СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМБИНИРОВАННОГО ЛИПОСОМАЛЬНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2009 года по МПК A61K9/127 A61K31/7036 C07H15/236 A61K31/496 

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к проблеме создания новых липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения и профилактики особо опасных инфекционных заболеваний.

Проблемы, связанные с непосредственным использованием лекарств в фармакологии и медицине, могут быть разрешены путем использования систем переносчиков (Макаров К.А., Кибардин С.А. Иммобилизованные биопрепараты в медицине. - М.: Медицина. - 1980. - 128 С.).

На сегодняшний день липосомы представляются наиболее многообещающими по сравнению с другими возможными переносчиками не только потому, что они биодеградируемы, а также из-за уникальных свойств как носителей лекарственных веществ, позволяющих включать в их внутреннее водное пространство водорастворимые, а в липидный бислой - водонерастворимые препараты, целенаправленно доставлять их в нужные области организма, снижать их токсичность и продлевать действие, предохраняя препараты от воздействия агрессивной физиологической среды (Грегориадис Г., Аллисон Л. Липосомы в биологических системах. - М.: Медицина. - 1983. - С.36-39, Саатов Т.С., Исаев Э.И., Бурханов С.А. Аутологические липосомы // Вестник Акад. мед. наук СССР. - 1990. - №8. - С.47-50).

Особый интерес представляют липосомы как переносчики антибактериальных препаратов (Ротов К.А., Васильев В.П., Антонов Ю.В. Получение и характеристика липосом, содержащих антибиотики // Микробиол. Журн. -1989. - Т.51. - №6. - С.79-82). Антибиотик в основном концентрируется в паренхиматозных органах (печени, селезенке), легких и, кроме того, доставка препарата путем эндоцитоза непосредственно в лизосомы уменьшает его инактивацию и позволяет оптимизировать антимикробное действие. Это приобретает особо важное значение для лечения и профилактики таких инфекций, как сап и мелиоидоз, возбудители которых находятся внутри фиксированных макрофагов.

Рядом авторов (Тихонов Н.Г., Ротов К.А., Перепелкин А.И. Липосомальные антибиотики и их использование при лечении особо опасных инфекционных заболеваний // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье: Сб. научн. трудов ВолгНИПЧИ. - Волгоград, 2000. - С.291-301., Ротов К.А., Тихонов С.Н., Храпова Н.П., Алексеев В.В., Снатенков Е.А. Оценка эффективности лечения легочной формы острого мелиоидоза липосомальным цефазолином в эксперименте // Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - Вып.93. - №1. - С.93-94) было отмечено, что иммобилизация антибиотиков в липосомы позволила значительно повысить эффективность лечения сапной и мелиоидозной инфекций в эксперименте в сравнении со свободными формами антимикробных препаратов. Показана возможность применения липосомального гентамицина сульфата, доксициклина для профилактики мелиоидозной и сапной инфекций в эксперименте (Ротов К.А., Снатенков Е.А., Алексеев В.В., Храпова Н.П. Возможность применения липосомального гентамицина сульфата для профилактики мелиоидозной инфекции в эксперименте // Санитарная охрана территорий государств - участников содружества независимых государств - проблемы биологической безопасности противодействия биотерроризму в современных условиях. Мат. междунар. научн.-практ. конфер. (13-14 сентября 2005). - Волгоград, 2005. - С.148-149., Рогов К.А., Снатенков Е.А., Замарин А.А., Тихонов С.Н., Храпова Н.П., Алексеев В.В. Протективность липосомального доксициклина при экспериментальной сапной инфекции // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Матер. Российской научн.-практ. конф. (21-22 марта 2007 г.), г.Ставрополь 2007. - С.67-68).

Вместе с тем проблема экстренной профилактики и лечения особо опасных инфекционных заболеваний разработана недостаточно.

Приготовление липосом методом «ручного» встряхивания: 100 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 50 мл хлороформа в 200 мл круглодонной колбе для роторного испарителя и при пониженном давлении проводили выпаривание органического растворителя. Время окончания выпаривания определяли по исчезновению запаха хлороформа в колбе, при этом на ее стенках образовывалась тонкая пленка липидов. Снятую с роторного испарителя колбу продували газообразным азотом для предотвращения окисления липидов и затем вносили 5 мл, содержащих 28,5 мг гентамицина сульфата в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2. После 2 часовой инкубации при комнатной температуре смеси для образования гомогенной суспензии липосом в колбу помещали несколько стеклянных бусинок и энергично встряхивали в течение 5 минут. Невключившийся антибиотик удаляли центрифугированием. Мягкие условия приготовления и большие размеры липосом позволяют использовать этот метод для включения крупных биологических макромолекул без значительной потери активности. Недостатком метода является низкий процент включения материала (1-3%) (Acuto О., Pugliese О., Muler М., Tosi R. Preparation of liposomes incorporating membrane components from human lymphoid cells // Tissue Antigenes. - 1979. - V.14, №5. - P.385-397).

Приготовление мелких моноламеллярных липосом методом ультразвуковой обработкой: взвесь липосом, полученную по методу, описанному выше, переносят в сосуд для ультразвуковой обработки и производят озвучивание в атмосфере азота. Режим озвучивания: частота - 20 кГц; мощность - 200 Вт; экспозиция - 30 мин. Для предотвращения разогрева взвеси липосом применяют ледяную баню. В процессе озвучивания происходит просветление взвеси липосом. По окончанию обработки препарат представляет собой прозрачную жидкость, опалесцирующую при боковом освещении. Образуются очень мелкие, однородные по размеру 20-200 Å моноламеллярные липосомы. Включение материала не превышает 1,5%. Данным способом можно включать низкомолекулярные вещества, устойчивые к ультразвуку. В основном он применяется в биофизических исследованиях мембран (Papahadjopoulos D., Wotkins J.C. Phospholipid model membrynes. II. Permeabilyti properties of hydrated liguid crystals. - Biochim. et biophys. Acta, 1967, vol. 135, p.639-652).

Наиболее близким аналогом является метод получения липосом, предложенный Szoka F., Papahandjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal space and high capture by reverse-phase evaporation // Proc. Nat. Sci. USA. - 1978. - V.75, N 9. - P.4194-4198. Согласно методу 30 мг липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 3 мл смеси эфира с хлороформом 2:1 и вносят в круглодонную колбу роторного испарителя объемом 100 см³. 1 мл раствора включаемого материала (гентамицина сульфат - 28,5 мг) в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 добавляют к раствору липидов в органической фазе и обработкой ультразвуком 20 кГц, мощностью 200 Вт в течение 5 минут достигают образования эмульсии типа «вода в масле». Колбу с эмульсией присоединяют к роторному испарителю, и постепенно понижая давление так, чтобы не происходило кипение, полностью удаляют органический растворитель. Об окончании выпаривания судят по образованию геля в колбе и исчезновению запаха органического растворителя. В процессе выпаривания поддерживают температуру смеси выше температуры фазового перехода фосфолипидов (20-25°С). Колбу снимают с испарителя, к образовавшемуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,5 и встряхивают до образования гомогенной суспензии липосом. Липосомы, полученные данным методом, характеризуются высокой эффективностью включения - до 50-60% и большими размерами - до 1,0-1,2 мкм. Невключившийся материал удаляют центрифугированием. Недостатком является малая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле», вследствие чего в каждом конкретном случае требуется подбор состава липидной смеси, техники выпаривания и навыка в работе, использование смеси растворителей с разной температурой кипения, что приводит к неоднородному образованию фосфолипидных везикул (температура кипения эфира +34,5°С, температура кипения хлороформа +61,2°С), а также токсическое воздействие ионов титана на антигенный материал и фосфолипиды (Г. Грегориадис, А. Аллисон. Липосомы в биологических системах. - М.: Медицина. - 1983. - С.28-29).

Целью изобретения является получение комбинированного липосомального антибактериального препарата, содержащего в мембране водонерастворимый рифампицин, во внутреннем объеме - гентамицина сульфат.

Поставленная цель достигается тем, что вследствие увеличения липидной нагрузки происходит встраивание рифампицина в мембрану липосом, повышается ее стабильность и возрастает процент инкапсуляции гентамицина сульфата. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на антибактериальные препараты и фосфолипиды. Для этого 63,3-50,1 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 4,3-3,8 мл хлороформа и смешивали с 1,0-0,5 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 6,0-3,0 мг антибиотика. 28,5-7,125 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе и обработкой на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин достигали образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Отделение невключившихся антибиотиков проводили центрифугированием при 40000 g в течение 1 ч на центрифуге «Ja-21» «Bechman» (США). В супернатанте определяли радиоизотопным методом по двум меткам ¹²⁵I-рифампицин и ¹⁴С-гентамицина сульфат.

Увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) и сократить время обработки.

Добавлением к хлороформенной смеси липидов рифампицина в органической фазе и увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Это позволило встроить в мембрану антибиотик. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) и сократить время обработки. Данный способ позволяет встроить в мембрану 50% рифампицина и инкапсулировать внутрь липосом 70% гентамицина сульфата.

Примеры конкретного выполнения:

Пример 1. Получение липосом с высоким содержанием в мембране рифампицина и внутри везикул гентамицина сульфата

Предлагаемая дозировка может найти применение для создания максимальных концентраций антибактериальных средств в среде макроорганизма.

Для этого 63,3 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 4,3 мл хлороформа и смешивали с 2,0 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 6 мг антибиотика. 28,5 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе и обработкой на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин достигали образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Отделение невключившихся антибиотиков проводили центрифугированием при 40000 g в течение 1 ч на центрифуге «Ja-21» «Bechman» (США). Процент иммобилизации антибиотиков определяли радиоизотопным методом. Он составлял 50% для рифампицина и 70% для гентамицина сульфата. Размеры липосомального препарата при электронно-микроскопическом исследовании составляли 600-800 нм (чертеж). Степень окисления липидов мембраны липосом составляла 0,8±0,02 (перекисный индекс Клейна) (Klein R.A. The detection of oxidation in liposome preparations // Biochim. Biophys. Acta. - 1970. - N 21. - P.486-489).

Пример 2. Получение липосом с низким содержанием в мембране рифампицина и внутри везикул гентамицина сульфата

Предлагаемые дозы антимикробных препаратов можно использовать в качестве последующего поддерживающего лечения.

Для получения липосом 50,1 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 3,8 мл хлороформа и смешивали с 0,5 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 1,5 мг антибиотика. 7,125 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе. Далее методика приготовления препарата идентична указанной в примере 1.

Таким образом, добавлением к хлороформенной смеси липидов рифампицина в органической фазе и увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Это позволило встроить в мембрану антибиотик. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на мембрану липосом и антибактериальные препараты и сократить время обработки. Данный способ позволяет встроить в мембрану 50% рифампицина и инкапсулировать внутрь липосом 70% гентамицина сульфата.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу получения липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения и профилактики особо опасных инфекционных заболеваний. Основу способа составляет: растворение навесок липидов и рифампицина в хлороформе, приготовление раствора гентамицина сульфата, создание эмульсии из хлороформенного раствора липидов с рифампицином, получение липосом выпариванием с обращением фаз, удаление невключившихся в мембрану рифампицина и внутрь везикул гентамицина сульфата центрифугированием, отличающийся тем, что при получении липосом добавлением к хлороформенной смеси липидов рифампицина в органической фазе и увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле», это позволило встроить в мембрану антибиотик. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере исключает токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на мембрану липосом и антибактериальные препараты, сокращает время обработки. 1 ил.

Способ получения комбинированного липосомального антибактериального препарата, включающий растворение навесок липидов и антибактериального препарата в хлороформе, приготовление раствора включаемого препарата, создание эмульсии из органического раствора и растворенного препарата и последующего получения липосом выпариванием с обращением фаз, отличающийся тем, что для получения липосом, содержащих водо- и жирорастворимые антибактериальные средства, увеличивают липидную нагрузку и применяют только один органический растворитель с определенной температурой кипения, для этого 63,3-50,1 мг смеси липидов (фосфатидил-холин, холестерин в соотношении 7:3) растворяют в 4,3-3,8 мл хлороформа и смешивают с 1,0-0,5 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 6,0-3,0 мг антибиотика, затем 28,5-7,125 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляют к раствору липидов в органической фазе, и обрабатывают на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин до достижения образования эмульсии, после чего понижают давление в роторном испарителе и полностью удаляют органический растворитель и к образовавшемуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивают в колбе на роторном испарителе, отделяют невключившиеся антибактериальные средства центрифугированием при 40000 g в течение 1 ч, полученный препарат липосом контролируют по размеру, проценту иммобилизации антибактериального средства и степени окисления липидов мембраны липосом.