ПРИМЕНЕНИЕ ТИМОСАПОНИНА ВII ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ИЛИ ПРОДУКТА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНСУЛЬТА Российский патент 2009 года по МПК A61K31/58 A61P9/10 

Область техники

Настоящее изобретение относится к применению тимосапонина ВII, в частности к применению тимосапонина ВII при получении лекарственного средства или продукта для профилактики и лечения инсульта (апоплексии).

Описание предшествующего уровня техники

Инсульт (апоплексия) включает внезапную потерю нервной функции вследствие нарушения мозгового кровообращения вследствие окклюзии внутричерепных и внечерепных сосудов или сосудистого кровоизлияния, которые серьезно вредят здоровью лиц пожилого и среднего возраста, являясь главной причиной потери трудоспособности и смерти. Примерно у одной трети пациентов, пораженных заболеванием, развитие заболевания вызывает смерть; даже выжившие теряют работоспособность или способность самостоятельного ухода вследствие таких последствий, как гемиплегия и афазия. В настоящее время имеются два способа лечения инсульта: один заключается в уменьшении недостаточности кислорода и глюкозы посредством увеличения кровотока в артериях; другой заключается в защите нейронов посредством блокировки гибели нейронов, вызванной церебральной ишемией и эксцитотоксичностью. Клинически применяемые защищающие нейроны средства включают блокаторы кальциевых каналов, антагонисты рецепторов глутамата и антагонисты NMDA и т.д. Однако ввиду высокой частоты осложнений, смертности и инвалидности имеется немного разработанных лекарственных средств для профилактики и лечения инсульта, что далеко недостаточно для удовлетворения клинической потребности.

Rhizome Anemarrhenae в качестве травяного лекарственного средства представляет собой корневище Anemarrhena asphodeloides Bge, Anemarrhena семейства Liliaceae, которая, главным образом, продуцируется в Hebei, Внутренняя Монголия, Shanxi и Северо-Восточный Китай. В традиционной китайской медицине она используется в качестве препарата для лечения температуры при простуде с эффектами облегчения экзогенных лихорадочных состояний, гиперпирексии и полидипсии, повышенной температуры, связанной с легочной патологией, и сухого кашля, пирексии и лихорадочного состояния, связанных с костной патологией, воспалительных процессов внутренних органов, сахарного диабета и дистрофии слизистой кишечника с запором. Основным компонентом Anemarrhenae являются стероидные сапонины. К настоящему времени сообщалось о 32 видах стероидных сапонинов и сапогенине, выделенных из Anemarrhenae, а также о других компонентах, таких как хромокор, олигосахариды, полисахариды, жирные кислоты и т.д. Kawasaki et al. впервые выделили тимосапонин BII в 1963 г., но не выяснили его химическую структуру. Seiji Nagumo et al. впервые выяснили химическую структуру тимосапонина BII в 1991 г. (Seiji Nagumo et al. J. Pharm. (Japanese), 1991; 111(1): 306-310). С тех пор об экстракции и определении активности тимосапонина BII последовательно сообщили Noboru Nakashima (NOBORU NAKASHIMA et al., Journal of Natural Products, 1993; 56(3): 345-350), Ma Bai ping (Ma BP et al., Yao Xue Xue Bao, 1996; 31 (4):271-277), Masayasu Kimula (Masayasu KIMURA et al., Biol. Pharm. Bull, 1996; 19(7): 926-931), Jianying ZHANG (Jianying Zhang et al., Clinica Chimica Acta, 1999; 289:79-88).

Тимосапонин BII, также называемый прототимосапонином AIII, представляет собой основной компонент Anemarrhenae. Его химическим названием является (25S)-26-O-β-D-глюкопиранозил-22-гидрокси-5β-фуростан-3β,26-диол-3-O-β-D-глюкопиранозил(1→2)-β-D-галактопиранозид со следующей структурной формулой:

Виды фармакологической активности тимосапонина BII, о которых сообщали, главным образом, включают:

1. Гипогликемическую активность. Тимосапонин BII может снижать уровень сахара в крови у мышей с сахарным диабетом, вызванным стрептозоцином, без содействия всасыванию глюкозы и высвобождению инсулина. Предполагается, что механизм снижения уровня глюкозы в крови состоит в ингибировании разрушения сахара в печени (NOBORU NAKASHIMA et al., Journal of Natural Products, 1993; 56(3):345-350).

2. Ингибирование агрегации тромбоцитов. Тимосапонин BII обладает очевидной активностью ингибирования агрегации тромбоцитов и удлинения времени свертывания (Jianying ZHANG et al., Clinica Chimica Acta, 1999; 289:79-88).

3. Выведение свободных радикалов. Наблюдение с использованием парамагнитного способа показывает, что тимосапонин BII может вывести 57% свободных радикалов, генерированных системой реакции Fenton (Ma BP, et al., Yao Xue Xue Bao, 1996; 31(4):271-277).

4. Активность против деменции. Ma Bai ping et al. сообщили, что тимосапонин BII оказывает профилактический и терапевтический эффект против сенильной деменции (заявка на патент Китая № CN1212966, Заявка № 97119680.Х).

Chen Wan sheng et al. сообщили о применении общих тимосапонинов при получении лекарственных средств для профилактики и лечения инсульта (заявка на патент Китая № CN1451384А, Заявка № 03116824.8). Раскрытые в этом документе общие сапонины характеризуются суммарным содержанием тимосапонинов BII, E, B, AIII ≥ 50%.

Описание изобретения

После нескольких лет интенсивных исследований заявители впервые обнаружили и подтвердили активность одного тимосапонина BII в профилактике и лечении инсульта. Указанное соединение может значительно облегчить неврологические симптомы у крыс с ишемией, уменьшить размер инфаркта мозга и степень отека мозга, значительно улучшить гемореологию у экспериментальных животных и снизить воспалительное повреждение, вызванное церебральной ишемией.

Поэтому настоящее изобретение относится к применению тимосапонина BII при получении лекарственного средства или продукта для профилактики или лечения инсульта.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции или продукту для профилактики или лечения инсульта, включающему тимосапонин BII в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

В соответствии с настоящим изобретением тимосапонин BII используют по существу в чистой форме, например чистота тимосапонина BII составляет ≥ 90%.

В соответствии с настоящим изобретением фармацевтическая композиция или продукт, включающий тимосапонин BII, можно вводить различными путями и включать в различные лекарственные формы, например пероральные лекарственные формы, такие как таблетка, капсула, раствор, суспензия; парентеральные лекарственные формы, такие как раствор для инъекций, мазь, трансдермальная система и т.д.

В соответствии с настоящим изобретением непрерывное введение тимосапонина BII (20 мг/кг и 40 мг/кг) в течение 7 дн. может значительно снизить балльную оценку неврологических симптомов у крыс, имеющих тромбоз средней мозговой артерии (МСА) и значительно уменьшить размер инфаркта мозга на модели крыс; введение в дозе 40 мг/кг может значительно снизить содержание воды в мозге, по сравнению с модельной группой (p<0,05, p<0,01).

В соответствии с настоящим изобретением способ подкожной инъекции адреналина плюс погружение в ледяную воду может привести к острому стазу крови на модели крыс, а введение тимосапонина BII (10 мг/кг, 20 мг/кг, 40 мг/кг) может значимо снизить вязкость цельной крови и плазмы при высокой, средней и низкой скоростях сдвига, по сравнению с модельной группой (p<0,05, p<0,01). Тимосапонин BII в дозе 40 мг/кг может значительно улучшить деформационную способность эритроцитов и снизить показатель агглютинации эритроцитов, по сравнению с модельной группой (p<0,05, p<0,01).

Эмболический нитевой способ использовали при получении модели церебральной ишемии-реперфузии у крыс, и ELISA использовали для определения уровней IL-1β, TNF-α, IL-10 и TGF-β в каждой группе. Результаты показали, что тимосапонин BII оказывал значительный защитный эффект против воспалительных реакций на модели церебральной ишемии-реперфузии у крыс.

Подводя итог, можно сказать, что тимосапонин BII можно использовать при профилактике и лечении инсульта.

Способы осуществления изобретения

Следующие примеры представлены для дальнейшей иллюстрации изобретения, но никоим образом не предназначены для его ограничения.

Пример 1

Влияние тимосапонина BII на ишемическое повреждение мозга при тромбозе средней церебральной артерии, вызванном FeCl₃ (MCAT), у крыс

I. Метод

1. Воздействие тимосапонина BII на неврологические симптомы и размер инфаркта мозга у крыс с тромбозом средней церебральной артерии

1.1. Разделение на группы и введение

Экспериментальных животных случайным методом делили на 6 групп, т.е. группу модели МСАТ, группу ложной операции, группу гидергина (0,6 мг/кг), группу тимосапонина BII 10 мг/кг, группу тимосапонина BII 20 мг/кг и группу тимосапонина BII 40 мг/кг. Непрерывное оральное введение препаратов выполняли в течение 7 дн. ежесуточным объемом 5 мл/кг. Операцию выполняли через 1 ч после введения препарата на 7-й д. Животным из групп модели МСАТ и ложной операции давали такой же объем 0,5% раствора СМС.

1.2. Получение ишемического повреждения мозга, вызванного у крыс тромбоэмболией МСА

Для получения модели использовали способы Tamura и Liu с модификациями. Крыс наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией 10% хлоралгидрата (0,35 г/кг) и фиксировали с откинутой правой передней лапой. Аркообразный разрез длиной примерно 1,5 см делали в средней точке в промежутке между краем век и наружным слуховым проходом, и височную мышцу удаляли для обнажения височной кости. В кости под стереоскопическим микроскопом с помощью сверла проделывали отверстие диаметром 2,5 мм в 1 мм в головном направлении от точки соединения скуловой кости и височной кости, остатки тканей удаляли для обнажения средней церебральной артерии (расположенной между обонятельным трактом и нижней церебральной веной). Окружающие ткани были защищены кусочком пластиковой пленки. Небольшой кусочек фильтровальной бумаги, используемой для количественного анализа, который был пропитан 10 мкл 50% раствором хлорида трехвалентного железа, накладывали на этот отрезок средней мозговой артерии. Фильтровальную бумагу удаляли через 30 мин, и местные ткани промывали физиологическим солевым раствором с последующим послойным зашиванием. Затем включенных в эксперимент крыс вновь помещали в клетки содержания. Температуру регулировали, поддерживая на уровне 24°С. У группы ложной операции оперативные процедуры были такими же, как у модельной группы, за исключением наложения раствора хлорида трехвалентного железа.

1.3. Оценка неврологических симптомов в баллах

Экспериментальных животных тестировали через 6 ч и 24 ч после операции в соответствии со способом Bederson с модификациями для выявления типов поведения. Критерии: (1) Крыс поднимали за хвост для наблюдения за сгибательными движениями передних конечностей, причем симметричное вытягивание вперед обеих передних конечностей оценивали в 0 баллов, а возникновение любого или всех из движений в виде сгибания в плечевом суставе, сгибания в локтевом суставе, внутреннего скручивания плеча передней конечности, на стороне, противоположной оперированной стороне, оценивали в 1 балл. (2) Животное помещали на плоскую поверхность, и его плечи растягивали в противоположном направлении для проверки сопротивления. Равномерное и сильное сопротивление с обеих сторон оценивали в 0 баллов, а снижение сопротивления с противоположной стороны оценивали в 1 балл. (3) Обе передние конечности крысы помещали на проволочную сетку для наблюдения мышечного напряжения. Равномерное и сильное давление с обеих сторон оценивали в 0 баллов, а снижение мышечного напряжения с противоположной стороны оценивали в 1 балл. (4) Крысу поднимали за хвост, и животному, проявляющему непрерывные вращения в направлении, противоположном стороне операции, давали оценку в 1 балл. В соответствии с представленными выше критериями полная балльная оценка составляет 4, и чем выше балльная оценка, тем тяжелее поведенческое расстройство у животного.

1.4. Определение размера инфаркта мозга

После поведенческой оценки животных декапитировали для удаления мозга. Удаляли обонятельную луковицу, мозжечок и нижний отдел ствола мозга, а оставшуюся часть разрезали на пять венечных срезов при температуре ниже 4°С. Срезы немедленно помещали в раствор ТТС (хлорида трифенилтетразолия) для окрашивания (содержащий 1,5 м 4% ТТС, 0,1 мл 1М K₂HPO₄ и воду (остальная часть) на 5 мл окрашивающего раствора) с последующей инкубацией в темноте при 37°С в течение 30 мин. Затем срезы переносили в раствор 10% формальдегида и инкубировали в темноте в течение 24 ч. После окрашивания неишемические области становились красными, а области инфаркта были белыми. Белые ткани осторожно собирали и взвешивали. Степень инфаркта мозга выражали в виде процентной доли (%) ткани, подвергшейся инфаркту, от всей ткани мозга, и также от пораженной стороны мозга.

2. Воздействие тимосапонина ВII на содержание воды в тканях мозга при тромбозе средней мозговой артерии (МСАТ) у крыс

2.1. Разделение на группы, введение и способы моделирования (см.1 выше)

2.2. Определение содержания воды в тканях мозга

Крыс декапитировали через 24 ч после операции, мозг удаляли и делили на левое и правое полушария. Для промокания поверхности использовали фильтровальную бумагу, и соответственно определяли влажную массу каждого полушария. Затем выполняли сушку тканей мозга при 105°С в течение 48 ч с последующим точным взвешиванием для определения сухой массы. Содержание воды в мозге рассчитывали в соответствии со следующей формулой:

Содержание воды в мозге = (влажная масса - сухая масса)/влажную массу х 100%

3. Статистический анализ

Экспериментальные данные выражали в виде x ± s. Результаты анализировали, используя программное обеспечение SPSS, и t критерий использовали для выполнения сравнения групп.

II. Результаты

1. Воздействие тимосапонина ВII на неврологические симптомы и размер инфаркта мозга при тромбозе средней мозговой артерии у крыс

Результаты показаны ниже в таблице 1.

Таблица 1
Воздействие тимосапонина ВII на неврологические симптомы и размер инфаркта мозга при тромбозе средней мозговой артерии у крыс (x ± s) Группа Дозировка, мг/кг n Размер инфаркта мозга Балльная оценка неврологических симптомов процентная доля всей ткани мозга (%) процентная доля ткани пораженной стороны (%) 6 ч 24 ч Ложная операция - 12 0±0 0±0 0,08±0,29 0,17±0,39 Модель МСАТ - 12 4,58±1,59^ΔΔ 8,76±2,98^ΔΔ 2,73
±1,01^ΔΔ 2,55±
0,52^ΔΔ Гидергин 0,6 11 1,98±0,72** 3,75±1,38** 1,91
±0,83** 1,55
±0,69** Тимосапонин ВII 10 12 3,27±1,74 6,35±3,39 2,08±0,67 2,08±0,79 Тимосапонин ВII 20 11 2,92±1,20* 5,37±2,20* 1,82±0,75* 2,00±0,45* Тимосапонин ВII 40 10 1,99±1,20** 3,88±2,38** 1,50
±0,71** 1,90±0,74* Примечания: ^ΔΔP<0,01, в сравнении с группой ложной операции; *P<0,05, **P<0,01, в сравнении с модельной группой.

Результаты указывают на то, что, по сравнению с группой ложной операции, животные группы модели МСАТ и каждой группы введения проявили различные степени очага инфаркта и симптомов, подобных гемиплегии. Тимосапонин ВII в дозе 20 и 40 мг/кг значительно уменьшал размер инфаркта мозга и облегчал неврологические симптомы у животных из группы модели (P<0,05, P<0,01).

2. Воздействие тимосапонина ВII на содержание воды в тканях мозга у крыс с тромбозом средней мозговой артерии (МСАТ)

Результаты показаны ниже в таблице 2.

Таблица 2
Воздействие тимосапонина ВII на содержание воды в тканях мозга при тромбозе средней мозговой артерии у крыс (x ± s) Группа Дозировка, мг/кг n Содержание воды в непораженном полушарии (%) Содержание воды в пораженном полушарии (%) Ложная операция - 12 79,60±0,49 79,59±0,48 Модель МСАТ - 12 79,54±0,80 81,12±0,90^ΔΔ Нимодипин 12 12 79,44±0,41 80,37±0,73* Тимосапонин ВII 10 12 79,51±0,57 80,52±0,69 Тимосапонин ВII 20 12 79,41±0,38 80,46±0,79 Тимосапонин ВII 40 12 79,47±0,44 80,15±0,99* Примечания: ^ΔΔP<0,01, в сравнении с группой ложной операции; *P<0,05, в сравнении с модельной группой.

Как показано в таблице 2, тимосапонин ВII в дозе 40 мг/кг значительно уменьшал содержание воды в пораженном полушарии и облегчал отек мозга на модели у крыс (P<0,05).

III. Обсуждение и резюме

Модель тромбоза средней мозговой артерии представляет собой обычную экспериментальную модель очаговой церебральной ишемии, которая объективно имитирует клиническое обстоятельство инфаркта мозга в бассейне средней мозговой артерии и имеет преимущества легкого регулирования местных условий и возможности повторения, аналогии течению клинического церебрального инсульта и фиксированной локализации тромба. Как показывают результаты, через 6 ч или 24 ч после операции наблюдались симптомы, аналогичные гемиплегии, увеличение содержания воды на стороне тромбоза и выраженный инфаркт мозга (по данным окрашивания ТТС). По сравнению с группой ложной операции, в группе тимосапонина ВII в дозе 20 и 40 мг/кг значительно уменьшился размер инфаркта мозга и облегчались неврологические симптомы (P<0,05, P<0,01). Кроме того, по сравнению с модельной группой, степень отека мозга в группе тимосапонина ВII 40 мг/к была значительно снижена (P<0,05). Эти результаты свидетельствуют о том, что препарат оказывает защитный эффект против ишемического повреждения мозга.

Пример 2

Влияние тимосапонина BII на гемореологию на модели острого застоя крови у крыс

I. Метод

1. Разделение на группы и введение

Экспериментальные животные случайным методом были разделены на шесть групп на основании массы тела, т.е. модельную группу, нормальную контрольную группу, группу нимодипина (12 мг/кг), группу тимосапонина BII 10 мг/кг, группу тимосапонина BII 20 мг/кг и группу тимосапонина BII 40 мг/кг. Непрерывное пероральное введение препаратов выполняли в течение 5 дн. ежесуточным объемом 5 мл/кг. Нормальной контрольной группе и модельной группе давали одинаковый объем 0,5% раствора СМС.

2. Способ моделирования

Для получения этой модели модифицировали способ MAO Teng-min. Крысам проводили подкожную инъекцию 0,8 мг/кг адреналина дважды через 1 ч и 5 ч после введения на 5-й день, и их помещали в ледяную воду при 4°С на 5 мин через 2 ч после первой инъекции адреналина.

3. Оценка величин вязкости цельной крови и плазмы

Крыс наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией 10% хлоралгидрата (0,35 г/кг) через 1 ч после последнего введения. Кровь собирали из сонной артерии и обрабатывали 1% гепарином. 0,8 мл крови после введения антикоагулянта тестировали в вискозиметре крови, и вязкость цельной крови представляли вязкостью крови, тестированной при высокой (200S^-1), средней (30S^-1), низкой (5S^-1) и очень низкой (1S^-1) скоростях сдвига. Кроме того, кровь после введения антикоагулянта центрифугировали при 3000 об/мин в течение 8 мин для получения плазмы в виде надосадочной жидкости, и 0,8 мл плазмы тестировали для определения вязкости плазмы при 100S^-1 в вискозиметре крови.

4. Определение агрегации и деформационной способности эритроцитов

К 40 мкл гепаринизированной крови добавляли 1 мл деформирующего раствора и тщательно смешивали. Образец 0,8 мл тестировали в тестере агрегации/деформационной способности эритроцитов, и деформационную способность эритроцитов выражали в виде показателя максимальной деформации эритроцитов и площади под кривой (SSS). Другие 0,8 мл тестировали в тестере агрегации/деформационной способности эритроцитов, и агрегацию эритроцитов выражали в виде показателя максимальной агрегации эритроцитов (MAXD) и площади под кривой (SSS).

5. Статистический анализ

Экспериментальные данные выражали в виде x ± s. Результаты анализировали, используя программное обеспечение SPSS, и t критерий использовали для выполнения сравнения групп.

II. Результаты

1. Воздействие тимосапонина ВII на величины вязкости цельной крови и плазмы на модели острого застоя крови у крыс

Результаты показаны ниже в таблице 3.

Таблица 3
Воздействие тимосапонина ВII на величины вязкости цельной крови и плазмы на модели острого застоя крови у крыс (x ± s) Группа Дози-
Ровка, мг/кг n Вязкость цельной крови Вязкость плазмы
(100S^-1) 200S^-1 30S^-1 5S^-1 1S^-1 Пустой контроль - 13 3,81
±0,42 5,42
±0,60 10,34
±1,41 25,74
±4,64 1,33
±0,11 Модель - 14 5,05
±0,74^ΔΔ 7,56
±1,18^ΔΔ 15,52
±3,28^ΔΔ 41,48
±11,64^ΔΔ 1,53
±0,11^ΔΔ Нимодипин 12 12 4,51
±0,55^* 6,47
±0,92^* 12,34
±2,58^** 30,45
±8,74^* 1,41
±0,14^* Тимосапонин ВII 10 10 4,45
±0,71 6,10
±0,85** 11,02
±1,38^** 27,03
±4,64^** 1,40
±0,10^** Тимосапонин ВII 20 13 4,49
±0,70 6,55
±0,93^* 12,91
±1,82^* 33,13
±5,70^* 1,36
±0,10^** Тимосапонин ВII 40 12 4,42
±0,38^* 6,45
±0,60^** 12,46
±1,33^** 31,21
±4,29^** 1,38
±0,12^** Примечания: ^ΔΔP<0,01, в сравнении с группой пустого контроля; *P<0,05, **P<0,01, в сравнении с модельной группой.

Результаты указывают на то, что, по сравнению с группой нормального контроля, величины вязкости цельной крови и плазмы значительно увеличились на модели застоя крови у крыс через 24 ч после моделирования (P<0,01). Тимосапонин ВII в дозе 10, 20 и 40 мг/кг значительно снижал величины вязкости цельной крови и плазмы при высокой, средней и низкой скоростях сдвига у крыс группы модели (P<0,05, P<0,01).

2. Воздействие тимосапонина ВII на агрегацию и деформационную способность эритроцитов на модели острого застоя крови у крыс

Результаты показаны ниже в таблице 4.

Таблица 5
Воздействие тимосапонина ВII на агрегацию и деформационную способность эритроцитов на модели острого застоя крови у крыс (x ± s) Группа Дози-
ровка, мг/кг n Агрегация эритроцитов Деформационная способность эритроцитов MAXD SS MAXDI SSS Пустой контроль - 13 0,52
±0,13 94,97
±25,97 0,71
±0,03 365,02
±20,48 Модель - 14 0,89
±0,11^ΔΔ 176,52
±19,74^ΔΔ 0,69
±0,02^Δ 349,22
±10,59^Δ Нимодипин 12 12 0,80
±0,09^* 160,38
±16,50^* 0,70
±0,03 353,92
±15,83 Тимосапонин ВII 10 10 0,94
±0,14 186,67
±28,85 0,72
±0,05 363,88
±19,58 Тимосапонин ВII 20 13 0,81
±0,26 163,04
±50,23 0,71
±0,05 363,97
±27,87 Тимосапонин ВII 40 12 0,76
±0,14^* 152,78
±28,11^* 0,73
±0,03^** 374,26
±15,82^** Примечания: ^ΔP<0,05, ^ΔΔP<0,01, в сравнении с группой пустого контроля; *P<0,05, **P<0,01, в сравнении с модельной группой.

Результаты указывают на то, что, по сравнению с группой пустого контроля, у крыс из группы модели застоя крови проявились увеличенный показатель агрегации эритроцитов и сниженный показатель деформационной способности эритроцитов (P<0,05, P<0,01) через 24 ч после моделирования. По сравнению с крысами из группы модели, у крыс из группы тимосапонина ВII 40 мг/кг проявились значительное увеличение показателя деформационной способности эритроцитов и уменьшение показателя агрегации эритроцитов (P<0,01).

III. Обсуждение и резюме

Гемореология представляет собой отрасль науки, относящуюся к текучести крови, а также агрегации, свертываемости и деформационной способности клеток крови. Гемореологические показатели, такие как удельная вязкость цельной крови, удельная вязкость плазмы, показатель агрегации эритроцитов и фибриноген могут изменяться у пациентов, страдающих ишемическим цереброваскулярным заболеванием. Поэтому улучшение гемореологии, включая уменьшение вязкости крови и агрегации эритроцитов и увеличение деформационной способности эритроцитов, имеют решающее значение в профилактике и лечении ишемических цереброваскулярных заболеваний. В настоящем исследовании крысам подкожно инъецировали большую дозу адреналина для стимуляции состояние гнева и тревоги, и их помещали в ледяную воду для имитации состояния озноба. Таким путем копировалась модель острого застоя крови с признаками вязкой, густой, свернувшейся и агрегированной крови. Результаты исследования показали, что тимосапонин ВII может значительно ингибировать агрегацию эритроцитов, увеличивать деформационную способность эритроцитов и снижать величины вязкости цельной крови и плазмы при высокой, средней и низкой скорости сдвига у крыс с моделью острого застоя крови, свидетельствуя о том, что препарат может значительно улучшить гемореологию.

Пример 3

Воздействие тимосапонина ВII на воспалительные факторы в тканях мозга у крыс с церебральной ишемией-реперфузией

Эмболический нитевой способ использовали при получении модели церебральной ишемии-реперфузии у крыс и ELISA использовали для определения уровней IL-1β, TNF-α, IL-10 и TGF-β в каждой группе с тем, чтобы исследовать защитный эффект тимосапонина ВII против воспалительных факторов на модели церебральной ишемии-реперфузии у крыс.

I. Метод

1. Разделение на группы и введение

Крыс случайным методом делили на шесть групп на основании массы тела, т.е. группу ложной операции, группу модели, группу нимодипина (12 мг/кг), группу тимосапонина BII 10 мг/кг и группу тимосапонина BII 40 мг/кг. Все препараты включали в препаративную форму с 0,5% СМС. Крыс каждой группы использовали для экспериментов после двухдневного наблюдения и содержания. Непрерывное пероральное введение препаратов выполняли в течение 5 дн. при суточном объеме 10 мл/кг. Группе ложной операции и группе модели давали одинаковый объем 0,5% раствора СМС 1 раз/д. Операцию проводили через 1 ч после введения препарата утром 5-го дня.

2. Способ моделирования

Модель обструкции средней мозговой артерии (МСАО) получали в соответствии с описанием Koizumi и Nagasawa. Крысам внутрибрюшинно (в/б) инъецировали 10% хлоралгидрат в дозе 0,35 г/кг и фиксировали в положении лежа на спине. После местной стерилизации начинали операцию. Препарировали правую общую сонную артерию (ССА), правую внутреннюю сонную артерию (ICA) и наружную сонную артерию (ЕСА) и под них подводили нити для будущего использования. ЕСА и ССА перевязывали. Вскоре после пережатия дистального конца ICA артериальным зажимом производили разрез у разветвления ЕСА и ICA и вводили одну нейлоновую нить с одним концом, нагретым для придания ему утолщения в форме луковицы (нить диаметром 0,25 мм, маркированная в 2 см от утолщенного в виде луковицы конца, а передний конец эмболической нити обрабатывали парафином для будущего использования). После введения нити в ICA нить и впускное отверстие ICA слегка затягивали лигатурой, и затем артериальный зажим снимали. Нейлоновую нить вводили дальше в ICA и слегка вытягивали, когда появлялось небольшое сопротивление, до тех пор, пока она не достигала глубины примерно 18,5±0,5 мм, вызывая обструкцию МСА и, следовательно, церебральную ишемию. На впускное отверстие снова накладывали лигатуру, оставляя снаружи нейлоновую нить длиной 1 см. Мышцы и кожу зашивали, и крысам внутрибрюшинно инъецировали гентамицин сульфат в дозе 0,4 мл на крысу. Через 3 ч конец нити осторожно вытягивали наружу до тех пор, пока не появлялось сопротивление, приводя к реперфузии МСА. Таким образом, моделирование было завершено. У группы ложной операции была перевязана только правая ССА без разреза и введения нити. Критерии включения: были включены животные, у которых через 3 ч после создания ишемии проявлялись признаки вращения противоположной передней конечностью, ходьба по круговому проходу или падение в противоположном направлении при ходьбе. Исключались животные, которые через 3 ч не проявляли этих признаков или еще находились в бессознательном состоянии.

3. Получение гомогенатов ткани

Животных декапитировали через 3 ч после создания ишемии и через 21 ч после реперфузии. Удаляли обонятельную луковицу, мозжечок и нижний отдел ствола мозга, а оставшуюся часть правого полушария гомогенизировали в физиологическом солевом растворе при 4°С до концентрации 10%.

4. ELISA анализы IL-1β, TNF-α, IL-10 и TGF-β

(1) Построение стандартной кривой

Были установлены 8 стандартных лунок, и в каждую добавили 100 мкл раствора для разбавления образца. В первую лунку добавляли 100 мкл стандарта, тщательно смешивали и затем 100 мкл пипеткой переносили во вторую лунку. Этот процесс двойного разбавления повторяли до 7-й лунки. Наконец, 100 мкл набирали пипеткой из 7-й лунки и выливали, так что объем в каждой лунке составил 100 мкл. 8-я лунка служила в качестве пустого контроля.

(2) Загрузка

150 мкл образца добавляли в каждую лунку с образцом.

(3) Реакционный планшет тщательно смешивали и помещали на 120 мин в термостат при 37°С.

(4) Промывание планшетов

Реакционные планшеты тщательно 4-6 раз промывали промывочным раствором и промокали фильтровальной бумагой.

(5) В каждую лунку добавляли 50 мкл рабочего антитела первого антитела, и планшет помещали на 60 мин в термостат при 37°С.

(6) Промывание планшетов: см. выше.

(7) В каждую лунку добавляли 100 мкл рабочего раствора, конъюгированного с ферментом антитела, и планшет помещали на 60 мин в термостат при 37°С.

(8) Промывание планшетов: см. выше.

(9) В каждую лунку добавляли 100 мкл рабочего раствора субстрата, и планшет помещали на 5-10 мин в темное место при 37°С.

(10) В каждую лунку добавляли 1 каплю останавливающего раствора и тщательно смешивали.

(11) Считывали показания спектральной поглощательной способности при 492 нм.

5. Расчет результатов

Расчет проводили после вычитания контрольной величины из всех величин OD (оптической плотности). Величины OD для стандарта при 1000, 500, 250, 125, 62, 31, 16 и 0 пг/мл наносили на график на полулогарифмическую бумагу для получения стандартной кривой. Уровень соответствующего воспалительного фактора можно определить по стандартной кривой на основании величины OD-образца.

6. Статистический анализ

Экспериментальные данные выражали в виде x ± s. Результаты анализировали, используя программное обеспечение SPSS, и t критерий использовали для выполнения сравнения групп.

II. Результаты

I. Воздействие тимосапонина ВII на воспалительные факторы у крыс на модели церебральной ишемии-реперфузии. Результаты показаны в табл.5.

Таблица 5
Воздействие тимосапонина ВII на IL-1β, TNF-α, IL-10 и TGF-β у крыс на модели ишемии-реперфузии (x ± s) Группа Дозировка, мг/кг n IL-1β
(пг/мл) TNFα
(пг/мл) IL-10
(пг/мл) TGF-β
(пг/мл) Ложная операция - 8 9,42
±0,94 7,91
±0,36 3,55
±3,03 12,89
±4,51 Модель - 8 10,95
±0,74^ΔΔ 8,74
±0,70^ΔΔ 16,75
±3,45^ΔΔ 17,69
±2,84^Δ Нимодипин 12 8 9,01
±0,81^** 7,92
±0,56^* 4,98
±3,54^** 12,01
±2,54^** Тимосапонин ВII 10 8 9,70
±0,30^** 8,44
±0,62 14,49
±11,78 12,70
±3,57^* Тимосапонин ВII 40 8 7,98
±0,80^** 7,65
±0,61^** 11,19
±5,16^* 10,30
±3,79^** Примечания: ^ΔP<0,05, ^ΔΔP<0,01, в сравнении с группой ложной операции; *P<0,05, **P<0,01, в сравнении с модельной группой.

Результаты экспериментов указывают на то, что, по сравнению с группой ложной операции, уровни провоспалительных факторов IL-1β и TNF-α в мозговой ткани крыс с моделью церебральной ишемии-реперфузии значительно увеличились, а уровни защитных воспалительных факторов IL-10 и TGF-β также значительно увеличились, и величины разности были статистически значимыми. Положительный контроль нимодипина и тимосапонина ВII в дозе 40 мг/кг значительно снижали уровни этих воспалительных факторов и, таким образом, оказывали очевидные защитные эффекты при воспалительных реакциях у крыс с моделью ишемии-реперфузии.

Предложено применение тимосапонина ВII (25S)-26-O-β-D-глюкопиранозил-22-гидрокси-5β-фуростан-3β,26-диол-3-O-β-D-глюкопиранозил(1→2)-β-D-галактопиранозида, он же прототимосапонин АIII, основного компонента Anemarrhenae, возможно с чистотой ≥90%, при получении лекарственного средства для профилактики или лечения инсульта (апоплексии). Показано, что тимосапонин ВII, ранее известный выведением 57% свободных радикалов, облегчает неврологические симптомы у крыс с церебральной ишемией, уменьшает размер инфаркта мозга, отек мозга, воспалительное повреждение при церебральной ишемии, улучшает гемореологию (снижает вязкость крови и агрегацию эритроцитов, увеличивает их деформационную способность). 1 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Применение тимосапонина ВII при получении лекарственного средства для профилактики или лечения инсульта (апоплексии).

2. Применение тимосапонина BII по п.1, отличающееся тем, что чистота тимосапонина BII составляет ≥90%.