КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ ЛАКТОБАКТЕРИЙ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ ИЛИ ЗАКВАСКИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23C9/12 A23L1/30 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и представляет собой консорциум штаммов лактобактерий, который может быть применен для получения на его основе препарата, используемого в качестве биологически активной добавки (БАД) или закваски для производства кисломолочных продуктов в лечебно-диетических целях.

Функции нормальной микрофлоры в организме являются жизненно важными и очень обширными: синтезирующая, регуляторная, десенсибилизирующая, дезинтоксикационная, ферментативная, защитная и иммуностимулирующая.

Препараты и продукты, содержащие в своем составе лактобактерии, широко используются для профилактики и лечения дисбактериозов и нормализации микрофлоры кишечника людей, перенесших стрессовые воздействия, антибиотико- и химиотерапию.

Предшествующий уровень техники

За рубежом широко используют препараты-пробиотики и продукты лечебного питания на основе консорциумов штаммов лактобактерий видов Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum и Lactobacillus lactis в разных комбинациях (Патент США №6827953, МПК C12N 1/20, А61К 35/72, опубл. 07.12.2004; патент Великобритании №883424, МПК С12С 1/20, опубл. 29.11.1961; патент Великобритании №930107, МПК А61К 35/72, опубл. 03.07.1963), а также на основе консорциумов штаммов бифидо- и лактобактерий (Заявка США №20020090416, МПК A23L 1/00, опубл. 11.07.2002; патент США №5866385, МПК C12N 1/21, А23С 9/123, опубл. 02.02.1999).

Однако консорциумы штаммов лактобактерий и консорциумы штаммов бифидо- и лактобактерий зарубежных фирм-разработчиков ориентированы на создание, преимущественно, лечебно-профилактических препаратов и БАД в сухой форме (таблетки, капсулы). Указанные консорциумы штаммов имеют существенные недостатки, если их использовать для приготовления препаратов и кисломолочных продуктов в жидкой форме: малые сроки хранения указанных препаратов и продуктов, низкие органолептические качества, которые несущественны для препаратов в сухой форме.

Известны консорциумы штаммов бифидо- и лактобактерий, используемые для производства кисломолочных и неферментированных продуктов в жидкой форме (Патент РФ №2180348, МПК C12N 1/20, опубл. 2002 г.; патент РФ №2180914, МПК C12N 1/20, опубл. 2002 г.; патент РФ №2180915, МПК C12N 1/20, опубл. 2002 г.).

Основным недостатком кисломолочных продуктов, изготовленных на основе консорциумов штаммов бифидо- и лактобактерий является недостаточный срок их хранения (не более 1 месяца) вследствие того, что лактобактерии в процессе хранения продукта способствуют быстрому его закислению. Титр бифидобактерий в закисленном продукте быстро падает, что снижает лечебно-профилактические свойства этого продукта.

Известен консорциум штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus (штамм NCIMB 40354), Lactobacillus plantarum (штамм NCIMB 40356); Lactobacillus casei (штамм NCIMB 40357), используемый для получения кисломолочных лечебно-профилактических продуктов (патент Великобритании №2251864, МПК C12N 1/20, опубл. 22.07.1992).

Однако срок хранения такого консорциума штаммов лактобактерий в кисломолочных продуктах составляет 30 дней, что недостаточно при приготовлении биологически активных добавок в жидкой форме.

Известен способ получения препарата из 15 симбиотических культур бактерий-пробиотиков, как бифидо, так и лактобактерий, в том числе штаммы Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei (патент РФ №2163445, МПК А23С 9/12, опубл. 27.02.2001 г.), который может быть использован как лечебно-профилактический препарат или биологически активная добавка в жидкой форме.

Однако препарат, полученный таким способом, имеет низкий начальный титр готового продукта (до 10^8-9 клеток в 1 г) и короткие сроки хранения.

Наиболее близким техническим решением - прототипом - является консорциум штаммов лактобактерий, содержащий Lactobacillus acidophilus 57S (ВКПМ В-5863), Lactobacillus plantarum П-75 (ВКПМ В-3962), Lactobacillus casei Сб (ВКПМ В-5724), взятые в соотношении 2:0,5:0,5, используемый для получения кисломолочных лечебно-профилактических продуктов (Патент РФ №2326938, МПК C12N 1/20, опубл. 20.07.2007).

Однако срок хранения такого консорциума штаммов лактобактерий в кисломолочных продуктах составляет 30 дней, что недостаточно при приготовлении биологически активных добавок в жидкой форме.

Другим наиболее близким техническим решением - прототипом - является способ получения кисломолочного продукта, включающий подготовку молочной питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение до температуры заквашивания, внесение посевной дозы консорциума штаммов лактобактерий в количестве не более 5,0 мас.%. Сквашивают продукт в течение времени, достаточного для формирования сгустка, и охлаждают готовый продукт при температуре не выше +6°С. В качестве молочной питательной среды используют обезжиренное молоко, нормализованное по сухому остатку до 13,5-15%, лактопептон и натрий лимоннокислый при следующем соотношении компонентов, мас.%: лактопептон - 3,5-4,5, натрий лимоннокислый - 0,15-0,25 и обезжиренное молоко, нормализованное по сухому остатку до 13,5-15% - остальное (патент РФ №2326938, МПК А23С 9/12, опубл. 20.07.2007 г.), который может быть использован как лечебно-профилактический препарат или биологически активная добавка в жидкой форме.

Однако препарат, полученный таким способом, имеет недостаточный начальный титр готового продукта и сроки хранения. Техническим результатом заявляемых технических решений является повышение сроков хранения заявляемого консорциума лактобактерий в приготавливаемых препаратах, в том числе в БАДах, а также обеспечение более высокого начального титра готовых продуктов после их приготовления.

Указанный технический результат достигается новым консорциумом штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus ВКПМ В 5863, Lactobacillus acidophilus ВКПМ В 4108, Lactobacillus plantarum ВКПМ В 3962, Lactobacillus plantarum ВКПМ В 5002, Lactobacillus casei ВКПМ В 5724, Lactobacillus casei ВКПМ В 3960, содержащихся в соотношении 1:1:1:1:4:4, используемый для получения в жидкой форме биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов.

Уникальность заявляемого консорциума микроорганизмов состоит в его особенностях: широкий видовой и штаммовый состав и высокая концентрация пробиотических микроорганизмов; штаммы лактобактерий представлены симбиотическими ассоциациями, максимально приближенными к естественной микрофлоре людей; повышенная устойчивость к антибиотикам и кислой среде. Все штаммы обладают синергизмом в отношении друг друга. Такой подход не только суммирует эффект отдельных штаммов, но способствует устойчивой локализации или новому заселению кишечника теми видами бактерий, которые преобладают в микробиоценозе конкретного человека. Усиление положительного эффекта разработанного консорциума лактобактерий на организм человека обусловливается следующими его свойствами:

- высокой антагонистической активностью по отношению к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов;

- выраженным воздействием на ферментативную и синтетическую активность бактерий нормальной кишечной микрофлоры;

- стимуляцией иммунной системы человека;

- способностью к выживанию и развитию в условиях микрофлоры желудочно-кишечного тракта;

- устойчивостью к условиям технологического процесса и хранения в течение не менее 3-х месяцев.

L.casei обладают протеолитической активностью по отношению к казеиновым белкам, составляющим основу продукта. Эти бактерии осуществляют протеолиз казеиновых белков, обогащая продукт ценными азотистыми веществами, повышая тем самым его биологическую ценность и вкусовые достоинства. Деятельность L. acidophilus обеспечивает накопление свободных аминокислот, таких как валин, глицин, гистидин, которые стимулируют развитие аутохтонной микрофлоры человека.

Кроме того, преобладание лактобактерий Lactobacillus casei ВКПМ В 5724 и ВКПМ В 3960 в заявляемом консорциуме обеспечивает повышение активности собственной микрофлоры кишечника организма, результатом которой является:

- снижение риска заболевания некоторыми видами рака;

- способность модулировать иммунную систему;

- возможность использования Lactobacillus casei для лечения язвенных колитов;

- более сильное воздействие на клетки сальмонелл вплоть до их лизиса;

- ингибирующее действие на рост Helicobacter pylori.

Указанный технический результат достигается также тем, что в способе получения биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов, включающем подготовку молочной питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение до температуры заквашивания, внесение в молочную питательную среду посевной дозы комбинации штаммов бактерий-пробиотиков в количестве не более 5,0 мас.%, сквашивание до достижения кислотности готового продукта не менее 90°Т и охлаждение готового продукта при температуре не выше +6°С, согласно изобретению в качестве комбинации штаммов бактерий-пробиотиков используют консорциум штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus ВКПМ В 5863, Lactobacillus acidophilus ВКПМ В 4108, Lactobacillus plantarum ВКПМ В 3962, Lactobacillus plantarum ВКПМ В 5002, Lactobacillus casei ВКПМ В 5724, Lactobacillus casei ВКПМ В 3960, содержащихся в соотношении 1:1:1:1:4:4, а в качестве молочной питательной среды используют обезжиренное молоко, нормализованное по сухому обезжиренному молочному остатку СОМО 13,5-15%, в которую дополнительно вводят глюкозу и натрий лимоннокислый при следующем соотношении компонентов, мас.%:

глюкоза 1,5-2,5 натрий лимоннокислый 0,15-0,25 обезжиренное молоко, нормализованное   по сухому обезжиренному молочному остатку   СОМО 13,5-15% остальное

В стандартной обезжиренной молочной среде искусственно увеличивают в 1,3-1,5 раз концентрацию белков и лактозы внесением сухого молока так, чтобы сухой обезжиренный молочный остаток (СОМО) достигал 13,5-15,0%. Чем выше содержание СОМО, тем выше содержание казеина, который образует буферную систему, связывая большое количество кислых метаболитов в казеинаты. Тем самым удается сдерживать нарастание кислотности среды при росте биомассы. В связи с изложенным выше, увеличение содержания лактозы на 30% обеспечивается за счет увеличения содержания до 15,0% СОМО в обрате молока. Кроме того, в качестве дополнительного источника энергии добавлена глюкоза, что способствует повышению ростовых свойств среды, обеспечивающих значительное повышение титра лактобактерий.

Для предотвращения коагуляции казеина в молочную основу вводят раствор натрия лимоннокислого, который обладает сильными стабилизирующими и буферными свойствами.

В результате удается существенно увеличить сохранность лактобактерий консорциума. Оптимизация технологии получения биомассы лактобактерий на обезжиренной молочной среде с повышенным содержанием СОМО и глюкозой позволила получать стабильную биомассу с высоким начальным титром и длительным сроком хранения.

Сведения о депонировании штаммов консорциума

1. Lactobacillus acidophilus 57S (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5863); Lactobacillus acidophilus K-1-C (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 4108); Lactobacillus plantarum П-75 (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 3962); Lactobacillus plantarum 337D (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5002); Lactobacillus casei C-l (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 3960); Lactobacillus casei Сб (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В - 5724).

Свойства консорциума определяются штаммами лактобактерий Lactobacillus casei С-1 и Lactobacillus casei Сб, содержание которых в консорциуме около 70%.

Культурально-морфологические признаки консорциума

Клетки лактобактерий представляют собой прямые палочки средней длины или крупные (1,0-1,5x3-14 мкм), расположенные цепочками или поодиночке. Грамположительные спор и капсул не образуют. На плотных средах образуют мелкие глубинные колонии, как правило, в виде клубка нитей.

Штаммы не разжижают желатин, не образуют газ, каталазу не продуцируют. Синтезируют молочную кислоту, ассимилируют глюкозу, арабинозу, лактозу, не ассимилируют рафинозу, сахарозу, мальтозу, маннит.

Оптимальная температура для роста штаммов лактобактерий составляет 36-42°С.

При внесении штаммов в обезжиренное молоко в объеме 3% сбраживание молока происходит за 4 - 5 ч. Кислотность консорциума составляет 240 -280°Т.

Кислотообразующая активность: к 24 ч - 140° Тернера, к 72 ч - 160-200° Тернера.

Максимальный титр лактобактерий консорциума в молочной среде (стерильное обезжиренное молоко) через 5-6 ч роста составляет - 1-2×10⁹, через 180 дней хранения в этой среде - 1-2×10⁸. При добавлении лактопептона через 4-5 ч роста составляет - (3-7)·10¹⁰, через 180 дней хранения в этой среде - 2,5-6×10⁹.

Антагонистические свойства

Проявляет активность по отношению к шигеллам Зонне, Флекснера, энтеропатогенным кишечным палочкам, стафилококкам.

Способность консорциума штаммов трех видов лактобактерий наращивать микробную массу в питательных средах, сквашивать молоко в короткие сроки, проявлять специфическую активность делает возможным его использование в приготовлении БАДов, кисломолочных, не ферментированных пищевых продуктов и бактерийных препаратов.

Результаты исследований, подтверждающие полезные свойства заявляемого консорциума штаммов лактобактерий

Для выявления технологических особенностей и свойств заявляемого консорциума штаммов лактобактерий проведены исследования в процессе культивирования заявляемого консорциума, а также его хранения. Культивирование консорциумов проводили в молочной среде, изготовленной по МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов". Для повышения ростовых свойств молочной основы был введена глюкоза, мас.%:

- Глюкоза 1,5-2,5 - Натрий лимоннокислый 0,15-0,25 - Обрат молока (основа), нормализованный   по сухому остатку 13,5-15,0% остальное до 100%

В стандартной обезжиренной молочной среде искусственно увеличивают в 1,3-1,5 раза концентрацию белков и лактозы внесением сухого молока так, чтобы сухой обезжиренный молочный остаток (СОМО) достигал 13,5-15,0%. Чем выше содержание СОМО, тем выше содержание казеина, который образует буферную систему, связывая большое количество кислых метаболитов в казеинаты. Тем самым удается сдерживать нарастание кислотности среды при росте биомассы. Чем выше содержание лактозы, тем выше ростовые свойства среды - увеличение содержания лактозы на 25-30% повышает титр лактобактерий. Для предотвращения коагуляции казеина в молочную основу вводят раствор натрия лимоннокислого, который обладает сильными стабилизирующими и буферными свойствами.

Кроме того, для повышения ростовых свойств молочной питательной среды вводят глюкозу в качестве дополнительного источника энергии, который способствует значительному увеличению содержания лактобактерий с 10⁹ до 10¹⁰ КОЕ/мл.

В результате удалось существенно увеличить сохранность лактобактерий консорциума. Оптимизация технологии получения биомассы лактобактерий на обезжиренной молочной среде с повышенным содержанием СОМО и глюкозой позволила получать стабильную биомассу с высоким начальным титром и длительным сроком хранения до 180 суток.

В таблице 1 представлены технологические характеристики заявляемого консорциума штаммов лактобактерий на молочной среде (обрат молока, нормализованный по сухому остатку 13,5-15,0%) в процессе культивирования и хранения.

Исследование антагонистической активности заявляемого консорциума штаммов лактобактерий

Антагонистическая активность штаммов консорциума лактобактерий (таблица 2) была изучена методом in vitro при совместном выращивании с патогенными тест-штаммами по зоне задержки роста тест-микробов методом штриховых кодов.

Таблица 2 Исследование антагонистической активности лактобактерий на плотных питательных средах Наименование тест-микробов Лактобактерии Lactobacillus casei Лактобактерии
Lactobacillus plantarum Лактобактерии
Lactobacillus acidophilus E.coli 13 мм 12 мм 13 мм Sh.flexneri 12 мм 12 мм 12 мм S.aureus 15 мм 14 мм 14 мм Proteus vulgaris 12 мм 12 мм 12 мм Proteus mirabilis 12 мм 13 мм 13 мм

Изучение влияния консорциума лактобактерий на представителей нормальной кишечной микрофлоры в модели in vitro

Эти исследования проводились Головным испытательным центром при ГУ НИИ Питания РАМН. Объекты исследования - препараты-эубиотики производства АООТ «БИОМЕД» им. И.М.Сеченова:

- Лактобактерин сухой,

- Бифидумбактерин сухой.

Из таблицы 3 видно, что ингибирующего действия консорциума лактобактерий на представителей нормальной кишечной микрофлоры в модели in vitro не выявлено.

Эффективность консорциума штаммов лактобактерий была установлена в результате доклинических исследований, проведенных в ГНЦ ВБ «Вектор» Минздрава РФ на взрослых мышах и молодняке генетически стандартной колонии ICR в соответствии с требованиями РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых иммунобиологических препаратов. Основные положения».

Исследования проводились по схеме: общая токсичность (хроническая), эмбриотоксичность и влияние на репродуктивную функцию, общее фармакологическое действие (влияние на пищеварительную систему, формирование адаптационного эффекта).

Таблица 3 Результаты исследований влияния заявляемого консорциума лактобактерий на нормальную кишечную микрофлору в модели in vitro Показатели
Микроорганизмы-эубиотики КОЕ/г продукта Эубиотик + БАД Контроль эубиотика Лактобациллы, рост на среде MRS микроскопический препарат 1×10⁹ Гр(+)палочки без спор, типичные для лактобацилл 10⁹ КОЕ/г, Гр(+)палочки без спор, типичные для лактобацилл; отсутствие клеток посторонней микрофлоры Бифидобактерии Микроскопический препарат 1×10⁸ Гр(+)палочки без спор изогнутые и с бифуркацией, типичные для бифидобактерий 1×10⁸ КОЕ/г Гр(+)палочки без спор изогнутые и с бифуркацией, типичные для бифидобактерий; отсутствие клеток посторонней микрофлоры Колибактерин Е. Coli M-17 Рост в среде Malthus Enterobacteriaceae medium. Микробиологический 1×10⁹ Гр(-)палочки без спор, типичные для колибактерий 1,3×10¹⁰ Гр(-)палочки без спор, типичные для колибактерий; отсутствие клеток посторонней микрофлоры

При изучении хронической токсичности все животные были жизнеспособны, потери массы тела, нарушения двигательной активности, угнетения состояния и гибели не отмечено. Более того, наблюдается стимулирующее действие консорциума на рост, развитие и выживаемость животных. Гематологические показатели крови в пределах физиологической нормы. Гистологические исследования органов-мишеней показали отсутствие токсического воздействия на эти органы. Не выявлено также иммунотоксического воздействия препарата на органы лимфоидной системы при их гистологическом исследовании.

Высокая эффективность консорциума лактобактерий доказана при изучении репродуктивной функции беременных самок - наблюдается заметное улучшение состояния организма самок, снижение поздней эмбриональной смертности после имплантации (3,1%) против (5,3%) в контрольной группе, лучшая выживаемость новорожденных мышат за этот период до 92,5% в сравнении с контролем до 80%.

Проверка эффективности физиологического воздействия консорциума на пищеварительную систему мышей показала стабилизирующее влияние на работу ЖКТ и становления микробиоценоза новорожденных мышат за счет колонизационной активности штаммов лактобактерий консорциума.

Консорциум содействует также выживанию мышей в тяжелых ситуациях (условия повышенных температур - 32+2°С), действуя как адаптоген, способствующий сохранению значительных функциональных резервов жизненно важных систем организма.

Примеры предпочтительного осуществления изобретения

Пример 1. Использование консорциума штаммов лактобактерий в составе закваски для приготовления БАД «ТРИЛАКТ»

Введение культур лактобактерий. Для приготовления первичной (маточной) закваски используют лиофилизированные аттестованные штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus acidophilus K-l-C, Lactobacillus plantarum П-75, Lactobacillus plantarum 337D; Lactobacillus casei Cб, Lactobacillus casei C-l в соотношении 1:1:1:1:4:4 или эти же активированные музейные штаммы, сохраняемые в пробирках в стерильном обезжиренном молоке.

В ампулу с лиофилизированным аттестованным штаммом лактобактерий пипеткой вносят (0,2-0,5) мл стерильного физраствора. После растворения лиофильной массы той же пипеткой содержимое ампулы пересевают (переносят) в пробирку с 9 мл стерильного обезжиренного молока и хорошо перемешивают пипетированием. Посевы инкубируются в термостате ТС26 при температуре (39,0-40,0)°С в течение (20-24) часов. Далее проводят 1-2 пассажа в стеклянных флаконах вместимостью (0,1-0,25) л со стерильным обезжиренным молоком для полной активизации их свойств. Последующие посевы инкубируют в термостате при температуре (39,0-40,0)°С в течение (5-6) часов.

После инкубирования флаконы с культурами передают на охлаждение и хранение в холодильник, после созревания в течение 10-12 часов используются для получения лабораторной закваски.

Первичная (маточная) закваска лактобактерий может храниться в холодильнике при температуре (6-8)°С не более 7 дней.

Приготовление лабораторной и производственной заквасок штаммов лактобактерий. Лабораторные закваски лактобактерий готовят на стерильном обезжиренном молоке из первичной (маточной) закваски отдельно для каждого штамма лактобактерий из расчета недельной потребности и используют в дальнейшем производстве на следующий день после ее приготовления.

Поочередно из флаконов с культурами лактобактерий с характерным ростом в стерильном обезжиренном молоке отбирают пипеткой культуры каждого из штаммов, в количестве 3% посевного материала к объему стерильного обезжиренного молока. Выдерживают в термостате в течение (4-5) ч при температуре (39±1)°С.

Содержание пробиотических микроорганизмов в полученной биомассе лактобактерий составляет lg 8-9 в 1 мл.

Получение консорциума лактобактерий. Для получения консорциума штаммов лактобактерий производят механическое смешивание лабораторных заквасок Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus acidophilus K-l-C, Lactobacillus plantarum П-75, Lactobacillus plantarum 337D; Lactobacillus casei Cб, Lactobacillus casei C-l в соотношении 1:1:1:1:4:4.

Содержание пробиотических микроорганизмов в полученной биомассе консорциума ассоциации составляет lg 10 в 1 мл.

Получение БАД «Трилакт. Приготовление биомассы БАД «Трилакт» ведется термостатным способом в стеклянных стерильных бутылях вместимостью 15 л. Вначале приготавливают в асептических условиях молочную питательную среду на основе обрата молока, нормализованного по сухому остатку СОМО до 13,5-15,0%. В указанную молочную среду дополнительно вводят глюкозу и натрий лимоннокислый в следующем количественном соотношении, мас.%:

- Глюкоза 1,5-2,5 - Натрий лимоннокислый 0,15-0,25 - Обрат молока, нормализованный   по сухому остатку 13,5-15% остальное до 100%

В асептических условиях в стеклянную бутыль, содержащую 9,5 л нормализованной молочной питательной среды, вносят готовую производственную закваску консорциума лактобактерий в количестве 0,5 л. Микробную смесь лактобактерий осторожно перемешивают круговым вращением бутыли в течение 1-2 минут. Помещают в термостат типа ТС-80М на 4-5 часов при температуре 39-40°С. Заквашенную смесь оставляют без перемешивания до образования сгустка и достижения кислотности не менее 90°Т. После образования сгустка бутыли с продуктом захолаживают до температуры 4±2°С в холодильниках. Для стабилизации и упрочения сгустка захолаживание продукта производят в течение 8-10 ч с последующей фасовкой и хранением готового продукта.

Пример 2. Использование консорциума в качестве закваски для приготовления симбиотического кисломолочного продукта лечебно-функционального питания - Бифацила

Закваску консорциума, приготовленную по примеру 1, в объеме 0,5-1% вносят в пастеризованное молоко вместе с бифидобактериями и термофильным стрептококком в объемах заквасок, предусмотренных для приготовления бифацила, перемешивают и культивируют 3-3,5 ч до образования сгустка, после чего продукт охлаждают и фасуют в потребительскую тару. В результате получают лечебно-профилактический кисломолочный продукт с содержанием полезной лактофлоры не менее lg 7-8 в 1 мл симбиотического продукта.

Полученный продукт обладает выраженным иммунокоррегирующим действием.

Пример 3. Использование консорциума штаммов лактобактерий для получения бактерийного препарата

К выращенной биомассе консорциума по примеру 1 добавляют защитные среды высушивания (сахароза 10% и желатин 5%). Полученную суспензию разливают по 2 мл в ампулы или по 5 мл во флаконы, замораживают при t = минус 40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10⁹ живых клеток лактобактерий. Технология производства консорциума в составе продуктов не требует дорогостоящего оборудования (ферментеров) и позволяет получать большие количества биомассы лактобактерий простым термостатным способом без коррекции рН и применения систем газообмена. В то же время, концентрация лактобактерий в биомассе консорциума лактобактерий достигает максимальных значений - lg 9. Кислотность биомассы лактоконсорциума даже при хранении в течение 3 месяцев в жидком состоянии повышается, в допустимых пределах. В результате предлагаемый консорциум более технологичен и экономичен в сравнении с другими формами консорциумов, очень удобен в применении, хранении и транспортировке.

Пример 4. Исследование длительности хранения консорциума штаммов лактобактерий в жидком БАД «Трилакт»

Исследована длительность хранения консорциума штаммов лактобактерий в жидком БАД «Трилакт» (таблица 4).

Таблица 4 Данные по сохранности заявляемого консорциума лактобактерий в БАДе «Трилакт» № 1 сутки 60 суток 160 суток Титр (КОЕ/мл) Кислотность (°Т) Титр (КОЕ/мл) Кислотность (°Т) Титр (КОЕ/мл) Кислотность (°Т) 1 (3-4)×10¹⁰ 100-110 (3,5-4)×10¹⁰ 165-185 (2,5-3)×10⁹ 210-215 2 (7-8)×10¹⁰ 96-104 (3-4)×10¹⁰ 180-190 (3-4)×10⁹ 190-215 3 (8-9)×10¹⁰ 110-115 (3,5-4)×10¹⁰ 175-180 (3,5-4)×10⁹ 210-230 4 (4-6)×10¹⁰ 105-112 (3-4)×10¹⁰ 175-195 (3,5-4)×10⁹ 212-220 5 (7-8)×10¹⁰ 95-105 (3,5-4)×10¹⁰ 173-180 (2-2,5)×10⁹ 190-205 6 (6-7)x10¹⁰ 97-110 (2,5-3)×10¹⁰ 160-180 (2,5-3,5)×10⁹ 180-204 7 (8-9)×10¹⁰ 100-125 (2,5-3)×10¹⁰ 180-190 (2,5-3,5) ×10⁹ 210-223 8 (6-7)×10¹⁰ 95-110 (2-3)×10¹⁰ 150-178 (2,5-3,5) ×10⁹ 200-221 9 (7-8)×10¹⁰ 105-121 (2,5-3)×10¹⁰ 175-193 (2,4-3,5) ×10⁹ 215-230 10 (8-9)×10¹⁰ 100-110 (3,5-4)×10¹⁰ 170-187 (3,5-4) ×10⁹ 180-195 11 (7-8)×10¹⁰ 90-115 (3,5-4)×10¹⁰ 185-190 (3-4) ×10⁹ 110-215 12 (8-9)×10¹⁰ 110-120 (3,5-4)×10¹⁰ 170-189 (2-3,5) ×10⁹ 190 - 200 13 (6-7)×10¹⁰ 100-107 (3-3,5)×10¹⁰ 140-159 (2,5-3) ×10⁹ 164- 178 14 (7-8)×10¹⁰ 115-125 (3-3,5)×10¹⁰ 190-200 (2,5-3) ×10⁹ 210-230 15 (6-7)×10¹⁰ 100-112 (3-3,5)×10¹⁰ 170-185 (2,3-3,5) ×10⁹ 180- 189

Значительный срок (до 160 дней) хранения БАД «Трилакт» с титром не ниже 10⁹ КОЕ/мл связан с обеспечением начальной кислотности препарата консорциума лактобактерий не более 115-125° Т, получением исходного титра лактобактерий (не ниже 7×10¹⁰ КОЕ/мл) и использованием оригинальной молочной питательной среды с добавлением глюкозы.

Пример 5. Применение БАД «Трилакт» для коррекции нарушений кишечного биоценоза при соматических заболеваниях, сопровождающихся нарушением функции пищеварительной системы

Клинические исследования проводились на базе Новосибирского Областного детского аллергодерматозного центра, расположенного на базе МУЗ ДГКБ №1, клинико-диагностической и бактериологической лабораторий указанной больницы; Новосибирского центра семейной реабилитации. Важнейшую роль в жизнедеятельности организма человека играет нормальная микрофлора кишечника, подавляющая рост патогенных, гнилостных и газообразующих микроорганизмов, участвуя в обмене веществ и синтезе витаминов, стимулируя иммунную систему. Нарушение качественного и количественного состава нормофлоры, называемое дисбактериозом, приводит к заболеваниям органов пищеварения, системы кроветворения, иммунной системы, развитию гипотрофии, анемии, ферментопатии, способствует аллергизации организма. Поэтому вопросы профилактики и лечения нарушений кишечного биоценоза являются объектом особого внимания. БАД «Трилакт» представляет собой микробную массу живых лактобактерий, изготовленную по примеру 1 и восстановливающую нормальный состав микрофлоры кишечника.

Под наблюдением находилось 30 больных: дети в возрасте от 6-ти месяцев и взрослые в возрасте до 50 лет, имеющие дисбактериоз кишечника не выше 3 степени, не болевшие вирусными гепатитами и давшие информированное согласие на проведение исследований. Группу сравнения составили 30.

Клинические симптомы заболевания до лечения были: недомогание, слабость, головная боль, нарушение сна (73,3%); диспептический синдром в виде снижения аппетита, метеоризма, тошноты (53,3%); боли в животе (50,0%); расстройство стула в виде хронического запора (53,3%) и диареи (13,3%), чередования запора и поноса (3,3%). У 53,3% испытуемых отмечался кожный синдром в виде крапивницы и очагов атонического дерматита в подострой стадии и стадии обострения. У всех 30 человек, включенных в эксперимент (100,0%), были выявлены дисбиотические нарушения кишечника: дисбактериоз I степени у 24 (80,0%), дисбактериоз II степени у 6 (20,0%). 19 человек из 30 (63,3%) имели повышенный титр условно-патогенных бактерий в составе микрофлоры кишечника, 20 (66,7%) - атипичных и ферментативно неполноценных штаммов кишечной палочки.

Курс лечения с использованием БАД «Трилакт» составил 14 дней в возрастной дозе, предусмотренной инструкцией по применению:

• Детям от 6-ти месяцев до 1 года - по рекомендации врача - до 5 мл (1 чайная ложка) в день на 2 приема.

• Детям от 1 года до 7 лет - по 5 мл на 1 прием 2 раза в день.

• Детям от 7 до 12 лет - по 5 мл на 1 прием 3 раза в день.

• Взрослым и детям старше 12 лет применять по 10 мл (1 десертная ложка) на 1 прием 3 раза в день.

Лицам контрольной группы было проведено стандартное лечение. В исследовании использовался препарат, близкий к окончанию срока годности. Согласно результатам оценки клинической эффективности исследуемого препарата оказалось, что улучшение самочувствия в виде нормализации сна, прекращения головных болей и недомогания отмечено у 18 человек из 22 (81,8%), имевших данные симптомы, у 4 человек они значительно уменьшились. Уменьшение диспептического синдрома (исчезновение тошноты, снижение метеоризма и улучшение аппетита) наблюдалось у 9 из 16 (56,3%); прекращение болей в животе у всех 15 человек (100,0%) с данной симптоматикой. Нормализация частоты и консистенции стула отмечена у 17 из 21 (80,9%) испытуемого, отчетливая положительная динамика кожного синдрома наблюдалась у 10 из 16 (62,5%) детей с атопическим дерматитом и рецидивирующей крапивницей, улучшалась функция кишечника, у 22 больных исчезли дискомфорт, вздутие кишечника и урчание в животе. У 5 больных отмечали прекращение диареи в первые сутки, у 18 больных купированы запоры. У всех наблюдавшихся больных улучшился состав микрофлоры толстой кишки. К концу лечения у 24 больных достоверно увеличивалось количество анаэробных микроорганизмов бифидо- и лактобактерий, уменьшилось количество условно-патогенных микроорганизмов.

Таким образом, исследуемый препарат прошел клинические испытания и может считаться безвредным и обладающим высокой активностью в отношении восстановления нормобиоценоза кишечника и ускорения саногенеза при соматических заболеваниях, сопровождающихся нарушением функции пищеварительной системы.

Приведенные примеры показывают, что предлагаемый консорциум штаммов трех видов лактобактерий активно размножается в питательных средах с накоплением производственой биомассы в короткие сроки культивирования. Продукт сквашивает молоко с образованием сгустка с хорошими вкусовыми и органолептическими свойствами; обладает специфической активностью. Консорциум штаммов можно рекомендовать в составе заквасок для приготовления БАД «Трилакт», кисломолочных лечебно-диетических продуктов, неферментированных пищевых продуктов и бактерийных препаратов.

Промышленная применимость

Приведенное описание изобретения излагает весь технологическими процесс получения консорциума и продуктов на его основе, которые могут производится как на молочных кухнях, так и на крупных молочных заводах. Используемые питательные среды и реактивы общедоступны. Средства и приемы для получения и выращивания биомассы консорциума, в том числе, в виде лабораторной и производственной заквасок, а также средства и приемы, обеспечивающие замораживание и лиофилизацию сухого бактерийного препарата, традиционно используются в медицинской промышленности и биотехнологии.

Консорциум штаммов лактобактерий содержит Lactobacillus acidophilus ВКПМ В 5863, Lactobacillus acidophilus ВКПМ В 4108, Lactobacillus plantarum В 3962, Lactobacillus plantarum ВКПМ В 5002, Lactobacillus casei ВКПМ В 5724 и Lactobacillus casei ВКПМ В 3960 в соотношении 1:1:1:1:4:4. Способ включает подготовку молочной питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение до температуры заквашивания и внесение в молочную питательную среду посевной дозы вышеобозначенного консорциума штаммов лактобактерий в количестве не более 5,0 мас.%, сквашивание продукта в течение времени, достаточного для формирования сгустка, и охлаждение готового продукта при температуре не выше +6°С. В качестве молочной питательной среды используют следующие компоненты, мас.%: глюкоза 1,5-2,5, натрий лимоннокислый 0,15-0,25, обезжиренное молоко, нормализованное по сухому остатку СОМО 13,5-15% - остальное. Это обеспечивает повышение сроков хранения и начального титра консорциума лактобактерий в приготавливаемых препаратах, а также более высокий начальный титр готового продукта. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.

1. Консорциум штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus ВКПМ В 5863, Lactobacillus acidophilus ВКПМ В 4108, Lactobacillus plantarum ВКПМ В 3962, Lactobacillus plantarum ВКПМ В 5002, Lactobacillus casei ВКПМ В 5724, Lactobacillus casei ВКПМ В 3960, содержащихся в соотношении 1:1:1:1:4:4, используемый для получения в жидкой форме биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов.

2. Способ получения биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов, включающий подготовку молочной питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение до температуры заквашивания, внесение в молочную питательную среду посевной дозы комбинации штаммов бактерий-пробиотиков в количестве не более 5,0 мас.%, сквашивание до достижения кислотности готового продукта не менее 90°Т и охлаждение готового продукта при температуре не выше +6°С, отличающийся тем, что в качестве комбинации штаммов бактерий-пробиотиков используют консорциум штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus ВКПМ В 5863, Lactobacillus acidophilus ВКПМ В 4108, Lactobacillus plantarum ВКПМ В 3962, Lactobacillus plantarum ВКПМ В 5002, Lactobacillus casei ВКПМ В 5724, Lactobacillus casei ВКПМ В 3960, содержащихся в соотношении 1:1:1:1:4:4, а в качестве молочной питательной среды используют обезжиренное молоко, нормализованное по сухому обезжиренному молочному остатку СОМО 13,5-15%, в которую дополнительно вводят глюкозу и натрий лимоннокислый при следующем соотношении компонентов, мас.%:
глюкоза 1,5-2,5 натрий лимоннокислый 0,15-0,25 обезжиренное молоко, нормализованное   по сухому обезжиренному молочному остатку   СОМО 13,5-15% остальное