ШТАММ 5А10 ПОСТОЯННОЙ ГИБРИДОМНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К IgG КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2009 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к получению штаммов гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы при изготовлении высокоспецифических диагностических реагентов для выявления антител крупного рогатого скота к различным инфекционным агентам, в частности вирусу лейкоза крупного рогатого скота.

Вирус лейкоза крупного рогатого скота вызывает злокачественное лимфопролиферативное заболевание крупного рогатого скота - лейкоз, который занимает первое место в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота в РФ. Инфекционный процесс характеризуется отсутствием виремии с одновременной продукцией антител к белкам вируса, среди которых преобладают антитела к гликопротеиду вирусной оболочки (gp51).

Для диагностики болезни наиболее широко применяются серологические методы исследования, а именно реакция диффузионной преципитации в геле агара (РДП) и иммуноферментный анализ (ИФА).

Наибольшей чувствительностью и специфичностью при выявлении антител к вирусу лейкоза обладают тест-системы, в основу которых положен принцип иммуноферментного анализа. Использование моноклональных антител для приготовления меченных пероксидазой видоспецифических антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота позволяет повысить специфичность анализа. В разработанной нами тест-системе для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологических жидкостях крупного рогатого скота для иммобилизации антигена применяются моноклональные антитела овцы Ovis aries к гликопротеидному антигену вируса лейкоза, продуцируемые межвидовой гибридной линией 8С12 и моноклональные антитела мыши Mus. musculus к иммуноглобулину IgG овцы, продуцируемые штаммом 1Н8.

Это обусловило необходимость использования в качестве детектирующих моноклональных антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота, не обладающих перекрестной иммунореактивностью с иммуноглобулинами овцы и мыши. Использование этих моноклональных антител для приготовления меченных пероксидазой видоспецифических антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота позволяет повысить специфичность анализа.

Известен штамм 7DS, продуцирующий моноклональные антитела к IgG крупного рогатого скота. Штамм 7DS продуцирует моноклональные антитела мыши подкласса γ1-иммуноглобулина G (IgG). Активность моноклональных антител в асцитной жидкости составляла 1:25600 в ИФА и 1:4 в РДП. Моноклональные антитела обладали широкой видоспецифичностью, реагируя с иммуноглобулинами не только крупного рогатого скота, но и человека, оленя, свиньи, мыши, овцы и козы [1].

В задачу наших исследований входило получить штамм постоянной гибридомной линии клеток, обладающий in vitro высокой продукцией моноклональных антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота, не дающих перекрестных реакций с иммуноглобулинами овцы и позволяющих использовать их в иммуноферментном анализе в качестве детектирующих антител, меченных пероксидазой.

Предлагаемый штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток перевиваемой культуры миеломы мыши P3-X63-Ag-8. 653 с лимфоцитами селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной двукратно введением 100 мкг препарата иммуноглобулина IgG крупного рогатого скота, очищенного хроматографическими методами.

На высоте иммунного ответа (через 3 дня после последней инъекции) провели слияние спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии P3-X63-Ag-8. 653.

Слияние клеток проводили по стандартной методике с использованием ПЭГ с м.м. 1500. Соотношение клеток миеломы и лимфоцитов составляло 1:4-1:10. Селекцию гибридом проводили на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибридомы культивировали на 96-луночных панелях производства фирмы «Nunc» на среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров в атмосфере, содержащей 5% СО₂.

Скрининг гибридом на продукцию специфических моноклональных антител проводили методом твердофазного ИФА с использованием препаратов очищенных IgG крупного рогатого скота и овцы и мыши для сенсибилизации твердой фазы и конъюгата поликлональных видоспецифических антител к иммуноглобулину IgG мыши с пероксидазой - для выявления связавшихся антител.

Клонирование и реклонирование клеточных культур проводили методом предельных разведений с использованием макрофагального фидерного слоя.

В результате был отобран и размножен клон клеток, продуцирующий моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота. Этот клон клеток был последовательно размножен в 96-, 24-луночных панелях, а затем в культуральных матрасах.

Культуральная жидкость была исследована на содержание специфических антител. Титр специфических антител в ИФА составлял 1:32-1:64. Препараты моноклональных антител получали трехкратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом. Была определена видовая принадлежность и специфичность моноклональных антител методом ИФА.

Предложенный штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки: Клетки однородные, округлой формы с крупным овальным ядром, содержащим от 1 до 3, чаще 1-2 ядрышек. При посеве клетки равномерно распределяются на поверхности субстрата и в культуральной жидкости. Индекс пролиферации равен 5-6.

Культуральные свойства. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров. Клетки размножаются в суспензии и частично - прикрепляясь к поверхности культурального сосуда. Посевная концентрация 1×10⁴ клеток/мл. Через 5-7 суток с момента посева 80% культуральной жидкости удаляют вместе с находящимися в ней клетками. К оставшимся клеткам добавляют такой же объем свежей питательной среды, рН 7,2-7,4. Периодичность субкультивирования - 1 раз в 3-5 суток. Кратность рассева 1:5.

Культивирование в организме животных. Клетки вызывают образование асцитов у линейных мышей BALB/c, обработанных пристаном за 7-10 дней до внутрибрюшинного введения 2-10×10⁶ клеток/мышь. Активность в ИФА асцитной жидкости составляет 1:640-1:5120.

Иммунологические свойства. Штамм продуцирует моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота, не имеющие перекрестной реактивности с иммуноглобулинами овцы. Специфичность антител определяют методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG крупного рогатого скота и овцы. В планшет вносят культуральную жидкость и инкубируют 1,5 часа при 37°С, вносят конъюгат антител против иммуноглобулина IgG мыши с пероксидазой, инкубируют в том же режиме. После каждого этапа реакции проводят отмывание лунок от не связавшихся реагентов. Вносят субстратную смесь. После развития окрашивания в течение 10 мин измеряют оптическую плотность продуктов реакции. Значения оптической плотности в лунках, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG крупного рогатого скота и овцы, составляют соответственно более 1,5 и менее 0,05.

Определение активности культуральной или асцитической жидкостей проводят методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG крупного рогатого скота. Готовят двукратные серийные разведения исследуемого материала и проводят анализ аналогично исследованию на специфичность. В качестве контроля используют сыворотку крови интактных линейных мышей BALB/c в разведении 1:25. За титр принимают то наибольшее разведение исследуемого материала, для которого оптическая плотность в два или более раз превышает оптическую плотность в контроле. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:32-1:64, в асцитической жидкости - 1:640-1:5120.

Контаминация. Контаминация простейшими, грибами, бактериями, микоплазмами, вирусами не выявлена.

Хранение культур. Среда для замораживания: 70% среды RPMI-1640, 20% сыворотки эмбрионов коров, 10% диметилсульфоксида. Концентрация клеток в пластиковых криопробирках 1,5×10⁶ клеток/мл среды. Режим замораживания: до -70°С - 1°/мин, далее - жидкий азот (-196°С). Восстановление после замораживания: быстрое размораживание при 37°С, центрифугирование при 1200 об/мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде. Жизнеспособность после размораживания 70-80%.

Штамм используют при изготовлении диагностической тест-системы для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

Предложенный штамм гибридных клеток мыши Mus. musculus 5А10 - продуцент моноклональных антител мыши к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота депонирован и хранится в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) г.Москвы под №71.

Штамм гибридных клеток 5А10 является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодным для биотехнологии при наработке препаратов.

Свойства штамма и продуцируемых им моноклональных антител отражены в конкретных примерах.

Пример 1. Иммунологические свойства моноклональных антител.

Специфичность антител определяют методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG крупного рогатого скота и овцы. В планшет вносят культуральную жидкость и инкубируют 1,5 часа при 37°С, вносят конъюгат антител против иммуноглобулина IgG мыши с пероксидазой, инкубируют в том же режиме и вносят субстратную смесь, содержащую перекись водорода и ТМБ. После развития окрашивания в течение 10 мин останавливают реакцию добавлением раствора серной кислоты и измеряют значения оптической плотности. Значения оптической плотности в лунках, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG крупного рогатого скота и овцы, составили соответственно 1,876 и 0,029. Отношение оптических плотностей, превышающее 64, свидетельствует о том, что моноклональные антитела реагируют с иммуноглобулинами крупного рогатого скота, но не реагируют с иммуноглобулинами овцы.

Пример 2. Культивирование штамма in vitro и количественная оценка продукции антител. Клетки штамма 5А10 культивируют в стеклянных матрасах при температуре 37,0°С в питательной среде, состоящей из среды RPMI-1640 и 10% сыворотки крови эмбрионов крови антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 500000 ЕД/л). Оптимальная плотность посадки 2×10⁴ клеток на мл среды. Через 3-5 суток после образования суспензии культуральную жидкость частично удаляют и добавляют необходимое количество свежей питательной среды. Титр антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота в культуральной жидкости в ИФА составил 1:64.

Пример 3. Культивирование в организме животных и количественная оценка продукции антител. Клетки штамма в дозе 2-10×10⁶ клеток/мышь в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера вводили в брюшную полость линейных мышей BALB/c, которым предварительно за 7 суток ввели 0,3 мл пристана. На 10-14 сутки получали асцитическую жидкость, титр специфических моноклональных антител к IgG крупного рогатого скота в которой составил в ИФА 1:2560.

Пример 4. Получение конъюгата моноклональных антител с пероксидазой. Из асцитической жидкости получали препарат антител трехкратным осаждением раствором сульфата аммония 50% от насыщения с последующим диализом против

0,01 М натрий-карбонатного буфера, рН 9,5. Содержание антител в препарате составляло 10-12 мг/мл. Связывание антител с пероксидазой из корней хрена проводили методом, разработанным Wilson, Nakane после активации фермента перйодатом натрия [2]. Активность полученного конъюгата в иммуноферментном анализе для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота составила 1:15000.

Пример 5. Проведение иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител. Препараты моноклональных антител, меченные пероксидазой, использовали в качестве детектирующих антител в иммуноферментном анализе для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотке крови крупного рогатого скота. Для иммобилизации антигена применяли трехстадийный метод фиксации. На первой стадии поверхность пластика микропанели для титрования сенсибилизировали за счет неспецифической адсорбции препаратом моноклональных антител к иммуноглобулинам овцы, продуцируемых штаммом 1Н8 (депонирован в СХЖ РАСХН по №73) из раствора с концентрацией 5 мкг/мл при рН 7,2-2-7,4. Инкубацию проводили в течение 16-20 часов при 4°С. На второй стадии проводили иммобилизацию за счет специфического иммунологического взаимодействия моноклональных антител к гликопротеидному антигену gp51 ВЛКРС из культуральной жидкости штамма 8С12 (депонирован в СЖЖ РАСХН под №72) в течение 1,5 часов при 37°С. На третьей стадии проводили иммобилизацию также за счет специфического иммунологического взаимодействия антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота из культуральной жидкости вируспродуцирующей культуры. Избыток реагентов после каждой стадии сенсибилизации твердой фазы и проведения иммуноферментного анализа отмывали раствором детергента на фосфатно-солевом буферном растворе. Вносили контрольные и анализируемые образцы сыворотки крови крупного рогатого скота и инкубировали в течение 1,5 часов при 37°С. В качестве детектирующих антител использовали меченные пероксидазой моноклональные антитела против глобулинов крупного рогатого скота, не дающие перекрестных реакций с иммуноглобулинами овцы, продуцируемые штаммом 5А10 (депонирован в СХЖ РАСХН под №71). Инкубацию проводили в течение 1,5 часов при температуре 37°С. Учет реакции проводили по изменению оптической плотности анализируемых образцов по сравнению с контрольными образцами после добавления субстратной смеси, содержащей тетраметилбензидин (ТМВ) и перекись водорода Н₂О₂. Положительными считали пробы, оптическая плотность которых в два и более раз превышала оптическую плотность отрицательного контроля.

При проведении исследования 662 сывороток крови крупного рогатого скота из неблагополучного по лейкозу хозяйства параллельно в реакции диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментном анализе. Совпадение результатов (РДП+/ИФА+; РДП-/ИФА-) отмечали в 560 или 84,6%, несовпадение (РДП+/ИФА-; РДП-/ИФА+) - в 15,4% случаев. Только 3 положительные по результатам РДП пробы прореагировали отрицательно в ИФА (0,5%). В ИФА было выявлено 190(28,7%) положительных проб, тогда как в РДП - только 94(14,2%), т.е. на 14,5% или в два раза больше.

По чувствительности метод иммуноферментного анализа превосходил РДП с гликопротеидным антигеном и не уступал ей по специфичности.

Предложенный штамм апробирован с положительным результатом в лабораторных условиях Всероссийского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко и Курской биофабрики с 2006 по 2007 гг.

Технико-экономическое обоснование. Получен штамм 5А10 гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота, характеризующийся следующими полезными свойствами:

- является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодным для биотехнологии при наработке препаратов;

- обладает высоким уровнем продукции моноклональных антител. Титры антител в нативной культуральной жидкости составляли 1:32-1:64, в асцитической жидкости 1:640-1:5120 в иммуноферментном анализе;

- моноклональные антитела специфичны к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота;

- моноклональные антитела не реагируют с иммуноглобулинами

овцы;

- моноклональные антитела, меченные пероксидазой, обеспечивают высокую чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологическом материале, полученном от крупного рогатого скота.

Штамм 5А10 - продуцент моноклональных антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота - найдет применение при изготовлении иммуноферментной тест-системы для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Использование этой тест-системы позволит повысить эффективность оздоровительных мероприятий, уменьшить сроки оздоровления неблагополучных по лейкозу животноводческих хозяйств и в итоге - резко снизить заболеваемость крупного рогатого скота лейкозом.

Источники информации

1. Ж.Сельхоз. Биология, 1993, №6-111-116.

2. Кн."Immunofluorescence and related staining techniques" под ред. W Knapp et al. - Elsevier: North-Holland Biomedical Press. - 1978. - 215-221.

Штамм 5А10 гибридных клеток мыши Mus. musculus, продуцирующих моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота (КРС), является постоянной линией клеток и пригоден для биотехнологии при наработке препаратов. Штамм депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных под №71. Титры антител в нативной культуральной жидкости составляют 1:32-1:64, в асцитической жидкости - 1:640-1:5120 в иммуноферментном анализе. Продуцируемые штаммом моноклональные антитела специфичны к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота и не реагируют с иммуноглобулинами овцы. Моноклональные антитела, меченные пероксидазой, обеспечивают высокую чувствительность и специфичность ИФА для выявления антител к вирусу лейкоза КРС в биологическом материале. Штамм 5А10 - продуцент моноклональных антител к иммуноглобулину IgG КРС может быть использован при изготовлении иммуноферментной тест-системы для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Использование этой тест-системы позволит повысить эффективность оздоровительных мероприятий, уменьшить сроки оздоровления неблагополучных по лейкозу животноводческих хозяйств. 1 табл.

Штамм 5А10 постоянной гибридомной линии клеток мыши Mus. musсulus - продуцент моноклональных антител мыши к IgG крупного рогатого скота, депонирован в «Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН)» г.Москвы под №71.