СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОСОМНЫХ КОМПОНЕНТОВ В БИОЦИДНЫХ КОМПОЗИЦИЯХ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/15 G01N21/00 A61K9/127 A01N25/26 A01N33/12 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам анализа липосомных препаратов. В частности, к способам определения содержания компонентов, формирующих липосомный комплекс в биоцидных препаратах.

Более конкретно изобретение предлагает способ определения содержания компонента, формирующего липосомы, входящего в состав биоцидной композиции, в которой содержится четвертичное аммонийное основание или его производные в форме солей или клатрата.

Способ предназначен для технологического контроля производства и для оценки качества продукции, в состав которой входят сфинголипиды, такие как цереброзид и его производные.

Уровень техники

Современное развитие фармацевтики предполагает представление на рынке множества препаратов в липосомной форме. Если вид конкретного препарата, который можно вводить в липосомы, практически неограничен, то номенклатура веществ, которые можно эффективно использовать в качестве основы, формирующей липосомы или мицеллы, достаточно ограничена.

Вещества, формирующие липосомы, их строение и свойства описаны в уровне технике.

Впервые липосомы были получены из фосфолипидов. По своему химическому строению фосфолипиды относятся к группе амфифильных соединений, молекулы которых состоят из гидрофильной и гидрофобной частей. Это обеспечивает способность фосфолипидов образовывать в воде мембраны, которые представляют собой двойной слой липидных молекул, обычно называемый просто липидным бислоем. Из-за тенденции к минимизации свободной энергии бислой липидов может замыкаться, образуя полые оболочечные структуры. Эти структуры могут быть многослойными и их обычно называют мультиламеллярными везикулами (МЛВ). Они состоят из нескольких десятков, а то и сотен липидных бислоев, разделенных водными промежутками, и имеют довольно крупные размеры (до 50 мкм). Маленькие везикулы (около 20 нм), образованные одним липидным бислоем, называются малыми моноламеллярными везикулами (ММВ). В промежутке указанных размеров лежит множество разнообразных липосомных структур, различающихся размерами, формой, числом липидных бислоев и внутренним устройством.

Липосомы могут не только формировать глобулярные формы, но и могут принимать дискообразную форму, иногда называемую "дискомы", или образовывать конструкции в виде трубок, которые называют тубулярными липосомами.

Липосомы могут быть однослойными и многослойными. У однослойных стенка представлена одним концентрическим бислоем. В зависимости от размера однослойные липосомы, в свою очередь, делятся на малые однослойные липосомы (МОЛ) - диаметром до 50 нм, и большие однослойные липосомы (БОЛ) - диаметром от 50 до 300 нм.

Многослойные (МСЛ) липосомы имеют внутри наружного концентрического бислоя внутренние меньшие по размеру липосомы. Внутри вторичной липосомы могут быть липосомы третьего, а в них и четвертого порядка.

Размеры липосом могут варьировать в широких пределах - от 250-300 Ангстрем - для однослойных, и до 5-50 мкм - для многослойных.

С учетом того, что в настоящее время создается и производится большое число препаратов в липосомной форме, существует объективная необходимость контроля состава подобных препаратов.

Обязательными методами контроля липосомных форм лекарственных средств является определение следующих параметров: содержание включенного в липосомы вещества, размер липосом, содержание липидных компонентов, а также традиционные параметры, как значение рН, мутность, стерильность, пирогенность и т.п., нормированными требованиями, как, например, к препаратам медицинского, ветеринарного, косметического назначения.

Если способы контроля действующего вещества, которое включается в липосомы, как правило, не вызывают затруднений, то в отношении способов контроля липосом, в частности определения содержания компонента, формирующего липидную оболочку, имеются объективные трудности.

В первую очередь следует отметить, что для получения липосом в промышленном масштабе используются, как правило, не чистые синтезированные соединения, а смеси, полученные из природных источников, таких как мембраны клеток различного происхождения. Поэтому в состав препаратов, из которых формируется липосома, входят различные соединения, типичными представителями которых являются цереброзиды (углеводсодержащие сфинголипиды). Эти соединения находятся, главным образом, в нервной ткани, особенно в миелиновой оболочке нервных волокон, а также встречаются и в других тканях и органах. На практике цереброзиды выделяют экстракцией из мозговой ткани с очисткой от нейтральных липидов. К цереброзидам относятся керазин, френозин, нервон и оксинервон. Они отличаются структурой жирной кислоты: керазин содержит лигноцериновую (тетракозановую) кислоту; нервон - нервоновую кислоту; оксинервон - оксинервоновую кислоту, френозин - цереброновую кислоту. Кроме цереброзидов в нервной ткани присутствует цереброзид сульфат, который характеризуется наличием сульфоэфирной группы. При гидролизе цереброзиды дают сфингозиновое основание, жирную кислоту и гексозу, в частности галактозу (Преображенский Н.А., Евстигнеева Р.П. Химия биологически активных природных соединений. М.: Химия, 1974. - 456 с.).

Для анализа цереброзидов как их общего содержания в образце, так и для определения отдельных соединений, традиционно используют тонкослойную хроматографию на силикагеле (Кейтс М. Техника липидологии. - М.: Мир, 1975. - 324 с.).

Однако данный метод малопригоден для применения в технологическом процессе из-за длительности анализа, а также из-за возможности искажения результатов анализа из-за присутствия других веществ, входящих в состав анализируемого препарата. Кроме того, низкие концентрации компонентов, образующих липосомы, в препаратах, предполагают применения стадии концентрирования, если анализируется жидкая проба. Все вышеуказанное предполагает длительность и трудоемкость проведения анализа.

В этой связи имеется объективная необходимость в разработке нового способа анализа, позволяющего количественно определять содержание компонентов, образующих липосомы, в фармацевтических препаратах, содержащих помимо липосом биологически активные компоненты, без их разделения и предварительного обогащения проб. В частности, до настоящего времени отсутствовала методика определения компонентов, образующих липосомы, в композициях, содержащих четвертичные аммонийные основания (ЧАС). ЧАС, проявляя свойства поверхностно-активных веществ, существенно осложняют применение хроматографических способов. В этой связи традиционные подходы предполагали предварительное разделение компонентов, для того чтобы исключить влияние ЧАС на результаты анализа.

Поэтому целью настоящего изобретения явилось создание способа определения компонентов, формирующих липосомы, на фоне высокоактивных четвертичных аммонийных оснований (ЧАС).

Раскрытие изобретения

Авторами настоящего изобретения предложено применение цветной количественной реакции, которая характеризуется высокой чувствительностью, простотой выполнения и экспрессностью, достаточной для применения ее в технологическом процессе и для контроля качества препаратов.

Так как общим структурным элементом цереброзидов является галактоза, то авторы применили орциновый метод, основанный на колориметрической реакции орцина (5-метил-1,3-дигидроксибензола) с цереброзидами. Эта реакция характеризуется высокой чувствительностью и легко адаптируется под нужды технологического контроля.

Авторы установили, что присутствие ЧАС, такого как дидецилдиметиламмоний бромида в форме его клатрата с мочевиной, в количествах, близких и даже выше, чем содержание цереброзидов в анализируемой смеси, вызывает дополнительное окрашивание на уровне приблизительно 20% от уровня окраски чистого цереброзида. Такой низкий уровень окраски предполагает, что на фоне ЧАС можно проводить определение цереброзидов.

Сущность способа состоит в том, что получают пробу сухого (или высушенного) образца, в котором необходимо определить общее содержание сфинголипидов. Затем образец растворяют в концентрированной фосфорной кислоте при повышенной температуре до полного растворения пробы. После охлаждения к полученному раствору добавляют орциновый реактив. Этот раствор помещают на водяную баню и приблизительно через 20 минут развивается характерная окраска раствора. Для количественного анализа определяют оптическое поглощение на длине волны от приблизительно 500 до приблизительно 560 нм, предпочтительно на 505 нм.

В качестве контроля (раствор сравнения) обычно используется контрольная проба, в которой отсутствуют цереброзиды. С учетом того, что ЧАС и другие компоненты, входящие в состав липосомного препарата, могут давать окраску в орциновой реакции, дополнительно проводят анализ смеси, в которой присутствуют все другие компоненты, за исключением компонентов, образующих липосомную оболочку.

Для калибровки используют ряд разведений препарата, содержащего цереброзиды, который использовался для получения липосом.

Оптическая плотность (поглощение) при длине волны 505 нм линейно зависит от концентрации цереброзида или галактозы, что было установлено в отдельных экспериментах, представленных в примерах. При этом калибровка характеризуется наличием линейной зависимости в интервале анализируемых масс цереброзидов от 20 до 500 мкг в пробе, что соответствует количеству галактозы от 4,2 до 105 мкг в пробе.

Линейное регрессионное уравнение при калибровке описывается функцией:

D=aC+b,

где D - оптическая плотность (поглощение) при 505 нм;

C - концентрация компонентов, образующих липосомную оболочку;

a - тангенс угла наклона калибровочной прямой;

b - свободный член калибровочной прямой.

С учетом поправки, т.е. оптической плотности, полученной при анализе пробы, содержащей все компоненты композиции, за исключением компонентов, формирующих липосомы, концентрация компонентов, формирующих липосомы в композиции, рассчитывается по формуле:

C=(Y-Z-b)/a,

где С - концентрация компонентов в композиции, формирующих липосомы, мг/мл;

Y - оптическая плотность, полученная при анализе пробы композиции;

Z - оптическая плотность, полученная при анализе пробы, содержащей все компоненты композиции, за исключением компонентов, формирующих липосомы;

a - тангенс угла наклона калибровочной прямой;

b - свободный член калибровочной прямой.

Для иллюстрации настоящего изобретения представлены нижеследующие примеры.

Пример 1

Типовой состав жидкой композиции:

клатрат дидецилдиметиламмония бромида с карбамидом - 0,2%;

сфингосом (препарат для формирования липосом, содержащий около 57% цереброзидов по массе) - 0,02% (по сухому веществу);

аллантоин - 0,2%;

консервант - 0,2%;

вода дистиллированная - до 100%.

Все проценты указаны как массовые проценты.

Композиция представляет собой бесцветную, слегка опалесцирующую жидкость, где клатрат дидецилдиметиламмония бромида с карбамидом включен в липосомы, сформированные из препарата сфингосом.

Пример 2

Анализ пробы

Один миллилитр анализируемого раствора упаривают, если образец представляет собой раствор, и осадок или сухую пробу растворяют в 2 мл 85% фосфорной кислоты. Смесь перемешивают и нагревают 15 минут при 90°С для растворения в кислоте. Далее пробу (или пробы) охлаждают до комнатной температуры и добавляют по 4 мл 0,2% орцинового реактива (0,4 г орцина в 200 мл концентрированной серной кислоты).

После перемешивания пробы помещают в водяную баню при 80°С на 20 минут для развития окраски, причем все пробы проходят идентичный температурно-временной режим. После охлаждения до комнатной температуры в пробах определяют поглощение при длине волны 505 нм на спектрофотометре. При этом можно использовать шкалу в относительных единицах.

Контрольная проба (которая используется как раствор сравнения в спектрофотометре) содержит 2 мл 85% фосфорной кислоты и 4 мл орцинового реактива.

Пример 3

Получение калибровочных зависимостей и оценка линейности зависимости оптической плотности проб от концентрации чистых веществ

Таблица 1
Анализ проб галактозы Масса галактозы в пробе, мкг Среднее значение оптической плотности, D 505 20 0,0586 60 0,1029 80 0,1352 100 0,1639

Как видно из данных таблицы 1, имеет место линейная зависимость оптической плотности от количества галактозы.

Таблица 2
Анализ проб цереброзида Масса цереброзидов в пробе, мкг Расчетное количество галактозы в пробе, мкг Среднее значение оптической плотности, D 505 Первый диапазон концентраций 20 4,2 -0,0149 40 8,4 0,0108 60 12,6 0,02785 80 16,8 0,0598 100 21 0,083 Второй диапазон концентраций 100 21 0,0545 200 42 0,13795 300 63 0,2818 400 84 0,4242 500 105 0,57755

Данные этого примера показывают, что имеет место линейная зависимость оптической плотности от концентрации анализируемого вещества в пробе в широком интервале значений концентраций, и калибровку можно осуществлять как по цереброзиду или галактозе, исходя из того, что расчетное содержание галактозы в цереброзиде составляет 22%. Это значение также следует из численных значений, представленных в таблицах 1 и 2.

При оценке содержания цереброзидов в препарате сфингосом было получено значение 57% (по сухому веществу). Следует иметь в виду, что исходный препарат сфингосом, используемый для получения композиции, представленной в примере 1, содержит 1% сухого вещества.

Пример 4

Определение содержания сфингосом (цереброзидов) в липосомной композиции

Сначала была приготовлена композиция по прописи примера 1, но в которой отсутствовал компонент, ответственный за образование липосом (сфингосом).

В результате проведения анализа по методике, представленной в примере 2, определено, что оптическая плотность такой композиции составила 0,050. Это значение используется как параметр Z для расчета содержания сфингосом в композиции полного состава.

Анализ композиции, имеющей состав по примеру 1, проводили по методике, описанной в примере 2. Среднее значение оптической плотности составило 0,240. Это значение используется как параметр Y для расчета содержания сфингосом.

Калибровочная зависимость, построенная по исходному жидкому препарату сфингосом, который использовался для получения композиции, представленной в примере 1, описывается следующим линейным уравнением:

D = 0,7134·C + 0,0416,

где D - оптическая плотность при 505 нм;

С - концентрация препарата сфингосом, мг/мл.

Расчет содержания препарата сфингосом в композиции по примеру 1:

C=(Y-Z-b)/a = (0,240-0,050-0,0416)/0,7134=0,208 мг препарата сфингосом в 1 мл композиции, что соответствует 2,08% исходного препарата сфингосом в данном образце композиции.

В пересчете на сухое вещество сфингосом, его концентрация составила около 0,02%, что согласуется с исходной прописью композиции, представленной в примере 1.

Изобретение относится к области фармации, а именно к способам анализа липосомных препаратов. Предложен способ определения содержания липидных компонентов на основе цереброзидов или цереброзид сульфатов, образующих липосомы в биоцидных композициях, с использованием орциновой реакции. Способ позволяет проводить анализ компонентов, таких как цереброзид и его производные, на фоне четвертичных аммонийных оснований. 4 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ определения содержания липидных компонентов на основе цереброзидов или цереброзид сульфатов, образующих липосомы в биоцидных композициях, включающий стадии:
(i) проведения орциновой реакции с пробой анализируемой биоцидной композиции с определением оптической плотности пробы в результате указанной реакции;
(ii) проведение калибровки при помощи орциновой реакции с получением линейного уравнения зависимости оптической плотности проб от концентрации липидных компонентов на основе цереброзидов или цереброзид сульфатов, которые использовались для получения липосом в анализируемой композиции, в интервале от 20 до 500 мкг в пробе, вида D=аС+b,
где D - оптическая плотность при 505 нм,
С - концентрация липидных компонентов на основе цереброзидов или цереброзид сульфатов,
а - тангенс угла наклона калибровочной прямой,
b - свободный член калибровочной прямой;
(iii) проведение орциновой реакции с пробой композиции, имеющей состав, идентичный составу анализируемой композиции, за исключением того, что в указанной композиции отсутствуют липидные компоненты на основе цереброзидов или цереброзид сульфатов и определение ее оптической плотности;
(iv) определение содержания липидных компонентов на основе цереброзидов или цереброзид сульфатов, образующих липосомы в анализируемой композиции по формуле
C=(Y-Z-b)/a,
где С - концентрация липидных компонентов на основе цереброзидов или цереброзид сульфатов, которые использовались для получения липосом в анализируемой биоцидной композиции,
Y - оптическая плотность пробы, определенная на стадии (i),
Z - оптическая плотность пробы, определенная на стадии (iii),
а - тангенс угла наклона калибровочной прямой, определенный на стадии (ii),
b - свободный член калибровочной прямой, определенный на стадии (ii).

2. Способ по п.1, где анализируемая проба представляет собой сухую пробу, полученную путем упаривания анализируемого раствора.

3. Способ по п.1, где орциновая реакция на стадии (i) и (iii) включает следующие операции:
растворение пробы в 85% фосфорной кислоте;
нагрев полученной смеси в течение 15 мин при 90°С для растворения всех компонентов;
охлаждение пробы до комнатной температуры и выдерживание пробы в течение 15 мин;
добавление орцинового реактива из расчета 2 мл реактива на 1 мл охлажденной пробы;
термостатирование полученной смеси пробы и орцинового реактива при 80°С в течение 20 мин;
охлаждение смеси до комнатной температуры;
измерение поглощения смеси при длине волны 505 нм на спектрофотометре.

4. Способ по п.3, где в качестве раствора сравнения при измерении поглощения используют раствор, содержащий один объем 85% фосфорной кислоты и два объема орцинового реактива.

5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где орциновый реактив представляет собой раствор, содержащий 0,2 г орцина на 100 мл концентрированной серной кислоты.