СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ Российский патент 1997 года по МПК A61K9/127 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может найти применение при получении липосом, в частности липосом, содержащих терапевтические вещества.

Липосомы искусственные фосфолипидные везикулы являются универсальным контейнером для доставки лекарственных препаратов непосредственно в клетку. Они защищают включенное соединение от разрушающего действия ферментов плазмы, снижают токсичность инкапсулируемых веществ и пролонгируют их действие в организме. Методы получения существенным образом влияют на свойства липосом. От технологии приготовления зависит размер везикул, степень окисления липидов (ПОЛ), входящих в состав оболочки (липосомы с высоким соединением продуктов ПОЛ могут быть токсичными для организма), их внутренний объем, стабильность при хранении и др. свойства.

Одним из основных требований, предъявляемым к препаратам для внутривенного введения, является мелкий размер частиц (менее 1 мкм, желательно менее 0,5 мкм). Это обусловлено тем, что крупные частицы вызывают эмболию мелких кровеносных сосудов.

Известен способ получения липосом [1] путем многократной экструзии суспензии липидов через поликарбонатные фильтры диаметром 25 мм и с размером пор от 200 до 30 нм под давлением азота около 800 фунт/дюйм² (около 54 ати) и при температуре выше температуры фазового перехода наиболее тугоплавкого компонента, то есть до 85^oC. При этом получают липосомы диаметром 0,120-0,035 мкм.

Недостатком способа [1] является тот факт, что экструзия при температуре выше 40^oС приводит к перекисному окислению липидов, что нежелательно.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому способу является способ [2] получения липосом, возможно содержащих терапевтическое или диагностическое вещество, включающий растворение веществ, способных образовывать липидные везикулы, в органическом растворителе, высушивание полученного раствора с образованием липидной пленки, ресуспендирование липидной пленки в дисперсионной среде или в растворе терапевтического или диагностического вещества и диспергирование суспендированных липидов в микроэмульсию путем пропускания суспензии через микрощель при перепаде давления от 12000 до 8000 фунт/дюйм² (или от 840 до 560 ати). При этом получают липосомы с диаметром менее 0,2 мкм. Липосомы, полученные способом [2] предназначены для диагностики и изучения опухолей человека. Они содержат радионуклеиды, антибиотики и противораковые препараты.

Недостатком способа [2] является слишком высокое давление, при котором происходит диспергирование липидов в микроэмульсию. По нашим данным (см. контрольный пример 4) подъем давления до 400-450 ати уже приводит к заметному увеличению степени окисленности получаемых липосом.

Целью предполагаемого изобретения является получение липосом с диаметром частиц менее 0,5 мкм, характеризующихся низкой степенью перекисного окисления липидов.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения липосом, включающем растворение веществ, способных образовывать липидные везикулы, в органическом растворителе, высушивание полученного раствора с образованием липидной пленки, ресуспендирование липидной пленки в дисперсионной среде и диспергирование суспендированных липидов в микроэмульсию пропусканием суспензии через микрощель при перепаде давления, диспергирование в микроэмульсию проводят при перепаде давления от 50-300 ати до нормального.

В качестве дисперсионной среды может быть использована вода или водные растворы терапевтических лекарственных средств. В последнем случае полученные липосомы содержат терапевтические вещества.

В качестве терапевтических веществ могут быть использованы цитостатики, такие как циклофосфан, свободный от стромы гемоглобин, цитохром C, DL-α-токоферол, иммуномодуляторы (тимоген, тималин, ганглиин), полиненасыщенные жирные кислоты из морских животных и другие препараты. При этом соотношение липидсодержащих компонентов и терапевтических препаратов варьируется от 5800:1 до 1:5.

В качестве липидных веществ используются лецитины растительного происхождения (например, соевый лецитин или гидрированный на 50% соевый лецитин), лецитины животного происхождения (из икры морского ежа, яичный), а также отрицательно заряженный фосфолипидный компонент (ОЗФК), то есть смесь кислых фосфолипидов, выделяемая из соевых фосфатидов как единый компонент. Липидные вещества могут также включать холестерин, токоферол и др.

Диспергирование проводили на гомогенизаторе марки Manton-Gaulin, модель 15M-8TA, подобном тому, который использовали в способе [2]
Заявляемый способ далее иллюстрируется примерами.

Пример 1. 68 мл 10%-ного раствора мембранообразующих компонентов, а именно соевого лецитина, холестерина, ОЗФК при соотношении компонентов 15:5:2, в хлороформе высушивали в круглодонной колбе на роторном испарителе до образования пленки, которую дополнительно высушивали 10 часов в вакуумном эксикаторе. К полученной пленке добавляли в качестве дисперсионной среды 300 мл сорбитфосфатного буфера (pH 7,5), содержимое перемешивали при 35-40^oC до полного смывания пленки. Полученную грубую липосомальную суспензию диспергировали на гомогенизаторе высокого давления Manton-Gaulin в течение 5 минут при перепаде давлений от 50 ати до нормального (число циклов гомогенизирования 10). Тонкодисперсную однородную липосомальную эмульсию стерилизовали фильтрацией, разливали во флаконы и укупоривали.

Полученная эмульсия липосом исследовалась по следующим параметрам. Дисперсность липосом определяли методом спектротурбидиметрии. Для контроля перекисного окисления липидов (ПОЛ) использовали "индекс Клейна" или индекс окисленности. Промежуточные соединения при ПОЛ, диеновые коньюгаты (ДК) определяли спектрофотометрическим методом. Вторичные продукты ПОЛ, малоновый диальдегид (МДА) определяли с помощью теста тиобарбитуровой кислоты. Кислотность среды (pH) измеряли на pH-метре. Результаты испытания липосомальной эмульсии приведены в таблице 1.

Пример 2. Липосомы получали как в примере 1, но грубую липосомальную суспензию диспергировали на гомогенизаторе в течение 5 минут (10 циклов) при перепаде давления от 210 ати до нормального.

Исследование физико-химических характеристик полученной эмульсии липосом проводили как в примере 1. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 3. 68 мл 10%-ного раствора гидрированного на 50% соевого лецитина, холестерина и ОЗФК при соотношении компонентов 15:5:2 в хлороформе высушивали до образования пленки. К полученной пленке добавляли 300 мл фосфатного буфера, перемешивали при 35-40^oC до смывания пленки, диспергировали на гомогенизаторе в течение 3 минут (6 циклов гомогенизирования) при перепаде давлений от 300 ати до нормального и стерилизовали.

Физико-химические характеристики эмульсии липосом представлены в таблице 1.

Пример 4 (контрольный). Раствор мембранообразующих компонентов, аналогичных по составу таковым в примере 1, высушивали до образования пленки, добавляли сорбитфосфатный буфер, перемешивали при 35-40^oC до смывания пленки и диспергировали в течение 5 минут (10 циклов гомогенизирования) при перепаде давления от 450 ати до нормального. Липосомальную эмульсию стерилизовали фильтрацией и исследовали как в примере 1. Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, диаметр полученных везикул составляет не более 0,3 мкм при гомогенизировании в пределах перепада давлений 50-300 ати, при увеличении давления до 450 ати средний размер липосом уменьшается до 0,02 мкм, но при этом наблюдается рост продуктов ПОЛ.

Пример 5. Раствор мембранообразующих компонентов как в примере 1 высушивали до образования пленки. К полученной пленке добавляли 300 мл 10%-ного раствора циклофосфана в сорбитфосфатном буфере при соотношении липидсодержащих компонентов и циклофосфана 2,3:1. Содержимое перемешивали при 35^oC до полного смывания пленки и диспергировали на гомогенизаторе при перепаде давлений от 220 ати до нормального в течение 3 минут (6 циклов гомогенизирования). Отделение наполненных липосом от невключившегося в липосомы циклофосфана и замену дисперсионной среды на сорбитфосфатный буфер проводили методом ультрафильтрации через мембраны типа Халипор 3-20000 при давлении азота 0,5 ати. Отмытые липосомы стерилизовали фильтрацией через фильтр "Миллипор" (d= 0,22 мкм). Количественное определение содержания циклофосфана в липосомальной суспензии проводили согласно Государственной Фармакопее X роданометрическим методом после разрушения липосом тритоном X-100.

Результаты изучения физико-химических характеристик липосом с циклофосфаном представлены в таблице 2.

Пример 6. 68 мл 10%-ного раствора в хлороформе гидрированного на 50% соевого лецитина, холестерина, ОЗФК и DL-a-токоферола при соотношении компонентов 87: 25:12:1 высушивали до образования пленки, продували азотом и добавляли 12%-ный раствор свободного от стромы гемоглобина в фосфатном буфере, содержащем 21% глюкозы, при соотношении липидсодержащих компонентов и гемоглобина 1: 7. Содержимое перемешивали при 20^oC до растворения пленки. Полученную липосомальную суспензию диспергировали при 4^oC на гомогенизаторе при перепаде давлений от 50 ати до нормального в течение 5 минут (10 циклов гомогенизирования). Отделение неинкапсулированного гемоглобина осуществляли центрифугированием при 3500 об/мин при 4^oC. Концентрацию гемоглобина в липосомах определяли после раскрытия липосом тритоном X-100 спектрофотометрическим методом. Суспензия липосом исследовалась как в примере 1. Результаты изучения физико-химических свойств представлены в таблице 3.

Примеры 7-12. Пленку из мембранообразующих компонентов получали согласно примеру 1. В качестве инкапсулируемых препаратов использовали ганглиин, тималин, тимоген, цитохром С, DL-a-токоферол и смесь высоконепредельных жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов из икры морского ежа.

Полученные суспензии липосом исследовались как в примере 1. Данные представлены в таблице 4.

Как видно из данных таблиц 1-4, предлагаемый способ получения липосом, содержащих различные терапевтические средства, методом гомогенизирования при перепаде давлений в пределах от 50-300 ати до нормального на гомогенизаторе высокого давления обеспечивает получение тонкодисперсных эмульсий липосом со средним диаметром, не превышающим 0,4 мкм, что отвечает требованиям, предъявляемым к препаратам для внутривенного, внутримышечного и подкожного введения.

Предлагаемый способ обеспечивает получение малоокисленных липосом в заявляемом интервале давлений. При повышении давления выше 450 ати наблюдается рост продуктов ПОЛ, что необходимо избегать при работе с терапевтическими препаратами.

Данные изучения терапевтической эффективности полученных липосомальных препаратов приведены в таблице 5.

Как видно из данных таблицы 5, полученные по предлагаемому способу липосомы с терапевтическими препаратами показали по сравнению с нативной формой этих препаратов пролонгирование в организме и увеличение терапевтической эффективности.

Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии, и касается способа получения липосом, пригодных для инкапсулирования лекарств. Сущность способа заключается в растворении лецитина и смеси кислых фосфолипидов, выделяемой из соевых фосфатидов как единый компонент, в органическом растворителе, высушивании полученного раствора с образованием пленки, ресуспендировании липидной пленки в дисперсионной среде и диспергировании суспендированных липидов в микроэмульсию пропусканием суспензии через микрощель при перепаде давления от 50-300 ати до нормального, при этом в качестве дисперсионной среды используют водные растворы цитостатиков, иммуномодуляторов, полиненасыщенные жирные кислоты, выделенные из морских животных. Технический результат заключается в повышении качества липосом за счет снижения степени окисляемости. 5 табл.

1. Способ получения липосом, включающий растворение веществ, способных образовывать липидные везикулы, в органическом растворителе, высушивание полученного раствора с образованием липидной пленки, ресуспендирование липидной пленки в дисперсионной среде и диспергирование суспендированных липидов в микроэмульсию пропусканием суспензии через микрощель при перепаде давления, отличающийся тем, что диспергирование в микроэмульсию проводят при перепаде давления от 50 300 ати до нормального. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве дисперсионной среды используют водный раствор терапевтического препирата. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве терапевтического препарата используют цитостатики. 4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве терапевтического препарата используют иммуномодуляторы. 5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве терапевтического препарата используют полиненасыщенные жирные кислоты, выделенные из морских животных. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве веществ, способных образовывать липидные везикулы, используют лецитин и смесь кислых фосфолипидов, выделяемую из соевых фосфатидов как единый компонент.