СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ С ИНКАПСУЛИРОВАННЫМ ДОКСИЦИКЛИНОМ ГИДРОХЛОРИДОМ И ПОВЕРХНОСТНО ЛОКАЛИЗОВАННЫМИ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ Российский патент 2016 года по МПК A61K9/127 

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к проблеме создания новых липосомальных форм комбинированных антимикробных препаратов для лечения особо опасных инфекционных заболеваний.

С современных позиций экспериментальной и клинической фармакологии липосомы представляются возможными переносчиками антимикробных лекарственных веществ, позволяющими включать во внутреннее водное пространство водорастворимые, а в липидный бислой - водонерастворимые препараты, сорбировать препараты на наружней мембране и целенаправленно доставлять их в нужные области организма, снижать их токсичность и продлевать действие препаратов, предохраняя их от воздействия агрессивной физиологической среды (Толчева Е.В., Оборотова Н.А. Липосомы как транспортные средства для доставки биологически активных молекул // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т. 5. - №1. - С. 54-61).

В настоящее время особое значение представляют липосомы - переносчики антибактериальных препаратов (Ротов К.А., Тихонов С.Н., Алексеев В.В., Снатенков Е.А. Фармакокинетика липосомального гентамицина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153. - №4. - С.464-466). Антибиотик в основном концентрируется в паренхиматозных органах и, кроме того, доставка препарата путем эндоцитоза непосредственно в лизосомы уменьшает его инактивацию и позволяет оптимизировать антимикробное действие. Это приобретает особо важное значение для лечения таких инфекций, как сап и мелиоидоз, возбудители которых находятся внутриклеточно.

Рядом авторов (Илюхин В.И., Ротов К.А., Сенина Т.В. и др. Химиотерапия острых форм сапа в эксперименте // Антибиотики и химиотерапия. - 2012. - Т. 57. - С. 11-12; Ротов К.А., Тихонов С.Н., Храпова Н.П., Алексеев В.В., Снатенков Е.А. Оценка эффективности лечения легочной формы острого мелиоидоза липосомальным цефазолином в эксперименте // Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - Вып. 93. - 1. - С. 93-94) было отмечено, что иммобилизация антибиотиков в липосомы позволила значительно повысить эффективность лечения сапной и мелиоидозной инфекций в эксперименте в сравнении со свободными формами антимикробных препаратов.

Для более полного использования всех возможностей липосом, как носителя антимикробных препаратов для лечения ООИ и повышения их эффективности, предложен способ получения комбинированного липосомального антибактериального препарата, состоящего из доксициклина внутри липосом и моноклональных антител к гликопротеидам клеточной стенки возбудителя мелиоидоза, связанных с наружной мембраной липосом.

Показана возможность применения липосомального гентамицина сульфата, доксициклина для профилактики мелиоидозной и сапной инфекций в эксперименте (Ротов К.А., Снатенков Е.А., Алексеев В.В., Храпова Н.П. Возможность применения липосомального гентамицина сульфата для профилактики мелиоидозной инфекции в эксперименте // Санитарная охрана территорий государств - участников содружества независимых государств - проблемы биологической безопасности противодействия биотерроризму в современных условиях. Мат. междунар. научн.-практ. конф. (13-14 сентября 2005). - Волгоград, 2005. - С. 148-149; Ротов К.А., Снатенков Е.А., Замарин А.А., Тихонов С.Н., Храпова Н.П., Алексеев В.В. Протективность липосомального доксициклина при экспериментальной сапной инфекции // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Матер. Российской научн.-практ. конф. (21-22 марта 2007 г. ), г. Ставрополь 2007. - С. 67-68).

Учитывая, что в настоящее время практически нет средств специфической профилактики мелиоидоза, а набор эффективных препаратов для лечения ограничен, актуальность проблемы лечения данного заболевания не вызывает сомнений.

Существуют разнообразные методы приготовления липосом. Выбор того или иного метода определяется целью работы. В настоящее время чаще применяют: методы встряхивания, инжекционные методы, детергентные методы, методы ультразвуковой обработки, замораживания и оттаивания, метод выпаривания и обращения фаз.

Наиболее близким аналогом является метод получения липосом ультразвуковой обработкой.

Для приготовления липосом 100 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 50 мл хлороформа в 200 мл круглодонной колбе для роторного испарителя и при пониженном давлении проводят выпаривание органического растворителя. Время окончания выпаривания определяют по исчезновению хлороформа в колбе, при этом на ее стенках образовывается тонкая пленка липидов. Далее вносят 5 мл материала, содержащего включаемый препарат в 0,01 М фосфатном буфере pH 7,2. После 2 часовой инкубации при комнатной температуре к смеси для образования гомогенной суспензии липосом в колбу помещали несколько стеклянных бусинок и энергично встряхивали в течение 5 минут.

Взвесь липосом переносят в сосуд для ультразвуковой обработки и производят озвучивание в атмосфере азота. Режим озвучивания: частота - 20 кГц; мощность - 200 Вт; экспозиция - 30 мин. Для предотвращения разогрева взвеси липосом применяют ледяную баню. В процессе озвучивания происходит просветление взвеси липосом. По окончанию обработки препарат представляет собой прозрачную жидкость, опалесцирующую при боковом освещении. Образуются очень мелкие, однородные по размеру 20-200 Å моноламеллярные липосомы. Включение материала не превышает 1-3% (Рараhadjopoulos D., Wotkins J.C. Phospholipid model membrynes. II. Permeabilyti properties of hydrated liguid crystals. - Biochim. et biophys. Acta, 1967, vol. 135, p. 639-652).

Иммобилизацию иммуноглобулинов на мембране липосом проводят с помощью глутарового альдегида. С этой целью 1 мг белка добавляют к 25 мг активированных глутаровым альдегидом липосом (к 25 мг суспензии липосом добавляют глутаровый альдегид в конечной концентрации 15 мМ) и после 5 мин инкубации смесь диализуют против боратного буфера pH 8.5 в течение 18 ч, температура 4°C. Имммобилизация IgG на наружной мембране липосом составляет 17% (Torchilin V.P., Goldmacher V.S., Smirnov V.N. Comparative studits on covalent and noncovalent immobilization of proteins molecules on the surface of liposomes // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1978. - V. 85. - P. 983-990). Основными недостатками данных методов являются низкий процент включения препарата внутрь липосом и недостаточная эффективность иммобилизации иммуноглобулинов на наружной мембране везикул, а обработка ультразвуком приводит к значительной химической деградации фосфолипидов с образованием лизолецитина, жирных кислот (Г. Грегориадис, А. Аллисон. Липосомы в биологических системах. - М.: Медицина. - 1983. - С. 28-29).

Целью изобретения является разработка и получение более эффективных средств для лечения острого экспериментального мелиоидоза.

Для достижения поставленной цели 63,3-50,1 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 4,3-3,8 мл хлороформа и смешивали с 1,0-0,5 мл водного раствора доксициклина гидрохлорида, содержащего 6,0-3,0 мг антибиотика и обрабатывали на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин достигали образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера pH 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Отделение невключившихся антибиотиков проводили центрифугированием при 20000 об/мин в течение 1 ч на центрифуге «Ja-21» «Bechman» (США).

Моноклональные антитела к поверхностному антигену Burkholderia pseudomallei 100 в концентрации 500 мкг белка на 1 мг липидов иммобилизировали на поверхности липосом содержащих доксициклина гидрохлорид при помощи ковалентного связывания, используя глутаровый альдегид, для этого к суспензии липосом добавляли глутаровый альдегид до конечной концентрации 15 мМ, после 5 минут инкубации при комнатной температуре смесь диализовали против боратного буфера для удаления избытка глутарового альдегида в течении 18 ч при температуре 4°C. Иммуноглобулины вносили в реакционную смесь через 1 ч после начала диализа.

Увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора), сократить время обработки и повысить инкапсуляцию доксициклина гидрохлорида до 70%. Изменение режима внесения иммуноглобулинов в реакционную смесь повысило процент иммобилизации их на наружной мембране липосом от 17% до 30,9%.

Для оценки эффективности лечебного действия полученных липосом с инкапсулированным доксициклином гидрохлоридом и поверхностно локализованными моноклональными антителами, зараженным внутрибрюшинно лабораторным животным высоковирулентным штаммом Burkholderia pseudomallei - 100, в дозе 10 микробных клеток, что вызывает острую форму заболевания, лечение начинают через 24 ч, внутрибрюшинно вводимая доза полученных липосом содержит 3 мг доксициклина гидрохлорида и 2 мг по белку моноклональных антител на животное, интервал между введениями 48 ч, а курс лечения - 15 суток, при этом процент выживших животных составил 80%.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Получение липосом, содержащих во внутреннем объеме везикул доксициклина гидрохлорида и моноклональные антитела на наружной мембране

Для этого 63,3 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 4,3 мл хлороформа и смешивали 100 мг антибиотика, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере pH 7,2, в объеме 1,5 мл, добавляли к раствору липидов в органической фазе и обработкой на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин достигали образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера pH 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Отделение невключившихся антибиотиков проводили центрифугированием при 20000 об/мин в течение 1 ч на центрифуге «Ja-21» «Bechman» (США). Процент иммобилизации доксициклина гидрохлорида определяли методом серийных разведений в супернатанте. Он составлял 70%. Размеры липосомального препарата при электронно-микроскопическом исследовании составляли 600-800 нм. Степень окисления липидов мембраны липосом составляла 0,8±0,02 (перекисный индекс Клейна) (Klein R.A. The detection of oxidation in liposome preparations // Biochim. Biophys. Acta. - 1970. - №21. - P. 486-489). Иммобилизацию иммуноглобулинов глутаровым альдегидом проводили по следующей методике: к суспензии липосом добавляли глутаровый альдегид до конечной концентрации 15 мМ, после 5 минут инкубации при комнатной температуре смесь диализовали против боратного буфера для удаления избытка глутарового альдегида в течение 18 ч при температуре 4°C. Иммуноглобулины к поверхностному антигену Burkholderia pseudomallei 100 в концентрации 500 мкг белка на 1 мг липидов добавляли в реакционную смесь через 1 ч после начала диализа. Процент связывания МКА при данном способе иммобилизации составил 30.9%.

Пример 2. Лечение острой формы экспериментального мелиоидоза

См. приложение. таблица.

Для проведения работы были использованы беспородные белые мыши обоего пола массой 18-20 г по 10 животных в группе. Изучение эффективности липосом с инкапсулированным доксициклином гидрохлоридом и поверхностно локализованными моноклональными антителами проводили в сравнении со свободной формой антибиотика, липосомальной формой доксициклина гидрохлорида, свободными моноклональными антителами и моноклональными антителами иммобилизованными на мембране липосом. Заражающая доза В. pseudomallei 100 составила 10³ м.к., экспериментальных животных заражали внутрибрюшинно. Свободный доксициклина гидрохлорид вводили животным внутрибрюшинно в течение 15 сут в дозах: 6.0; 3.0; 1.5 мг, липосомальную форму препарата и комбинированный препарат также вводили животным внутрибрюшинно на 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15 сутки после заражения в дозах: 3.0; 1.5; 0.75 мг. Количество моноклональных антител на мембране липосом и в свободной форме соответствовало 2 мг по белку.

В результате было определено, что доксициклин в свободной форме был мало эффективен и при введении животным в дозах от 1 до 6 мг выжило от 10 до 20%, МКА, в свободной форме и иммобилизованные на мембране липосом также способствовали выживаемости от 10 до 20% животных в группе. Несколько эффективней был липосомальный доксициклин, при введении в дозах 3.0 и 1.5 мг выжило 40 и 30% животных соответственно. Применение комбинированного липосомального препарата, содержащего доксициклин внутри везикул в дозе 3 мг и МКА, связанные с мембраной липосом было наиболее эффективным, выжило до 80% животных в группе.

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к созданию новых липосомальных форм комбинированных антимикробных препаратов для лечения особо опасных инфекционных заболеваний. Изобретение представляет собой способ получения липосом с инкапсулированным доксициклином гидрохлоридом и поверхностно локализованными моноклональными антителами, включающий создание эмульсии из липидов и антибактериального препарата и последующего получения липосом, отличающийся тем, что для увеличения количества инкапсулированного антибиотика и дополнительной иммобилизации на поверхности липосом моноклональных антител, навеску в 63,3 мг смеси липидов фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3 растворяют в 4,3 мл хлороформа и смешивают с 100 мг антибиотика растворенного в 0,01 М фосфатном буфере pH 7,2, в объеме 1,5 мл, обрабатывают на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин до образования эмульсии, в роторном испарителе полностью удаляют органический растворитель, к образовавшемуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера pH 7,2 и тщательно перемешивают в колбе на роторном испарителе, отделение невключившихся антибиотиков проводят центрифугированием при 20000 об/мин в течение 1 ч на центрифуге, процент иммобилизации доксициклина гидрохлорида определяют методом серийных разведений, при этом он составил 70%, размеры липосомального препарата при электронно-микроскопическом исследовании достигают от 600 до 800 нм, степень окисления липидов мембраны липосом 0,8±0,02 ед, после чего осуществляют иммобилизацию иммуноглобулинов на наружной мембране липосом, а полученный препарат применяют для лечения острого экспериментального мелиоидоза лабораторных животных. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана, сократить время обработки и повысить инкапсуляцию доксициклина гидрохлорида до 70%. Изменение режима внесения иммуноглобулинов в реакционную смесь повышает процент иммобилизации их на наружной мембране липосом от 17% до 30,9%. Полученные липосомы обеспечивают 80% выживаемость лабораторных животных при остром экспериментальном мелиоидозе. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

1. Способ получения липосом с инкапсулированным доксициклином гидрохлоридом и поверхностно локализованными моноклональными антителами, включающий создание эмульсии из липидов и антибактериального препарата и последующего получения липосом, отличающийся тем, что для увеличения количества инкапсулированного антибиотика и дополнительной иммобилизации на поверхности липосом моноклональных антител навеску в 63,3 мг смеси липидов фосфатидилхолин : холестерин в соотношении 7:3 растворяют в 4,3 мл хлороформа и смешивают с 100 мг антибиотика растворенного в 0,01 М фосфатном буфере pH 7,2, в объеме 1,5 мл, обрабатывают на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин до образования эмульсии, в роторном испарителе полностью удаляют органический растворитель, к образовавшемуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера pH 7,2 и тщательно перемешивают в колбе на роторном испарителе, отделение невключившихся антибиотиков проводят центрифугированием при 20000 об/мин в течение 1 ч на центрифуге, процент иммобилизации доксициклина гидрохлорида определяют методом серийных разведений, при этом он составил 70%, размеры липосомального препарата при электронно-микроскопическом исследовании достигают от 600 до 800 нм, степень окисления липидов мембраны липосом 0,8±0,02 ед, после чего осуществляют иммобилизацию иммуноглобулинов на наружной мембране липосом, а полученный препарат применяют для лечения острого экспериментального мелиоидоза лабораторных животных.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что иммобилизацию иммуноглобулинов проводят добавлением к суспензии липосом глутарового альдегида до конечной концентрации 15 мМ, после 5 минут инкубации при комнатной температуре смесь диализуют против боратного буфера для удаления избытка глутарового альдегида в течение 18 ч при температуре 4°С, при этом моноклональные антитела к поверхностному антигену Burkholderia pseudomallei 100 в концентрации 500 мкг белка на 1 мг липидов вносят в реакционную смесь через 1 ч после начала диализа, процент иммобилизации моноклональных антител на наружной мембране липосом составил 30.9%.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки эффективности лечебного действия полученных липосом с инкапсулированным доксициклином гидрохлоридом и поверхностно локализованными моноклональными антителами, зараженным внутрибрюшинно лабораторным животным высоковирулентным штаммом Burkholderia pseudomallei - 100, в дозе 10³ микробных клеток, что вызывает острую форму заболевания, лечение начинают через 24 ч, внутрибрюшинно вводимая доза полученных липосом содержит 3 мг доксициклина гидрохлорида и 2 мг по белку моноклональных антител на животное, интервал между введениями 48 ч, а курс лечения - 15 суток, при этом процент выживших животных составил 80%.