КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Me, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН Российский патент 2010 года по МПК C12N5/09 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцинотерапия является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.

Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-рецепторами антигенных детерминант, избирательно экспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены, как правило, подвергаются процессингу перед их презентацией в контексте молекул гистосовместимости на клеточной поверхности. Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково/тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, PRAME, NY-ESO-1, HOM-MEL-40), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1, TRP-2) и мутированные антигены (MUC-1, CDK4, β-катенин gp100-in4, p15, N-ацетилглюкозоаминтрансфераза V). С иммунологической точки зрения раково/тестикулярные антигены могут быть хорошими мишенями для иммунотерапии опухолей, поскольку в нормальных тканях эта группа антигенов (MAGE и PRAME) не экспрессируется, за исключением ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы из-за отсутствия их прямого контакта с иммунокомпетентными клетками [1] и отсутствия на них экспрессии HLA антигенов I класса [2]. В отличие от раково/тестикулярных антигенов, иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности к этим "своим" антигенам. Однако такой антиген, как Melan-A/MART-1, содержит несколько эпитопов для узнавания ЦТЛ (цитотоксические лимфоциты) и способен индуцировать генерацию меланома-специфичных ЦТЛ.

Таким образом, экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцины, приготовленные на основе опухолевых клеток, являются цельноклеточными вакцинами и представляют собой живые аллогенные или аутологичные опухолевые клетки.

Аутологичные/сингенные цельные опухолевые клетки заключают в себе практически все антигены, экспрессированные опухолью хозяина, что снижает риск появления аллергических реакций на чужеродные неопухолеспецифичные антигены, а также снижается риск контаминации патогенными вирусами и внутриклеточными паразитами. Вакцина, состоящая из нескольких клеточных линий (поливалентная вакцина), содержит широкий спектр опухолевых антигенов и используется как аллогенная. Такая поливалентная вакцина, как вакцина Mortona и соавт. [3], состоит из трех аллогенных меланомных клеточных линий с высокой экспрессией поверхностных иммуногенных глико- и липопротеинов и ганглиозидов. Клинические испытания такой вакцины показали, что развитие иммунного ответа как клеточного, так и гуморального типа на эти антигены коррелировало с повышением выживаемости пациентов. Другая вакцина, «Melacine» [4] (Corixa corp., Canada), состоящая из лизата аллогенных меланомных клеточных линий, вызывает противоопухолевый эффект у 5-10% больных меланомой.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии меланомы человека, несущей определенный набор антигенов, что позволит использовать ее в создании противоопухолевых вакцин.

Технический результат, получаемый при использовании изобретения, выражается в расширении арсенала клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генно-инженерных), что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении злокачественных новообразований.

Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия mel Me из опухолевого образца диссеминированной меланомы кожи человека.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в коллекции клеточных культур Института цитологии РАН под номером РККК(П) 712Д.

Родословная клеточной линии mel Me

Линия клеток получена из опухолевого образца пациента М.М.Е., и/б 02/1902, находившегося на лечении в 2002 г. с диагнозом диссеминированная меланома кожи спины. Опухолевый материал получен при удалении метастатического узла кожи спины. Предыдущее лечение: хирургическое.

Получение клеточной линии mel Me

Опухолевая ткань получена при хирургическом удалении метастазов кожи. Полученную суспензию клеток засевали во флаконы и культивировали в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 20 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии mel Me

Цитограмма культуры mel Me состоит преимущественно из эпителеоподобных клеток мелкого, среднего и крупного размеров. Клетки располагаются группами, небольшими плотными скоплениями и разрозненно. Имеются немногочисленные клетки веретенообразной, отростчатой и вытянутой удлиненной формы. Ядра клеток полиморфные, округлой, овальной, перстневидноподобной и неправильной формы, имеют различный размер, утолщенные края, грубоглыбчатое и зернистое строение хроматина, увеличенные одно или несколько ядрышек. Цитоплазма клеток негомогенная, окрашена в базофильные тона различной степени интенсивности. Часто выявляются митозы (0-6 в поле зрения). Встречаются двухъядерные клетки и единичные гигантские многоядерные клетки.

Кариологическая характеристика клеточной линии mel Me

Дата фиксации клеток: 24.11.05

Культура характеризуется различающимися диаметрами ядер при одной и той же плотности окраски и состоянии хроматина, характерного для интерфазных ядер.

Проанализировано 88 метафаз. Число хромосом в 60 клетках колеблется от 47 до 50. Модальное число хромосом в этих клетках соответствует диплоидному набору (2n). В 28 клетках обнаружен тетраплоидный (4n) набор (около 100 хромосом). Наблюдается трисомия по хромосомам 2 и 7, кольцевая хромосома 15. Обнаружен дополнительный хромосомный материал неизвестного происхождения на обоих плечах хромосомы 1.

Кариотип - 47~50<2n>,XY,der(1)add(1)(p36)add(1)(q43),+2,+7,r(15).

Иммуногенетическое исследование (определение HLA фенотипов (I класс))

А2, А31(19); В58(17), В56(22).

Культуральные свойства mel Me

Клеточная линия mel Me культивируется в питательной среде RPMI (90%), эмбриональной телячьей сывороткой 10%, содержащей антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). В культуральные флаконы объемом 25 см³ в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Монослой клеток формируется через 3-4 дня. При посевной концентрации 70-100 тыс./мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:1. При посевной концентрации 500 тыс./мл индекс пролиферации через 48 часов культивирования составляет 3.6-4.6.

Условия криоконсервации

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания - питательная среда RPMI (80%), эмбриональная телячья сыворотка 20%, 10% ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до минус 25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см³. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Примеры использования клеточной линии mel Me

Пример 1. Культивирование клеточной линии mel Me. Опухолевую ткань, полученную при хирургическом удалении метастазов меланомы кожи, разделяли механически на фрагменты величиной 2-3 мм³ в среде RPMI-1640, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. В культуральные флаконы объемом 25 см³ в 5 мл среды засевали 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar). После 20 пассажа получена стабильно растущая клеточная линия.

Пример 2. Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии mel Me. Полученная клеточная линия mel Me, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, была исследована с помощью методов иммунофлюоресценции, иммуногистохимии, ПЦР (полимеразно-цепной реакции) анализа на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости).

Дифференцировочные меланомные маркеры, определяющие отношение данной линии к меланоме, исследованы нами с помощью моноклональных антител CD63, НМВ45, MelanA, Tyrosinasa, HMW. Раково-тестикулярные маркеры класса MAGE, которые могут быть экспрессированы на опухолях различного гистогенеза, исследованы в реакции ПЦР. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлюоресценции.

Данная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомных (дифференцировочных) маркеров: CD63, MelanA, HMB45, подчеркивающих специфичность данной клеточной линии. Tyrosinasa - отр. Уникальной особенностью данной линии является наличие антигенов гистосовместимости первого и второго класса, что обуславливает повышение иммуногенности за счет представления опухолевых антигенов непосредственно CD4 и CD8 клеткам. Раково-тестикулярные маркеры класса MAGE (А6; А12; А2; A3 и А10 - отсутствуют) (табл.).

Таблица Экспрессия антигенов на клеточной линии mel Me Дифференцировочные антигены Раково-тестикулярные Антигены Антигены гистосовместимости CD63 положит. MAGE отр. HLA (I класс) положит. НМВ45 положит.     HLA-DR(II класс) положит. MelanA положит.         Tyrosinasa отр.        

Таким образом, данная клеточная линия меланомы кожи человека mel Me имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, заключающийся в наличии дифференцировочных антигенов (CD63, MelanA, HMB45) и положительной эксперссии молекул гистосовместимости первого и второго класса; в отсутствии экспрессии антигена Tyrosinasa и раково-тестикулярных маркеров, что позволяет применять полученную клеточную линию для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генно-инженерных), используемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований.

Список литературы

1. Barker C.F. et al. Immunologically privileged sites. ADV. Immunol. 1977, 25:1-54.

2. Tomita Y. et al. Immunohistochemical detection ofintracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and major histocompatibility complex class I antigens in seminoma. J. Urol. 149: 659-663, 1993.

3. Morton DL et al. Ann N Y Acad Sci 1993; 690:120.

4. Sondak V.K. Sosman J.A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine / Semin cancer Biol. 2003. Dec. 13(6): 409-15.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин. Клеточная линия меланомы человека mel Me, используемая для получения противоопухолевых вакцин, обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН под номером РККК (П) 712Д. Изобретение позволяет расширить арсенал клеточных линий меланомы человека, используемых для создания противоопухолевых вакцин, применяемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований. 1 табл.

Клеточная линия меланомы человека mel Me, используемая для получения противоопухолевых вакцин, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН под номером РККК (П) 712Д.