ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM VERRUCOSUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ, И СРЕДСТВО-ИММУНОМОДУЛЯТОР НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/14 A61K36/06 A61P37/02 C12R1/80 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к разработке новых источников получения биологически активных веществ и иммуномодулирующих средств для воздействия на живой организм.

В настоящее время большой интерес вызывают препараты природного происхождения, неоспоримым преимуществом которых является их физиологичность для организма и экологическая безвредность.

Известны биологически активные препараты иммуностимулирующего действия, полученные из природных источников (на основе симбиотрофных грибов), обитающих в естественных условиях на корнях растений, например препараты Эмистим С, Агроэмистим-Экстра [1, 2]. Эти биопрепараты содержат оптимальный для стимуляции жизнедеятельности растений набор ростовых веществ (фитогормонов), витаминов, аминокислот, жирных кислот, микроэлементов. Многократные испытания этих препаратов показали, что они обеспечивают повышение всхожести семян растений, устойчивость к болезням и стрессовым факторам, способствуют повышению урожая и улучшению качества продукции растениеводства, снижают содержание нитратов [3]. Это происходит за счет активизации основных процессов жизнедеятельности растений - процессов фотосинтеза, дыхания, питания клеток, активизации ферментных систем. Данные препараты изготовлены на природной основе, получены из грибов-эпифитов корневой системы лекарственных растений, сертифицированы и аттестованы на экологическую безопасность.

Известно также биологически активное средство (биокорректор) «Флоравит Э» на основе экстракта гриба Fusarium sambusinum, являющееся эффективным иммуномодулятором и адаптогеном [4]. Данное средство широко используется в клинической медицине как при лечении различных заболеваний (сахарный диабет, трофические нарушения, заболевания суставов), так и при борьбе с вирусными инфекциями. Клинически показано его гепатопротекторное действие, эффективность применения в гастроэнтерологии, акушерско-гинекологической практике и для оздоровления и омоложения организма в восстановительной медицине и косметике [5]. Терапевтические возможности препарата «Флоравит Э» связаны, в первую очередь, с его природным происхождением из гриба Fusarium sambusinum и уникальностью набора биологически активных компонентов, входящих в его состав.

Однако изыскание природных источников для поиска и создания высокоэффективных биологически активных средств, обладающих уникальным набором входящих в них компонентов и оказывающих влияние на состояние организма человека и животных, является непростой задачей. Выделение биологически активной субстанции из источника природного происхождения должно обеспечивать также максимальное сохранение полезных свойств, отсутствие токсичности и побочных эффектов.

Решение этой задачи возможно с помощью новых средств природного происхождения, обладающих иммуномодулирующими свойствами, позволяющими применять их при самых разных терапевтических воздействиях.

Это достигается использованием в качестве исходного природного сырья нового штамма гриба Penicillium verrucosum ВКПМ F-984 и выделением из него препарата, обладающего иммуномодулирующими свойствами.

Предлагается новый штамм гриба Penicillium verrucosum ВКПМ F-984, используемый для получения средства, обладающего иммуномодулирующими свойствами, и средство, полученное на основе штамма Penicillium verrucosa ВКПМ F-984, обладающее иммуномодулирующими свойствами. Данное средство получено, в частности, экстракцией мицелия указанного штамма и представляет собой его водно-спиртовой экстракт.

Технический результат заявленной группы изобретений состоит в изыскании новых природных источников биологически активных веществ и расширении ассортимента высокоэффективных средств-иммуномодуляторов природного происхождения, предназначенных для воздействия на живой организм в области медицины, ветеринарии или при комплексных оздоровительных мероприятиях. Применение их позволяет более эффективно осуществлять лечение и профилактику заболеваний за счет повышения иммунитета и комплексного воздействия на организм.

Получаемое из штамма гриба Penicillium verrucosum ВКПМ F-984 иммуномодулирующее средство обладает адаптогенным действием, повышает неспецифическую резистентность организма и его адаптационные возможности. Для его получения обычно осуществляют экстракцию мицелия гриба водным раствором спирта.

Штамм гриба Penicillium verrucosum ВКПМ F-984 выделен из микрофлоры корней женьшеня следующим образом.

Метод выделения штамма: корни женьшеня отмывают проточной водой, подсушивают на фильтровальной бумаге и отбирают корешки 4-5 порядка, 5 г сухих корней обрабатывают 60% H₂SO₄, измельчают и переносят в колбы с питательной средой (состав питательной среды: глюкоза - 8,0 г, K₂HPO₄ - 0,5 г, KH₂PO₄ - 1,0 г, MgSO₄ - 0,2 г, K₂SO₄ - 0,1 г, аспарагин - 20 мг, вода водопроводная - до 1 литра).

Для хранения и размножения эндофитного микромицета Penicillium verrucosum ВКПМ F-984 используют агаризированную среду: глюкоза - 8,0 г, K₂HPO₄ - 0,5 г, KH₂PO₄ - 1,0 г, MgSO₄ - 0,2 г, K₂SO₄ - 0,1 г, аспарагин - 20 мг, вода водопроводная - до 1 литра, агар-агар - 15,0 г.

Культуру высевают на чашки Петри, инкубируют в термостате и используют для приготовления посевного материала.

Выделенный штамм был депонирован в коллекции-депозитарии ВКПМ, ему присвоен регистрационный номер F-984.

Культуралъно-морфологические свойства штамма.

Макроморфологические признаки: при посеве уколом на среду с агаром на 15 день роста при +24°С развивается бородавчатая колония округлой формы серо-зеленого цвета, на периферии слабая исчерченность, размер колонии диаметр 35-40 мм, воздушный мицелий-реверс белый, поверхностное спороношение, цвет обратной стороны колонии коричневато-желтоватый. Мицелий бесцветный септированный, большое количество мелких округлых зеленоватых конидий, конидиеносцы одномутовчатые моновертициллятные, споры шаровидной формы, прозрачные, оболочка гладкая.

Физиолого-биохимические свойства штамма.

Штамм растет в температурном диапазоне от 24 от 27°С, температурный оптимум 25-27°С.

При росте на питательных средах предпочтительны слабокислые значения рН, рН-оптимум 6,5.

Возможно выращивание на простых средах с использованием глюкозы в качестве источника углерода, желательно содержание в средах калия и магния.

Способ получения средства на основе штамма Penicillium verrucosum ВКПМ F-984 включает следующие операции.

Культуральную жидкость вместе с мицелием при перемешивании обрабатывают активированным углем (5 г/л жидкости), выдерживают в течение 25 часов и фильтруют. Твердую фракцию при интенсивном перемешивании экстрагируют водным раствором спирта (70%) в течение суток. Экстракт отфильтровывают.

Полученный отфильтрованный спиртовой экстракт является описываемым средством, обладающим иммуномодулирующими свойствами.

Пример 1. Получение иммуномодулятора из штамма Penicillium verrucosum ВКПМ F-984.

В ферментеры в стерильных условиях добавляют посевной материал при дозе 3% от объема ферментационной среды. Ферментационная среда включает: глюкоза - 8,0 г, K₂HPO₄ - 0,5 г, KH₂PO₄ - 1,0 г, MgSO₄ - 0,2 г, K₂SO₄ - 0,1 г, аспарагин - 20 мг, вода водопроводная - до 1 л. Процесс ферментации заканчивают по мере созревания мицелия гриба и по достижении максимума накопления в культуральной жидкости продуктов метаболизма гриба-микромицета.

Полученную культуральную жидкость с мицелием при интенсивном перемешивании обрабатывают активированным углем из расчета 5 г на 1 л жидкости, выдерживают при температуре 25°С в течение 24 часов и фильтруют. Твердую фракцию помещают в отдельную емкость и при интенсивном перемешивании экстрагируют расчетным количеством 75%-ного водного раствора этилового спирта в течение 24 часов. По окончании экстракции проводят фильтрацию и получают отфильтрованный экстракт.

Пример 2. Исследование свойств полученного иммуномодулятора.

Для изучения влияния препарата на гематологические, биохимические и иммунологические показатели организма был поставлен эксперимент продолжительностью 6 месяцев на крысах-самцах линии ВИСТАР с исходной массой 125-130 г. Крысы были разбиты на 2 группы: контрольная группа - животные получали общевиварный рацион, опытная группа - животные на фоне общевиварного рациона ежедневно вместе с кормом получали препарат-иммуномодулятор в дозе 0,25 мл/кг массы животного. Проведено 2 забоя животных: через 3 и 6 месяцев от начала эксперимента.

Влияние препарата-иммуномодулятора на морфологические показатели организма.

Общее состояние животных всех групп было удовлетворительным на протяжении всего эксперимента.

Проводили микроскопически исследования 10 органов от каждой крысы: печень, почки, легкие, семенники, лимфоидные органы (мезентериальный лимфоузел, селезенка и вилочковая железа, тимус) органы ЖКТ (тонкая и толстая кишка, желудок). Через 3 месяца от начала эксперимента отмечались небольшие дистрофические изменения печени в опытной группе по сравнению с контролем. В селезенке и мезентериальном лимфоузле в части случаев отмечалась лимфоидная пролиферация в опытной группе по сравнению с контролем. Через 6 месяцев от начала эксперимента не обнаружено существенных морфологических изменений внутренних органов в опытной группе по сравнению с контролем.

Влияние препарата на биохимические и гематологические показатели крови и мочи.

При изучении биохимических показателей учитывали содержание общего белка, содержание глюкозы в сыворотке крови, активность некоторых ферментов сыворотки крови и печени крыс, содержание креатинина в моче.

Содержание общего белка в сыворотке крови крыс, активность ферментов сыворотки крови и печени крыс при включении в их рацион иммуномодулирующего препарата, полученного по примеру 1, не отличались от контроля на протяжении всего эксперимента (через 3 и 6 месяцев).

Не выявлено разницы между опытной группой и контролем по таким показателям как концентрация гемоглобина, общее количество эритроцитов, гематокрит, ССО, СКЭ на протяжении всего эксперимента. Лейкоцитарная формула у крыс при включении в их рацион исследуемого препарата существенно не отличалась от контроля.

Иммунотоксические свойства препарата.

Иммунотоксические свойства препарата были изучены в опыте на белых мышах-самцах массой 18-20 г.

О влиянии препарата на клеточное звено иммунитета судили по выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа и аутологичным розеткообразующим клеткам (ауто-РОК).

Определение выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) проводили на 40 мышах линии СВА. Первой группе животных вводили исследуемый препарат в дозе 0,25 мл/кг, 2-й группе - в дозе 0,5 мл/кг, 3-й группе - 1 мл/кг в течение 5 дней перорально, всем опытным группам на 5-й день параллельно с ведением препарата вводили суспензию эритроцитов барана (ЭБ) внутрибрюшинно (10% суспензия) в дозе 0,3 мл/кг. Животным контрольной группы вводили только 10% суспензию ЭБ. Через 5 дней после сенсибилизации всем подопытным животным вводили разрешающую дозу 2% суспензии ЭБ в количестве 0,02 мл в правую лапку, а в левую физраствор - 0,02 мл. Контрольным животным вводили только 2% суспензию ЭБ и учитывали индекс стимуляции. При учете индекса стимуляции установлено, что исследуемый препарат обладает иммуностимулирующими свойствами во всех испытанных дозах (0,25; 0,5; 1,0 мл/кг живой массы) и индекс стимуляции (ИС) составил 9,8±0,7; 10,1±0,2; 9,45±0,4 соответственно по группам опытных животных, в контроле ИС=4,5.

Изменения в динамике ауто-РОК у животных на фоне введения препарата изучали на 75 мышах линии СВА. 1-я группа мышей получала препарат в дозе 0,25 мл/кг, 2-я - в дозе 0,5 мл/кг перорально в течение 5 дней, 3-я группа служила контролем. Исследования проводили на 5, 10, 15, 20 дни после последнего введения препарата. Кинетика ауто-РОК характеризовалась повышением как абсолютного, так и относительного количества розеткообразующих клеток в крови мышей.

Изменения в динамике показателей аутологичных розеткообразующих клеток у мышей дает представление о влиянии препарата на клеточный иммунитет, что выражается в повышении функциональной активности Т-лимфоцитов. Оценку В-клеточного звена иммунной системы проводили по определению количества антителообразующих клеток в селезенке и кинетике В-лимфоцитов.

Определение антителообразующих клеток (АОК) в селезенке проводили в опыте на 30 мышах линии СВА. Первой группе животных препарат вводили в дозе 0,25 мл/кг, 2-й - 0,5 мл/кг, одновременно внутрибрюшинно вводили ЭБ. Число АОК считали в одной пробе среди 200 лимфоцитов. Препарат индуцирует трансформацию В-лимфоцитов в АОК в селезенке, индекс стимуляции (ИС) равен 1,4, в контрольной группе ИС составил 0,9.

Кинетика В-лимфоцитов определялась в опыте на 60 мышах линии СВА. Содержание ЕАС-розеткообразующих клеток в крови мышей контрольной группы существенно не отличалось от опытной группы в течение всего периода исследований и составило 19,4±2,6-20,9±1,4.

В динамике относительного количества В-лимфоцитов после ведения препарата в дозе 0,25 мл/кг наблюдали достоверное увеличение ЕАС-РОК на 10-й и 15-й дни исследования, в то время как во 2-й группе животных (доза препарата 0,5 мл/кг) на 5-й, 10-й, 15-й дни наблюдений содержание ЕАС-РОК составило 23,6±1,18-22,6±1,13. Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что исследуемый препарат в дозе 0,5 мл/кг, введенный перорально, в течение 5 дней повышает клеточный иммунный ответ.

Определение титров гемагглютининов в сыворотке крови животных после введения препарата проводили на 30 мышах линии СВА (2 опытные группы, 1 контрольная группа). На 7-й день после иммунизации все животные были забиты и определены титры общих антител и антитела классов М и О. Содержание иммуноглобулинов М и О в опытных группах было выше, чем в контрольной.

Иммунологические исследования на крысах.

Определение иммунного статуса организма оценивали по компетентности клеточного и гуморального иммунного ответа на крысах-самцах линии ВИСТАР с исходной массой 125-130 г в хроническом токсикологическом эксперименте продолжительностью 6 месяцев. Крысы были разбиты на 2 группы: контрольная группа - животные получали общевиварный рацион, опытная группа - животные на фоне общевиварного рациона вместе с кормом получали исследуемый препарат в дозе 0,25 мл на кг массы крысы.

Компетентность клеточного иммунитета оценивали по индуцированной фитогемаглютинином (ФГА) и специфическим антигеном, приготовленным из исследуемого препарата, реакции стимуляции лимфоцитов периферической крови, по выраженности реакции торможения лейкоцитов в присутствии ФГА и специфических антигенов и по степени Т-зависимой клеточной цитотоксичности. Митогенный ответ периферических лимфоцитов крыс на ФГА и специфический антиген (СА) оценивали по процентному содержанию трансформированных клеток. В результате изучения влияния препарата на митогенную стимуляцию периферических лимфоцитов крыс было установлено, что он способен повышать пролиферативную активность Т-клеток. Величина индекса цитотоксичности крыс опытной группы через 3 месяца составила 0,35±0,02, через 6 месяцев 0,32±0,03, а в контрольной группе соответственно 0,28±0,04 и 0,24±0,01.

Полученные данные указывают на иммуностимулирующую роль исследуемого препарата по отношению к тимусзависимым лимфоцитам.

Компетентность гуморального иммунитета оценивали по содержанию в сыворотке крови крыс иммуноглобулинов основных классов. Исследования содержания иммуноглобулинов сыворотки крови крыс при включении в их рацион препарата позволили установить общую направленность к стимуляции гуморального звена иммуногенеза. Через 3 месяца концентрация иммуноглобулинов класса О, А, М, Е составила в контроле 743±37,2; 138±6,8; 8±3,9; 0,45±0,01; в опытной группе 861±43,05; 132±6,6; 87±4,5; 0,42±0,03 соответственно. Через 6 месяцев после начала эксперимента в контроле - 723±36,14; 131±6,5; 80±3,5; 0,45±0,01; в опытной группе - 836±41,8; 136±6,8; 86±4,3; 0,46±0,02 соответственно по классам иммуноглобулинов.

Состояние неспецифических защитных показателей изучали по содержанию в сыворотке крови некоторых компонентов комплемента и по уровню отдельных сывороточных белков «острой фазы» воспаления. Содержание компонентов комплемента СЗ, С4, С5, С9 в контроле составило 551+27,5; 239+12,0; 107+5,35: 38±1,9; в опытной группе 567±28,35; 269±13,45; 116±5,8; 46±2,3 соответственно.

В результате проведенных экспериментов выявлено модулирующее влияние исследуемого препарата на клеточные иммунные реакции (повышение пролиферативного ответа периферических лимфоцитов на митогены (ФГА), усиление интенсивности цитотоксичности). Отмечается стимулирующее влияние на синтез иммуноглобулинов (1^0 и 1^М), компонентов комплемента (С4 и С9), белков «острой фазы воспаления» (трансферин, С-реактивный белок).

В ходе исследований было выявлено, что исследуемый препарат не обладает иммунотоксическим действием по отношению к функциональной активности Т- и В-клеток.

Препарат использовался в птицеводческих хозяйствах для оптимизации обмена веществ, активизации иммунитета и повышения продуктивности. При выпойке препарата с водой птице наблюдали интенсивное наращивание массы цыплят-бройлеров, повышение сохранности поголовья цыплят. Препарат активизирует специфический антителогенез против болезни Ньюкасла у птиц, не выявлено побочного действия на клиническое состояние цыплят-бройлеров. Белковый показатель качества мяса повышается на 3,7%. Таким образом использование иммуномодулирующего препарата способствует улучшению зоотехнических показателей выращивания птицы.

Проведенные производственные испытания исследуемого препарата в животноводческих хозяйствах показали его высокую эффективность как лечебно-профилактического средства при диспепсиях новорожденных телят, диареях неинфекционной этиологии, бронхопневмониях.

Выпаивание новорожденным телятам раствора препарата в течение 3-10 дней в дозе 0,17-0,25 мл/кг способствовало снижению количества заболевших телят в 1,6-4,5 раза и продолжительности болезни в 2-4 раза. Прирост живой массы в опытных группах превосходил контрольных животных на 3,2-6,2 кг в 30-дневном возрасте, в 60-дневном возрасте на 4,4-8,1 кг. Выпаивание препарата в дозе 1 мл в сутки новорожденным телятам является эффективным средством против диареи животных. Сохранность поголовья в опытных группах достигала 90-100%.

Таким образом, описываемый иммуномодулятор не является токсичным, оказывает лечебно-профилактический эффект на живой организм, может эффективно применяться в животноводстве и ветеринарии для воздействия на иммунитет животных, увеличение привесов и повышение сохранности поголовья животных.

Источники информации

1. Биостимулятор Эмистим С.ТУ У 88.264.021 -95.

2. Биостимулятор Агроэмистим-Экстра. ТУ У 24.2-31168762-001-2004.

3. Покровская С.Ф. Пути снижения содержания нитратов в овощах. М.: Агропромиздат, 1990, с.127.

4. Каталог-справочник «Диагностические и оздоровительные технологии восстановительной медицины», Мин-во здравоохранения РФ, 2004, т.1, с.228, 229, 264.

5. «Биологически активная добавка Флоравит Э в гастроэнтерологии», Методические рекомендации / Под ред. академика РАЕН, д.м.н. М.Х.Турьянова, изд-во Российской медицинской академией последипломного образования, 2002.

Изобретения относятся к биотехнологии и к разработкам средств, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Предлагаются новый штамм гриба Penicillium verrucosum ВКПМ F-984 и новое иммуномодулирующее средство на его основе. Штамм выделен из микрофлоры корней женьшеня и поддерживается на среде, содержащей минеральные соли, глюкозу и аспарагин. Мицелий гриба экстрагируют водно-спиртовым раствором (70%-ный раствор этилового спирта), получают экстракт, который обладает стимулирующим действием на клеточный и гуморальный иммунитет, повышает иммунный статус организма. Преимуществом данного средства является его природное происхождение и эффективное стимулирование адаптационных возможностей организма. 2 н и 1 з.п. ф-лы.

1. Штамм гриба Penicillium verrucosum ВКПМ F-984, используемый для получения средства, обладающего иммуномодулирующими свойствами.

2. Средство, обладающее иммуномодулирующими свойствами, характеризующееся тем, что оно получено на основе штамма гриба Penicillium verrucosum ВКПМ F-984.

3. Средство по п.2, отличающееся тем, что оно представляет собой водноспиртовой экстракт мицелия штамма гриба Penicillium verrucosum ВКПМ F-984.