GPS смесей. Преимущество ферментативного превращения изомальтулозы до 1,6-GPS заключается, наряду с простотой способа получения, в высокой реакционной, субстратной и стереоспецифичности, в однородности продукта реакции, в экономии энергии и сырья и в его экологической безопасности.

Таким образом, данным изобретением неожиданно показано, что посредством специфического ферментативного способа из изомальтулозы можно целенаправленно получать 1,6-GPS. В соответствии с данным изобретением в водный реакционный раствор, который содержит имеющую сорбитол-дегидрогеназную (SDH)-активность единицу, подают выделенную изомальтулозу и инкубируют до тех пор, пока не образуется 1,6-GPS и пока он не сможет быть извлечен из реакционного раствора с использованием обычных способов, например, кристаллизации.

Согласно изобретению, под водным реакционным раствором подразумевается незабуференная или забуференная обычными буферными системами вода, в которой в зависимости от исходных или целевых условий содержатся дополнительно добавки, такие как стабилизаторы, индикаторные системы, восстановительные эквиваленты, регенерирующие средства, компоненты питательной среды, соли, сахара, сахароспирты и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения имеющей SDH-активность единицей является фермент сорбитолдегидрогеназа (SDH). Таким образом, для ферментативного превращения изомальтулозы в 1,6-GPS согласно изобретению единица с SDH-активностью, следовательно, фермент SDH может добавляться в очищенном, обогащенном и/или выделенном виде в реакционный раствор, причем этот фермент может быть, например, ферментом природного происхождения. Само собой разумеется, применяемый в соответствии с данным изобретением фермент SDH может быть согласно изобретению также рекомбинантно полученным ферментом SDH из модифицированного генной инженерией организма. Предпочтительно, применять выделенную SDH, если должны проводиться исследования кинетики превращения изомальтулозы до 1,6-GPS с целью оптимизации этой реакции. В частности, все вопросы, связанные с химическим равновесием реакции превращения изомальтулозы до 1,6-GPS, требуют выделения ферментов, так как в противном случае нельзя достаточно точно анализировать стехиометрию, константы диссоциации, ингибирование или активацию фермента, проблемы кооперативности, начальной скорости, конформации, лигандов и всех других проблем кинетики фермента и представляющих интерес данных по связыванию. Прежде всего, чтобы направленно влиять на реакцию, предпочтительно, чтобы имеющая SDH-активность единица находилась в выделенной форме, так как в противном случае не может быть исключено, что в результате взаимодействия с другими компонентами реакционного раствора результаты модификаций показателя рН, концентрации ионов и температуры являются невоспроизводимыми, так как очищенные, частично очищенные и связанные с клетками ферменты обнаруживают при аналитических исследованиях расходящиеся показатели.

Таким образом, данное изобретение относится к способу частичного или полного выделения SDH из микроорганизмов, в частности, микроорганизмов рода Gluconobacter, особенно предпочтительно вида Gluconobacter suboxidans, при котором на первой стадии микроорганизмы разрушают обычными способами и гомогенизируют до неочищенного экстракта, на второй стадии имеет место разделение неочищенного экстракта при помощи анионообменной хроматографии, на третьей стадии при помощи гель-фильтрации и на четвертой стадии при помощи аффинной хроматографии с красителем. Предпочтительно, согласно изобретению предусматривается, что полученный при помощи аффинной хроматографии с красителем частично очищенный фермент при помощи хроматофокусирования или в другой предпочтительной форме очищают дополнительной аффинной хроматографией с красителем с последующей аффинной элюцией по меньшей мере одним восстановительным эквивалентом до гомогенности.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к способу выделения SDH из микроорганизма, при котором этот микроорганизм на первой стадии способа выделяют и гомогенизируют до неочищенного экстракта, на второй стадии способа полученный неочищенный экстракт подвергают анионообменной хроматографии, на третьей стадии способа первой аффинной хроматографии с красителем-лигандом и на четвертой стадии способа второй аффинной хроматографии с красителем-лигандом. В одном еще более предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к вышеописанному способу, в котором после первой и до второй аффинной хроматографии с красителем-лигандом проводят ультрафильтрацию. В особенно предпочтительном варианте осуществления сразу же после вышеописанного способа, следовательно, после второй аффинной хроматографии с красителем-лигандом, проводят аффинную элюцию чистой SDH, причем для этого используют восстановительный эквивалент, в частности, NADH.

В следующем предпочтительном варианте осуществления имеющей SDH-активность единицей является SDH-содержащий инактивированный или живой микроорганизм или его неочищенный экстракт или гомогенат. Предпочтительно согласно изобретению превращение с инактивированными, особенно предпочтительно высушенными микроорганизмами происходит предпочтительно после повторной гидратации их в присутствии раствора SDH-фермента в соответствии со стандартными способами, например, с применением таннина и/или глутарового альдегида, и является предпочтительным, так как растворимый фермент в более высокой концентрации прочно окружает микроорганизм. Само собой разумеется, повторная гидратация может проводиться также водой или можно совершенно избежать повторной гидратации так, что инактивированные организмы вносят непосредственно в водный реакционный раствор. Согласно изобретению превращение изомальтулозы жизнеспособными микроорганизмами имеет, среди прочего, преимущество, заключающееся в том, что оно связано с относительно низкими расходами.

Биореакторы, в которых используют микроорганизмы, как правило, являются обычно применяемыми реакторами и требуют, в сравнении с химически-катализируемыми превращениями изомальтулозы в 1,6-GPS более низких расходов энергии и расходов на техническое обслуживание. Само собой разумеется, условия реакции (показатель рН, концентрация ионов, потребность в кислороде/диоксиде углерода, микроэлементы, температуры и т.п.) должны быть выбраны таким образом, чтобы микроорганизмы были способны к оптимальному превращению изомальтулозы в 1,6-GPS. При этих условиях SDH в естественной микросреде, следовательно, внутри клетки, может проявлять более высокую стабильность и эффективность, чем выделенный фермент. Кроме того, при подходящих условиях возможно размножение клеток и, следовательно, повышение концентрации SDH. В противоположность существующему уровню техники, согласно которому нужно использовать дорогостоящие катализаторы и технический водород, ферментативное превращение с использованием микроорганизмов имеет, следовательно, существенное преимущество, касающееся надежности, автоматизации и простоты, а также качества и выхода конечного продукта способа.

Согласно изобретению, предпочтительная форма выполнения изобретения предусматривает отделение или определенных клеточных компартментов или их частей друг от друга или их объединение друг с другом. Углеводные структуры, липиды или белки и/или пептиды, а также нуклеиновые кислоты, которые способны влиять на имеющую SDH-активность единицу или на фермент, могут таким образом объединяться или отделяться. Для целенаправленного исключения этого влияния или его использования, микроорганизмы выделяют из неочищенных экстрактов. Это может осуществляться посредством обработки ультразвуком, выдавливанием, гомогенизацией, смешиванием со стеклянными гранулами, посредством детергентов, с использованием электрических полей, механической обработки в жидком азоте или посредством ферментативного переваривания клеточных мембран и стенок. На следующей стадии в предпочтительной форме выполнения полученный экстракт можно центрифугировать для проведения превращения согласно изобретению с использованием супернатанта или осадка. Получение неочищенного экстракта имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что посредством простого измерения экстинкции (оптической плотности) можно определять соотношение нуклеиновых кислот и фермента. При определенных условиях может быть необходимым отделение нуклеиновых кислот, так как нуклеиновые кислоты могут вступать в комплексы с имеющей SDH-активность единицей и таким образом снижать эффективность превращения изомальтулозы в 1,6-GPS. Получение неочищенного экстракта согласно изобретению включает в себя также все приемы способа, которые стабилизируют неочищенный экстракт или оптимизируют его каталитическое действие. К этим приемам могут относиться добавление протаминсульфата, хлорида марганца и лизоцима, а также изменение ионной силы и все меры, для модифицирования протеазной активности неочищенного экстракта данного изобретения таким образом, что имеющая SDH-активность единица стабилизируется и оптимизируется в своем действии.

В следующем предпочтительном варианте осуществления SDH-содержащий микроорганизм или организм, из которого происходит полностью или частично очищенная SDH, является организмом рода Gluconobacter, в частности, Gluconobacter suboxidans, особенно предпочтительно Gluconobacter suboxidans DSM 2003. В частности, в особенно предпочтительной комбинации данного изобретения с регенерирующей системой с коферментом SDH/FDH (формиатдегидрогеназа) можно достичь с указанными штаммами очень хорошего выхода 1,6-GPS. Однако, это ферментативное превращение микроорганизмами отнюдь не ограничивается этими обоими штаммами. Все организмы, в частности, микроорганизмы, которые в состоянии превращать изомальтулозу в 1,6-GPS, могут применяться в соответствии с данным изобретением, например, также грибы, дрожжи, клеточные культуры и т.д. К ним могут быть причислены мутанты, измененные генной инженерией модификации вышеуказанных организмов, например, организмы, которые в результате введения SDH-кодирующей нуклеотидной последовательности обнаруживают SDH-активность. Предпочтительными являются организмы, которые обнаруживают также сахарозомутазную активность, так что с использованием одного единственного типа организма сахароза может превращаться в 1,6-GPS.

В следующем предпочтительном варианте осуществления имеющие SDH-активность единицы, в частности, микроорганизмы, неочищенные экстракты, их части и/или обогащенные или выделенные ферменты, являются иммобилизованными. Посредством иммобилизации ферменты, клеточные органеллы и клетки переводятся в нерастворимое и пространственно ограниченное в отношении реакции состояние. Согласно изобретению имеющую SDH-активность единицу данного изобретения иммобилизуют в условиях, в которых она по возможности обнаруживает высокие ферментативные активности SDH. В соответствии с данным изобретением предусматривается также включение жизнеспособных клеток в полимеры. Иммобилизацию можно проводить (i) связыванием, а также (ii) включением. При иммобилизации посредством связывания имеющей SDH-активность единицы имеет место связывание с носителем (ионное или ковалентное) и образование поперечных связей (сшивка друг с другом или сшивка с другими полимерами). При иммобилизации посредством включения имеющей SDH-активность единицы предусматривается включение в гель-структуры (глобулы, волокна и т.п.) и в мембраны (микрокапсулы и мембранные реакторы). Таким образом, под иммобилизацией подразумевают все способы, которые служат для ограничения подвижности и растворения имеющей SDH-активность единицы биологическим, химическим или физическим путем. Это, в частности, может происходить посредством адсорбции на инертных или электрически заряженных, неорганических или органических носителях, причем неорганическими материалами являются, например, пористые стекла, силикагель, оксид алюминия и гидроксиапатит или оксиды металлов; природными полимерами могут быть, например, целлюлоза, крахмал, декстран или агароза, а синтетическими полимерами могут быть полиакриламид, поливиниловый спирт, найлон или другие. Данным изобретением предусматривается также включение имеющей SDH-активность единицы в трехмерную сетчатую структуру; в одном варианте изобретения это может быть желатин или агар. Далее, можно предусмотреть иммобилизацию посредством поперечного сшивания с бифункциональными агентами, такими как глутаровый альдегид или бензидин. Возможно также микроинкапсулирование имеющей SDH-активность единицы, которое приводит к локализации пространства реакции при помощи искусственных или биологических мембран. Данное изобретение включает в себя также иммобилизацию без носителей посредством флокуляции и «сшивки», а также одновременную иммобилизацию живых и/или инактивированных клеток со свободными или иммобилизованными ферментами. Увеличение молекулярной массы, например, связыванием с декстраном, согласно изобретению также служит иммобилизации. В случае иммобилизованного фермента речь может идти о ферменте, который связан в компартменте микроорганизма или в полученном в полном виде жизнеспособном или высушенном микроорганизме, но согласно изобретению термин «иммобилизованный» может также обозначать, что фермент один или фермент в соединении с компартментами организма связан с носителем. Важно то, что загруженный матрикс может приходить в соприкосновение с изомальтулозой таким образом, что протекает желаемая ферментативная реакция до 1,6-GPS. Однако, само собой разумеется, что данное изобретение относится также к указанной имеющей SDH-активность единице в свободной, т.е. в неиммобилизованной форме.

В следующем предпочтительном варианте осуществления ферментативное превращение в соответствии с данным изобретением проводят с регулированием рН или без регулирования рН. В частности, поскольку в особенно предпочтительном варианте осуществления используют восстановительные эквиваленты в форме переносчиков водорода, выбор рН влияет на равновесие химической реакции, а также на общий выход 1,6-GPS. Таким образом, ферментативное превращение изомальтулозы в 1,6-GPS может подразделяться на реакции, при которых не происходит регулирования значения рН, и реакции, при которых регулируется значение рН. Регулирование рН может происходить добавлением или удалением веществ, которые способны повышать, понижать или стабилизировать показатель рН. Согласно изобретению, могут использоваться кислоты или основания согласно определению Lowry-Brönsted или Lewis-Pearson, при этом протоны, ионы гидроксония, гидроксидные ионы или свободные пары электронов могут отщепляться и тем самым поступать в среду или присоединяться. Например, можно предусмотреть газацию водного реакционного раствора CO₂, которое в виде введения кислоты является мерой регулирования показателя рН. Предпочтительно, можно стремиться к тому, чтобы показатель рН был установлен в диапазоне, который считается оптимальным для активности фермента. Этот оптимум рН может быть установлен с использованием различных буферов или добавлением понижающих или повышающих показатель рН веществ. Однако, в целом регулирование показателя рН отнюдь не ограничивается химическими способами, такими как, например, процессы комплексообразования, титрования или т.п. Любое вмешательство в систему, которое приводит к тому, что показатель рН каким-либо образом регулируется или стабилизируется, относится согласно изобретению к регулированию показателя рН. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения показатель рН водного реакционного раствора составляет, например, 6,0-8,0, предпочтительно рН 7,0.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения к водному реакционному раствору, наряду с имеющей SDH-активность единицей, добавляют также восстановительные эквиваленты, в частности, в том случае, если применяют очищенную или выделенную сорбитолдегидрогеназу (SDH). Восстановительными эквивалентами согласно изобретению являются переносчики водорода или носители электрона, которые могут существовать в форме коферментов или простетических групп. Такими восстановительными эквивалентами могут быть, например, NAD⁺/NADH, NAPD⁺/NADPH, FMN/FMNH₂ или FAD/FADH₂. Коферменты и простетические группы окислительно-восстановительных реакций служат в качестве диссоциируемых и/или прочно связанных с белками переносчиков водорода и/или переносчиков электрона. Однако в качестве восстановительных эквивалентов могут также служить другие коферменты/простетические группы, которые способны переносить атомы водорода или электроны. Согласно изобретению, предпочтительными являются, в частности, циклические тетрапирролы, глутатион, липоевая кислота, хиноны, железо-серусодержащие белки, флавопротеины, флавиннуклеотиды и другие, которые во время ферментативного катализа могут переносить протоны, атомы и/или электроны или функциональные группы.

Предпочтительно, для ферментативного получения 1,6-GPS используют живые имеющие SDH-активность клетки, так что добавление восстановительных эквивалентов является излишним.

В следующем особенно предпочтительном варианте осуществления ферментативное превращение изомальтулозы в 1,6-GPS происходит в присутствии регенерирующих агентов, таких как формиатдегидрогеназа (FDH) и/или формиат, в частности, в том случае, если применяют очищенную или выделенную сорбитолдегидрогеназу (SDH). Посредством добавления SDH и FDH в водный реакционный раствор возможна химическая реакция, во время которой формиат все время превращается в CO₂, а изомальтулоза в 1,6-GPS. Превращение формиата в СО₂ происходит через FDH. Поглощаемые при этом окислении атомы водорода от присутствующего в реакционном растворе восстановителя, например, NAD⁺, используются при параллельно протекаемом восстановлении изомальтулозы в 1,6-GPS. Само собой разумеется, могут рассматриваться вместо FDH также совершенно другие дегидрогеназы или ферменты с другими субстратными специфичностями в качестве кофермента этой регенерирующей системы, следовательно, в качестве регенерирующих агентов. Например, другие карбоновые кислоты или их соли применимы в качестве регенерирующих агентов. Важно, чтобы добавляемые вещества, в частности, FDH/формиат, могли реагировать с переносчиками водорода, коферментами или простетическими группами с тем, чтобы электроны и/или атомы водорода переносились так, чтобы возможным было непрерывное образование 1,6-GPS. В случае применения живых клеток в качестве имеющей SDH-активность единицы можно опустить добавление регенерирующего агента и восстановительных эквивалентов.

В следующем особенно предпочтительном варианте осуществления происходт превращение изомальтулозы в 1,6-GPS в виде непрерывного способа. Непрерывный способ данного изобретения проводится в проточном реакторе, в котором имеет место микробный рост и, следовательно, образование продукта, синтез 1,6-GPS. Таким образом могут быть получены очень большие количества 1,6-GPS. Посредством применения непрерывного способа циклы очистки и подготовки выбираются свободно и не устанавливаются заранее параметрами конкретных ферментеров или определенными физиологическими свойствами микроорганизмов, так как в системах непрерывного действия окружающая микроорганизмы среда не изменяется потребляемым субстратом и возникающими продуктами, потому что эти продукты постоянно отводятся, а субстраты постоянно добавляются. Кроме того, биореакторы или установки в непрерывном способе могут быть выполнены конструктивно гораздо меньшими и не требующими больших затрат. Под непрерывным способом согласно изобретению понимают также все дополнительные меры, которые служат для уменьшения опасности инфекции другими организмами, которые могут быстро распространяться в системе через затвор введения субстрата. Они могут включать в себя стерильные, а также нестерильные условия. Данное изобретение относится также к мероприятиям и средствам способа, которые обеспечивают непрерывную ферментацию посредством экстремальных условий таким образом, чтобы она была стабильной против возможных инфекций благодаря выбранным экстремальным условиям (например, забуферивание при очень низком рН или применение антибиотиков). При этом могут применяться вариации или модификации вышеуказанных имеющих SDH-активность единиц, которые приспособлены к этим направленным против инфекции условиям, например, устойчивых к антибиотикам микроорганизмов. Однако, под непрерывным способом согласно изобретению может подразумеваться также любая система растущих клеток и катализирующих ферментов, к которой, с одной стороны, подается питательный раствор, а, с другой стороны, культуральный раствор, в том числе ферментативно образованный 1,6-GPS, отводятся; при этом речь может идти о гомогенных, а также негомогенных системах.

Данное изобретение относится, само собой разумеется, также к полунепрерывному или периодическому режимам способа.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изомальтулозу, которая является исходным веществом для реакции превращения до 1,6-GPS, получают ферментативным превращением сахарозы. Применяемая в способе данного изобретения изомальтулоза может быть получена ферментативным превращением (трансгликозированием) с использованием очищенных или обогащенных ферментов, исходных экстрактов или микроорганизмов из сахарозы, которые обнаруживают сахарозомутазную активность. Под сахарозомутазой согласно изобретению имеют в виду фермент, который способен к изомеризации сахарозы до изомальтулозы и также известен как сахарозоизомераза.

Примерами клеток, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие белок с сахарозомутазной активностью, являются, в частности, микроорганизмы родов Protaminobacter, Erwinia, Serratia, Leuconostoc, Pseudomonas, Agrobacterium, Klebsiella и Enterobacter. Конкретными примерами таких микроорганизмов являются Protaminobacter rubrum (CBS 547.77), Erwinia rhapontici (NCPPB 1578), Serratia plymuthica (ATCC 15928), Serratia marcescens (NCIB 8285), Leuconostoc mesenteroides NRRL B-521f (ATCC 10830a), Pseudomonas mesoacidophila MX-45 (FERM 11808 или FERM BP 3619), Agrobacterium radiobacter MX-232 (FERM 12397 или FERM BP 3620), Klebsiella subspecies и Enterobacter species.

Конкретные примеры белков с сахарозомутазной активностью и кодирующих их нуклеиновых кислот из Р. rubrum, E. rhapontici, Enterobacter spec. SZ62 и Р. mesoacidophila описаны в РСТ/ЕР 95/00165.

Описанные клетки или белки или нуклеотидные последовательности из этих клеток могут применяться вместе с имеющей SDH-активность единицей данного изобретения для получения 1,6-GPS из сахарозы, например, посредством введения SDH-кодирующих нуклеотидных последовательностей под контролем регуляторных элементов в вышеуказанные клетки и их экспрессии.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления ферментативное превращение сахарозы в изомальтулозу проводят предпочтительно с использованием иммобилизованных клеток Р. rubrum (Protaminobacter rubrum) или продукта расщепления клеток или неочищенного экстракта Р. rubrum или полностью очищенной сахарозомутазы. Это превращение происходит в реакционном растворе предпочтительно вместе с SDH-зависимым превращением изомальтулозы до 1,6-GPS.

Ферментативная перегруппировка сахарозы в изомальтулозу описана, например, в заявке Германии DE 19523560 A1 или патенте Германии DE 4414185 С1, которые в отношении описанных там микроорганизмов, последовательностей ДНК, ферментов и способа получения изомальтулозы ферментативным превращением из сахарозы полностью включены в объем данной заявки.

Иммобилизация имеющих сахарозомутазу клеток, например, Р. rubrum, из продуктов расщепления клеток микроорганизма или выделенного фермента (сахарозомутазы) служит для ограничения подвижности и растворимости используемых биокатализаторов биологическим, химическим и/или физическим путем. Иммобилизация в соответствии с изобретением может проводиться различными способами, такими как, например, связывание биокатализаторов друг с другом или с носителями, фиксированием в сетчатой структуре полимерного матрикса или окружением искусственными или природными мембранами, что, разумеется, включает в себя применение инверсных мицелл. Посредством иммобилизации клеток, продуктов разрушения клеток или/и сахарозомутазы полученные таким образом биокатализаторы становятся не только пригодными для повторного использования, но прежде всего они могут после или во время этого процесса легко отделяться для замены их в случае необходимости другими катализаторами, которые катализируют другие реакции, такие как превращение изомальтулозы в 1,6-GPS. Существенным преимуществом является то, что клетки или ферменты посредством иммобилизации могут использоваться в значительно более высоких локальных концентрациях и прежде всего в непрерывных проточных системах. Иммобилизация может при этом происходить на керамических носителях, на полимерах, на различных гелях и желатине, посредством включения в полиакриламид или другими способами.

В следующем предпочтительном варианте осуществления происходит превращение сахарозы в изомальтулозу и изомальтулозы в 1,6-GPS в одной единственной стадии, то есть обе ферментативные реакции превращения протекают одновременно, в случае необходимости, слегка смещенные во времени в одном и том же водном реакционном растворе. Превращение сахарозы в 1,6-GPS может поэтому происходить на одной стадии способа, так как обе отдельные реакции превращения могут протекать ферментативно при одинаковых или сходных условиях способа.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления превращение сахарозы в 1,6-GPS происходит в одном единственном биореакторе (так называемая "реакция в одном сосуде").

Эти формы выполнения изобретения включают в себя прямое ферментативное получение 1,6-GPS из сахарозы, при котором как для превращения сахарозы в изомальтулозу, так и для превращения изомальтулозы в 1,6-GPS могут использоваться указанные выше неиммобилизованные и иммобилизованные клетки, неочищенные экстракты и/или ферменты, которые обнаруживают в каждом отдельном случае сорбитолдегидрогеназную (SDH) и сахарозомутазную активности.

Согласно изобретению превращение возможно также путем периодической ферментации и/или периодической ферментации с подачей питательной среды (прерываемой ферментации), при которой питательную среду подают в определенный момент времени и ферментацию заканчивают после потребления лимитирующего субстрата, которым могут быть, например, сахароза, другие субстраты или ферменты/коферменты, или в другой подходящий момент времени. Однако, условия реакции могут быть выбраны таким образом, что лимитирующее влияние субстрата в значительной степени будет исключено. Периодические реакции могут проводиться в так называемой закрытой системе. Эти системы, согласно данному изобретению, понимают как закрытые системы, если к закрытой жидкой фазе непрерывно подается кислород, воздух или другой газ или смесь газов. В периодическом способе окружение клеток постоянно изменяется, так как может происходить уменьшение субстрата и, среди прочего, увеличение 1,6-GPS и при некоторых обстоятельствах также увеличение концентрации клеток. Вышеуказанный "способ в одном сосуде" может проводиться согласно данному изобретению также при сохранении равновесного потока - при постоянном отводе 1,6-GPS в виде непрерывного ферментативного катализа.

В следующем предпочтительном варианте осуществления температура водного реакционного раствора при ферментативном превращении составляет 20°С-40°С, в частности, 25°С. При температуре 25°С очищенная SDH обнаруживает стабильность приблизительно в течение одной недели. Таким образом, температура в этом диапазоне являются пригодной для проведения долгосрочного катализируемого ферментом способа.

В следующем предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к получению 1,6-GPS из сахарозы, при котором сахароза сначала ферментативно превращается в изомальтулозу и после этого изомальтулоза ферментативно превращается в 1,6-GPS. Этот общий процесс может протекать непрерывно, полунепрерывно или прерываемо, в виде одной или в виде нескольких стадий способа и в одном или нескольких биореакторах.

Данное изобретение относится также к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент с активностью сорбитолдегидрогеназы (SDH), выбранной из группы, состоящей из

a) молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, имеющий представленную в SEQ ID NO: 1 аминокислотную последовательность или комплементарную ей цепь;

b) молекул нуклеиновых кислот, которые включают представленную в SEQ ID NO: 2 нуклеотидную последовательность или комплементарную ей цепь;

c) молекул нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с указанной в а) или в b) молекулой нуклеиновой кислоты;

d) молекул нуклеиновых кислот, нуклеотидная последовательность которых вследствие вырожденности генетического кода отличается от последовательности указанных в b) или с) молекул нуклеиновых кислот.

Согласно изобретению под ферментом с сорбитолдегидрогеназной активностью понимают белок или пептид, который способен катализировать превращение изомальтулозы в 1,6-GPS. При этом превращаемая изомальтулоза может образовываться из ферментативного превращения сахарозы.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению могут быть выделены из природных источников, преимущественно из Gluconobacter spec., или они могут быть синтезированы известными способами. При помощи общепринятых способов можно ввести разнообразные мутации в молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения, благодаря чему возможен синтез ферментов с возможно измененными биологическими свойствами, которые также включены в данное изобретение. Мутации согласно изобретению относятся также ко всем делеционным мутациям, которые приводят к образованию укороченных ферментов. Посредством других молекулярных механизмов, таких как инсерции, удвоения, транспозиции, генные слияния, обмен нуклеотидами, а также перенос генов между различными штаммами микроорганизмов и другие, можно, например, получить модификации ферментативной активности и/или регуляцию фермента. Таким путем могут быть получены, например, мутантные ферменты, которые имеют измененный показатель К_m, K_i или К_а и/или обычно уже не подчиняются или подчиняются в измененной форме обычно существующим в клетках регуляторным механизмам. Далее, могут быть получены согласно изобретению мутантные ферменты, которые имеют измененные стабильность, субстратную специфичность, специфичность продукта или измененный спектр эффекторов или модифицированный профиль активности, температуры, показателя рН и/или концентрации. Кроме того, изобретение относится к ферментам, которые имеют измененную активную концентрацию ферментов, модифицированную структуру субъединиц, пред- или посттрансляционные модификации, например, сигнальных и/или транспортных пептидов и/или других функциональных групп.

Данное изобретение относится также к молекулам нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с описанными выше молекулами нуклеиновых кислот. Гибридизация означает согласно изобретению гибридизацию в общепринятых условиях гибридизации, таких как описанные в Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausgabe. 1989), предпочтительно в строгих условиях. Согласно изобретению, о гибридизаци говорят, если после промывания в течение одного часа 1×SSC и 0,1% ДСН при 55°С, предпочтительно при 62°С и особенно предпочтительно при 68°С, в частности, в течение 1 часа в 0,2×SSC и 0,1% ДСН при 55°С, предпочтительно при 62°С и особенно предпочтительно при 68°С, еще наблюдают положительный сигнал гибридизации. Гибридизующаяся при подобных условиях промывки с одной из приведенных в протоколах последовательностей нуклеотидная последовательность является нуклеотидной последовательностью данного изобретения.

Идентификация и выделение подобных молекул нуклеиновых кислот может происходить при этом с применением молекул нуклеиновых кислот данного изобретения или частей этих молекул или комплементарной цепи. В качестве гибридизационного зонда могут применяться, например, молекулы нуклеиновых кислот, которые точно или по существу имеют представленную в SEQ ID NO: 2 нуклеотидную последовательность или части этой последовательности. В случае применяемых в качестве гибридизационного зонда фрагментов речь может идти о синтетических фрагментах, которые получены с использованием обычных способов синтеза и последовательность которых по существу согласуется с последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты данного изобретения. Молекулы, гибридизующиеся с молекулами нуклеиновых кислот данного изобретения, включают в себя также фрагменты, производные и аллельные варианты вышеописанных молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют фермент данного изобретения. Под "фрагментами" подразумевают при этом части молекул нуклеиновых кислот, которые являются достаточно длинными, чтобы кодировать описанный фермент. Выражение "производное" обозначает согласно изобретению, что последовательности этих молекул отличаются от описанных выше последовательностей молекул нуклеиновых кислот в одном или нескольких положениях, но имеют высокую степень гомологии с этими последовательностями. При этом гомология означает идентичность последовательности по меньшей мере 40%, в частности, идентичность по меньшей мере 60%, предпочтительно более 80% и особенно предпочтительно более 90%, 95%, 97% или 99% на уровне нуклеиновых кислот. При этом кодируемые этими молекулами нуклеиновых кислот ферменты имеют идентичность последовательности относительно приведенной в SEQ ID NO: 1 аминокислотной последовательности по меньшей мере 80%, предпочтительно 85% и особенно предпочтительно более 90%, 95%, 97% и 99% на уровне аминокислот. Отклонения относительно описанных выше молекул нуклеиновых кислот могут возникать при этом вследствие делеции, замены, инсерции или рекомбинации. При этом речь может идти о возникающих естественным образом вариациях, например, о последовательностях из других организмов, или о мутациях, причем эти мутации могут возникать естественным путем или посредством целенаправленного мутагенеза (УФ или рентгеновское излучение, химические агенты и др.). Далее, в случае вариаций речь может идти о синтетически полученных последовательностях. В случае аллельных вариантов речь может идти как о естественно появляющихся вариантах, так и о синтетически полученных или сконструированных способами рекомбинантных ДНК вариантах. Кодируемые различными вариантами молекул нуклеиновых кислот данного изобретения ферменты имеют определенные общие характеристики, такие как активность фермента, активная концентрация фермента, субъединицы, посттрансляционные модификации, функциональные группы, молекулярная масса, иммунологическая реактивность, конформация и/или физические свойства, такие как поведение миграции в гель-электрофорезе, хроматографическое поведение, коэффициенты седиментации, растворимость, спектроскопические свойства, стабильность, оптимальный показатель рН, изоэлектрический показатель рН, оптимальная температура и/или другие.

В случае молекул нуклеиновых кислот данного изобретения речь может идти как о молекулах ДНК, так и о молекулах РНК. Молекулы ДНК данного изобретения являются, например, молекулами геномной ДНК или молекулами кДНК.

Данное изобретение относится далее к векторам, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения. Предпочтительно речь идет при этом о плазмидах, космидах, вирусах, бактериофагах, челночных векторах и других обычных в генной инженерии векторах. Векторы в соответствии с данным изобретением могут обладать еще дополнительными функциональными единицами, которые обусловливают стабилизацию и/или репликацию вектора в организме-хозяине или способствуют им.

В особенно предпочтительном варианте осуществления включены также векторы, у которых молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения функционально (оперативно) связана по меньшей мере с одним регуляторным элементом, который гарантирует транскрипцию и синтез транслируемых молекул нуклеиновых кислот в про- и/или эукариотических клетках. Подобными регуляторными элементами могут быть промоторы, энхансеры, операторы и/или сигналы терминации транскрипции. Само собой разумеется, векторы могут содержать также необходимые для их стабильности и/или репликации элементы, а также гены устойчивости к антибиотику и маркеры для отбора.

Данное изобретение относится также к вышеуказанным векторам, причем они, наряду с контролируемой по меньшей мере одним регуляторным элементом последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует SDH, содержат последовательность нуклеиновой кислоты, также контролируемую по меньшей мере одним регуляторным элементом, которая кодирует сахарозомутазу. Подобный вектор имеет также генетическую информацию для обоих ферментов, которая является необходимой для ферментативного превращения сахарозы через изомальтулозу до 1,6-GPS. Такие векторы позволяют простым образом использовать аппарат обмена веществ отдельного организма-хозяина для ферментативного превращения сахарозы в 1,6-GPS на одной стадии.

Данное изобретение относится также к клеткам-хозяевам, которые содержат одну из молекул нуклеиновых кислот данного изобретения или один из векторов данного изобретения или трансформированы этим вектором и, предпочтительно, способны экспрессировать SDH и, в случае необходимости, сахарозомутазу, а также, особенно предпочтительно, производить 1,6-GPS из изомальтулозы или сахарозы. Далее, данное изобретение относится ко всем клеткам-хозяевам, которые происходят от клетки-хозяина, трансформированной молекулами нуклеиновых кислот данного изобретения или векторами данного изобретения. Данное изобретение относится также к клеткам-хозяевам, которые содержат нуклеиновые кислоты или векторы данного изобретения, причем под клеткой-хозяином имеют в виду организм, который способен поглощать in vitro рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот и, в случае необходимости, синтезировать кодируемые молекулами нуклеиновых кислот данного изобретения ферменты. Предпочтительно, речь идет о прокариотических или эукариотических клетках. Данное изобретение относится прежде всего к микроорганизмам, которые содержат векторы, производные или части векторов, которые способны к синтезу ферментов для получения 1,6-GPS из изомальтулозы или из сахарозы. Клетка-хозяин в соответствии с данным изобретением может отличаться тем, что введенная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения является либо гетерологичной в отношении трансформированной клетки, т.е. не присутствует естественным путем в этой клетке, либо локализована в другом месте или в другой копийности в геноме, чем соответствующая встречающаяся естественным путем последовательность.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения эта клетка является прокариотической клеткой, предпочтительно грамотрицательной прокариотической клеткой, особенно предпочтительно клеткой бактерий кишечной группы. При этом, с одной стороны, может применяться клетка, которая не содержит собственного гена SDH и/или сахарозомутазы, но с другой стороны, могут применяться также клетки, которые уже содержат один или два таких гена в их хромосоме. Предпочтительными примерами подходящих прокариотических клеток являются клетки Е. coli, Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici, Enterobacter spec. или Pseudomonas mesoacidophila. Трансформация прокариотических клеток экзогенными последовательностями нуклеиновых кислот известна специалисту в области молекулярной биологии.

В следующем варианте осуществления данного изобретения клетка может быть также эукариотической клеткой, такой как клетка гриба (например, дрожжи) или клетка животного. Способы трансформации или трансфекции эукариотических клеток экзогенными последовательностями нуклеиновых кислот также известны специалисту в области молекулярной биологии.

Данное изобретение относится также к культурам клеток, которые имеют по меньшей мере одну из клеток-хозяев данного изобретения, причем культура клеток данного изобретения предпочтительно является способной продуцировать SDH и в случае необходимости сахарозомутазу.

Данное изобретение относится также к способу получения SDH, при котором клетки-хозяева данного изобретения культивируют в культуральной среде при таких условиях, которые могут позволить образование SDH и получение из них SDH.

Следующим вариантом осуществления данного изобретения являются белки, которые кодируются молекулами нуклеиновых кислот данного изобретения, а также способ их получения, при котором клетки-хозяева данного изобретения культивируют при условиях, которые делают возможным синтез белка, с последующим выделением этого белка из культивируемых клеток и/или из культуральной среды.

Далее, данное изобретение относится к моноклональным и поликлональным антителам, которые способны идентифицировать и, в случае необходимости, связывать структуру имеющей SDH-активность единицы данного изобретения. Этой структурой может быть белок, углевод, а также липидный комплекс и/или гликолипид, которые находятся в специфическом отношении с имеющей SDH-активность единицей. Антитела, которые направлены против структур, которые могут быть названы посттрансляционными модификациями SDH, также включены в объем изобретения. Важно, что пространственная структура электронного облака при помощи антител может быть идентифицирована таким образом, что возможны выводы о биологических, химических и физических свойствах имеющей SDH-активность единицы.

В следующем особом варианте осуществления изобретение относится также к антителам, которые взаимодействуют с описанными выше антителами данного изобретения, в частности, могут их идентифицировать и связывать.

Далее, данное изобретение относится к вышеуказанным антителам, причем эти антитела модифицированы биологическим, химическим и физическим способами.

Данное изобретение поясняется далее при помощи примеров и относящихся к ним фигур.

Фигуры показывают:

фигура 1 - плазмидную карту плазмиды pBtac 2

и

фигура 2 - плазмидную карту pHWG 467.

SEQ ID NO: 1 показывает аминокислотную последовательность SDH, включающую 262 аминокислоты,

SEQ ID NO: 2 показывает аминокислотную последовательность SDH, включающую 789 аминокислот,

SEQ ID NO: 3-9 показывают частичные аминокислотные последовательности SDH.

Пример 1; Получение SDH

Получение биомассы Gluconobacter suboxidans

Для обеспечения достаточного количества биомассы Gluconobacter suboxidans DSM 2003 штамм ферментировали в лабораторных условиях. В качестве среды 1 применяли: D-маннит (50 г/л), пептон из казеина (10 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л) и СаСО₃ (20 г/л). Среда 2 содержала следующее: D-маннит (75 г/л), пептон из казеина (16 г/л), дрожжевой экстракт (8 г/л) и СаСО₃ (1 г/л). В качестве предварительной культуры одну банку с лиофилизированным консервированным штаммом Gluconobacter suboxidans DSM 2003 суспендировали в 1 мл среды 1, высевали штрихом на чашку агара со средой 1 и культивировали в течение 72 часов при 25°С. После этого субкультуру культуры на агаровой чашке вносили в 25 мл среды 1 и культивировали во встряхиваемой колбе в течение 48 часов при 25°С. Затем эту культуру, также называемую первой предварительной культурой, культивировали в 250 мл среды 1 во встряхиваемой колбе (с объемом 1 л) в течение 48 часов при 25°С. Полученная таким образом культура, также называемая второй предварительной культурой, служила в качестве инокулята для ферментации.

Для ферментации вторую предварительную культуру из встряхиваемой колбы переносили в 15 л среды 2 в ферментере на 20 л и культивировали при 25°С при следующих условиях:

показатель рН: 6,9 (поддерживаемый постоянно титрованием 5 н. NaOH),

скорость перемешивания: 350 об/мин и

насыщение кислородом: 40%.

Указанные условия поддерживали постоянными во время ферментации. Ферментацию заканчивали с окончанием роста клеток, которое устанавливали по потреблению субстрата при помощи ВЖХ.

Полученную таким образом клеточную массу собирали центрифугированием (8000×g, 20 мин, 4°С) и промывали 0,9%-ным раствором NaCl и разводили в 50 мМ Трис-буфере (рН 7,0) и разрушали по способу French-press. Образовавшиеся клеточные остатки (дебрис) удаляли ультрацентрифугированием (110000×g, 20 мин, 4°С). Прозрачный супернатант, так называемый неочищенный экстракт, применяли сразу или хранили при -30°С.

Очистка SDH

Для очистки SDH была выбрана следующая трехстадийная схема:

Стадия 1:

Неочищенный экстракт наносили на уравновешенную 50 мМ Трис/HCl-буфером (рН 7,0) ДЭАЭ-сефарозную колонку (2,6×9 см) и элюировали линейным градиентом 0,0-0,5 М NaCl в 50 мМ Трис/HCl-буфере (рН 7,0) и при скорости течения 50 см/ч. SDH элюировалась при 0,2 М NaCl.

Стадия 2:

Колонку для аффинной хроматографии с иммобилизованным красителем-лигандом подготавливали следующим образом: (i) гель Сефарозы 4В-Cl применяли в качестве матрикса (Boyer, P.M. und Hsu, J.T. (1993) In: Fiechter, A. (ed.). Advances in Biochemical engineering, 49, 1-44) и (ii) краситель синий 160 (Blue H-ERD) иммобилизовали по способу Neuhauser, W. et al., 1997 (Biochem. J., 326, 683-692). Для этого использовали 10 мг красителя на 1 мл геля. Объединенные SDH-содержащие фракции со стадии 1 диализовали и наносили на колонку с красителем-лигандом (2,6×7,0 см, уравновешенную 50 мМ Трис/HCl-буфером, рН 7,0) (приблизительно 2-5 мг белка/мл геля). Адсорбированный белок элюировали линейным градиентом 0,0-0,5 М NaCl в 50 мМ Трис/HCl-буфере, рН 7,0, и при скорости течения 2,0 мл/мин. SDH элюировалась при 0,1 М NaCl.

Стадия 3:

Объединенные активные фракции со стадии 2 диализовали и концентрировали ультрафильтрацией и еще раз наносили на колонку с красителем-лигандом (2,6×7,0 см, уравновешенную 50 мМ Трис/HCl-буфером, рН 7,0), причем наносили приблизительно 0,5 мг белка на 1 мл геля. Аффинную элюцию чистой SDH проводили 10 мМ NADH в 20 мМ Трис/HCl-буфере, рН 7,0, при скорости течения 10 см/ч. NADH затем удаляли посредством диализа.

Очищенная сорбитолдегидрогеназа (SDH) может храниться при -30°С в течение приблизительно 8 месяцев, при +4°С SDH является стабильной в течение приблизительно 30 дней.

Схема очистки SDH приведена в таблице.

 Стадия очисткиОбщая активностьОбщий белокУдельная активностьОбогащениеВыход (Е)(мг)(Е/мг)(число раз)(%)Неочищенный экстракт360,0782,60,461,0100ДЭАЭ-сефароза281,078,53,587,878Синий 160-аффи-гель174,015,711,1224,248Синий 160-аффи-гель120,04,924,4953,233

С использованием представленной схемы очистки, следовательно, разделения неочищенного экстракта при помощи анионообменной хроматографии, с последующими первой аффинной хроматографией с красителем-лигандом, ультрафильтрацией и второй аффинной хроматографией с красителем-лигандом, можно достичь приблизительно 50-кратного обогащения в сравнении с показателем неочищенного экстракта. Выход составляет после этого приблизительно 33%.

Пример 2: Получение 1,6-GPS из изомальтулозы

Ферментативное непрерывное получение 1,6-GPS в ферментно-мембранном реакторе

Непрерывное получение 1,6-GPS из изомальтулозы проводили с использованием реактора из высококачественной (инструментальной) стали (объем 50 мл). Ферментно-мембранный реактор имел двойной кожух для поддержания температурного режима при помощи охлаждения водой, отверстия для введения обеспечивающих электропроводность электродов и рН-электродов и присоединительные элементы для измерения давления, подачи субстрата, вывода продукта и взятия проб. Находящаяся во внутреннем пространстве магнитная мешалка, которая может запускаться снаружи, гарантирует оптимальное перемешивание используемых веществ. Крышка реактора содержит на нижней стороне пластину из агломерата металла, на которой были нанесены ультрафильтрационная мембрана и O-кольцо. После заполнения реактора крышку с нижней частью привинчивали. Подача субстрата происходила с использованием поршневого насоса. Электропроводность и показатель рН реакционного раствора непрерывно и непосредственно измеряли, причем систему регулирования рН поддерживали титриметрически на постоянном уровне. Так как ультрафильтрационная мембрана не гарантировала полного удерживания кофермента, использовали заряженную мембрану фирмы Nitto (Nitto-membran NTR-7410). Этот электростатический способ удерживания кофермента гарантирует удерживание также диссоциированного кофермента в желательном реакционном пространстве.

Описанный мембранный реактор заполняли раствором из 250 мМ изомальтулозы и глюкозы в 50 мМ Трис-HCl-буфере рН 7,5 (+0,1% NaN₃). При скорости потока 2 мл/ч реактор затем эксплуатировали на «холостом ходу» для обнаружения негерметичностей или других проблем и в случае необходимости их устранения. Сразу же после этого вносили регенерирующий фермент FDH суперпетлей, которую применяют для нанесения проб в хроматографии. Для начала реакции используют по 1 Е/мл полностью очищенного SDH (из примера 1) и GDH (глюкозодегидрогеназы из Bacillus megaterium). После инъекции 2,5 мкМ NAD⁺ начиналась реакция. Показатель рН поддерживали на постоянном уровне титрованием 1 М Трис до рН 7,0. Важной величиной при эксплуатации непрерывного реактора является распределение времени пребывания. Его рассчитывают с допущением оптимального смешивания реакционного раствора согласно формуле

,

где V обозначает объем реактора и V₀ обозначает объемный поток. После четырех часов периодического процесса подачу субстрата устанавливали на скорость течения 2 мл/ч, так чтобы среднее время пребывания (τ) составляло 25 часов. Продолжительность опыта составляла 234 ч, причем с регулярными интервалами определяли ферментативные активности, потребление щелочи, электропроводность, давление, субстрат и объем продукта. Полученные пробы продукта исследовали при помощи ВЖХ на их состав и подтверждали образование 1,6-GPS.

Пример 3: Ферментативный однореакторный способ («реакция в одном сосуде») для получения 1,6-GPS из сахарозы

Для непосредственного ферментативного получения 1,6-GPS из сахарозы проводили опыт с периодической ферментацией с иммобилизованными клетками Р. rubrum, а также ферментом SDH из G. suboxidans 2003 и FDH из Candida boidinii при приведенных ниже условиях. Субстратами в этой реакции были сахароза и формиат аммония.

Объем: 10 млТемпература: 25°ССахароза: 500 мМФормиат: 500 мМКлетки Р. rubrum: 1 гSDH: 5 ЕFDH: 10 ЕNAD: 1 мМ

Так как при этой реакции показатель рН повышался, рН поддерживали на уровне 7,0 1 М муравьиной кислотой. Потребление субстрата во время реакции контролировали способами ТСХ и DNS (для превращения сахарозы в изомальтулозу), а также ВЖХ (для превращения изомальтулозы в 1,6-GPS). Удалось показать прямое образование 1,6-GPS из сахарозы в одном реакционном сосуде и на одной стадии.

Пример 4: Нуклеиновая кислота и расшифрованная пептидная последовательность SDH 1. Получение пептидной последовательности

Для получения частичных аминокислотных последовательностей очищенную согласно примеру 1 сорбитолдегидрогеназу (SDH) Gluconobacter suboxidans DSM 2003 расщепляли трипсином и разделяли с использованием стандартных способов. Полученные частичные пептидные последовательности представлены в SEQ ID NO: 3-9.

2. Приготовление ДНК-зондов

На основе последовательностей, анализируемых при получении пептидных последовательностей, готовили праймеры, при помощи которых удалось клонирование всего гена SDH из Gluconobacter suboxidans DSM 2003.

3. Создание банка генов и выделение клонов

Вышеупомянутые праймеры (SEQ ID NO: 3 и 5) использовали в ПЦР-реакции и получили фрагмент SDH-кодирующей последовательности. С использованием полученного ПЦР-фрагмента получили ДНК-зонд. В геномном блоттинге по Саузерну смогли после мечения зонда установить гибридизующиеся полосы. Были созданы два независимых субгеномных банка генов (после расщепления ClaI фрагмент ˜9 т.п.н., после расщепления BamHI фрагмент ˜3,5 т.п.н., очистку фрагментов проводили центрифугированием в сахарозном градиенте) с очищенными множествами фрагментов в pBluescript SK. С упомянутыми мечеными зондами испытывали субгеномные банки клонов при помощи гибридизации. Удалось идентифицировать несколько клонов, из которых каждый клон из BamHI-банка и ClaI-банка анализировали дополнительно.

4. Анализ последовательности

Получение последовательности клонированных фрагментов дало в обоих случаях согласующуюся ДНК-последовательность. Из нее смогли установить аминокислотную последовательность SDH. Она согласуется с последовательностями из пептидных последовательностей до положения кодона 196, для которого эта пептидная последовательность для пептида 5 давала серин (S) вместо полученного триптофана (W 196).

Нуклеотидная последовательность SDH Gluconobacter suboxidans DSM 2003 представлена в SEQ ID NO: 2 и включает в себя 789 нуклеотидов.

Аминокислотная последовательность сорбитолдегидрогеназы Gluconobacter suboxidans DSM 2003 представлена в SEQ ID NO:1 и включает в себя 262 аминокислоты.

5. Экспрессия в Е. coli

Кодирующую последовательность удлиняли на 5'-конце последовательностью GAATTCTT и на 3'-конце последовательностью AAGCTT. Эту последовательность интегрировали в вектор pBtac2 (фиг. 1; J. Bosius (1988), Biotecjnology 10, 205-225), который был обработан EcoRI и HindIII. Полученная плазмида pHWG 467(фиг. 2) содержит ген устойчивости к ампициллину и SDH-кодирующую последовательность под контролем промотора tac. Плазмиду pHWG 467 трансформировали в Е. coli JM109. Эти клетки продуцировали после индукции IPTG SDH-активность. Соответствующий белок может быть определен в неочищенных экстрактах по его активности. В ДСН-гелях этих экстрактов этот белок окрашивается в виде доминирующей полосы при 28 кДа Кумасси бриллиантовым синим.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности. Для получения 6-O-α-D-глюкопиранозил-D-сорбита (1,6-GPS) изомальтулозу подают в реакционный раствор, содержащий фермент, обладающий способностью катализировать превращение изомальтулозы в 1,6-GPS, из которого выделяют целевой продукт после инкубации при температуре 20-40°С. До или во время инкубации в реакционный раствор добавляют восстановительные эквиваленты. Фермент выделяют посредством анионообменной и двух аффинных хроматографии из неочищенного экстракта микроорганизма рода Gluconobacter, содержащего ген фермента, обладающего способностью катализировать превращение изомальтулозы в 1,6-GPS. Получена нуклеиновая кислота, кодирующая фермент, обладающий способностью катализировать превращение изомальтулозы в 1,6-GPS. Вектор, содержащий данную нуклеиновую кислоту, предназначен для обеспечения экспрессии этого фермента в клетке-хозяине. Применение изобретения позволяет получить 6-О-α-D-глюкопиранозил-D-сорбит из изомальтулозы посредством одной единственной ферментативной реакции. 6 н. и 20 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ ферментативного получения 6-О-α-D-глюкопиранозил-D-сорбита (1,6-GPS) из изомальтулозы, причем изомальтулозу подают в водный реакционный раствор, содержащий средство, обладающее способностью катализировать превращение изомальтулозы в 1,6-GPS, которое представляет собой фермент, который

(a) имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или

(b) кодируется нуклеиновой кислотой, включающей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2,

инкубируют и затем выделяют из реакционного раствора 1,6-GPS, причем в водный реакционный раствор добавляют до или во время инкубации восстановительные эквиваленты и ферментативное получение происходит при температурах от 20 до 40°С.

a) нуклеиновой кислоты, нуклеотидная последовательность которой кодирует приведенную в SEQ ID NO: 1 аминокислотную последовательность;

b) нуклеиновой кислоты, имеющей представленную, в SEQ ID NO: 2 нуклеотидную последовательность или комплементарную ей цепь.