ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК MUS MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К IGM СВИНЬИ Российский патент 1997 года по МПК C12N5/12 C12N5/18 C12P21/08 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности к получению штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы для приготовления высокоспецифических диагностических реагентов с целью идентификациии количественного определения уровня иммуноглобулинов M класса в биологических жидкостях организма свиньи.

В настоящее время существует два основных иммунохимических метода для идентификации и количественного определения уровня иммуноглобулинов животных: радиальной иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный (ИФА). В качестве основных иммунодиагностических реагентов в них используются поликлональные антисыворотки или моноклональные антитела.

Известно, что штамм гибридных клеток, полученный из одного клона, является постоянным продуцентом антител строго определенной специфичности.

Необходимость данной работы обусловливается важной ролью иммуноглобулинов в инфекционной патологии животных. При этом большое значение приобретают исследования, связанные с изучением основных иммунных механизмов и роли различных классов иммуноглобулинов при вирусных и бактериальных инфекциях животных, с определением уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях организма, Ig-содержащих клеток в тканях, для оценки характера иммунного ответа и иммунологического статуса.

Известен штамм гибридных клеток, продуцирующий моноклональные антитела к IgM рогатого скота [1] Моноклональные антитела данного клона относятся к изотипу IgG₁, обладают высокой преципитирующей активностью и специфичностью в РИД и используются для выявления иммуноглобулина класса M в биологических жидкостях жвачных животных.

Известен также штамм гибридных клеток, продуцирующий моноклональные антитела к IgM свиньи [2] Штамм был получен путем слияния спленоцитов иммунных мышей BALB/c с клетками миеломы Sp 2/0. Моноклональные антитела, продуцируемые этой гибридомой, относятся к IgG₁ изотипу и обладает преципитирующей активностью. Препараты, полученные на их основе, были использованы в ИФА для идентификации и количественного определения уровня иммуноглобулинов свиней при трансмиссивном гастроэнтерите и ротавирусной инфекции. Однако авторы не представили данных по способности полученных ими антител сохранять свою активность в течение длительного времени, и их стабильность в процессе лиофилизации.

Технический результат заключается в получении штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к иммуноглобулину класса M свиньи, которые обладают преципитирующей активностью, стабильностью в процессе лиофильного высушивания и сохраняют свою активность в течение длительного времени (более 2-х лет срок наблюдения).

Штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток мышиной миеломы линии P3-X63-Ag8-653 с клетками периферических лимфатических узлов (паховых и подколенных) мышей линии BALB/c, иммунизированных двукратно (100 мкг) IgM, выделенным из сыворотки крови свиньи хроматографическими методами. Слияние клеток проводили через 3 дня после последней инъекции антитела по стандартной методике с использованием ПЭГ с М.м.1500. Клетки миеломы и лимфоциты смешивали в соотношении 1: 4-1: 10. Селекцию гибридом проводили на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибридомы культивировали на 96-луночных панелях (фирма "Nunc") на среде RPMI-1640 или ДМЕМ с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере с 5% CO₂.

Скрининг гибридом на продукцию специфических моноклональных антител проводили методами непрямого твердофазного ИФА и РИД с использованием антивидовых иммунопероксидазных конъюгатов, а также препарата, содержащего иммунохимически чистый IgM свиньи. Клонирование и реклонирование клеточных культур проводили на 96-луночных панелях методом предельных разведений с использованием макрофагального фидерного слоя.

В результате был отобран и размножен клон, продуцирующий моноклональные антитела к IgM свиньи, которые реагировали с IgM в ИФА и РДП, перекрестные реакции с иммуноглобулинами других классов отсутствовали. Этот клон клеток последовательно размножен в 96-, 24-луночных панелях, а затем в культуральных матрасах. Культуральная жидкость была исследована на содержание специфических антител. Титр специфических антител в ИФА составлял 1:640. Препараты моноклональных антител получали 2-х кратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом. Была определена классовая принадлежность и специфичность моноклональных антител в ИФА, иммуноблоттинге, РДП, иммуноэлектрофорезе.

Предложенный штамм гибридных клеток мышей Mus.Musculus L. ВСКК(П) N 549 Д, продуцент моноклональных антител к IgM свиньи обладает следующими свойствами.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. Клетки округлой формы с большим ядром, хорошо прикрепляются к субстрату, размножаются на поверхности субстрата и частично в суспензии.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА. Клетки перевивают один раз в 2-3 дня с полной заменой ростовой среды с коэффициентом 1:2-1:4.

ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРЫ НА ЖИВОТНЫХ. Клетки вызывают образование асцитов у линейных мышей BALB/c, обработанных пристаном за 7-10 дней до внутрибрюшинного введения 2-10•10⁶ клеток/мышь.

КОНТАМИНАЦИЯ. Тесты на микоплазмы, бактерии, плесневые грибы и дрожжи - отрицательны.

ИЗОТИП продуцируемых моноклональных антител IgG_2b.

ХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР. Среда для замораживания: 90%-эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 10%-диметилсульфоксида. Режим замораживания: до -70^oC 1^o/мин, далее жидкий азот (-196^oC). Восстановление после размораживания: быстрое размораживание при +37^oC, центрифугирование при 1200 об/мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде до концентрации 0,3-0,5•10⁶ кл/мл. Жизнеспособность после размораживания 70-80%
Пример 1. Клетки клона пассировали на среде ДМЕМ с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 5 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глютами в атмосфере с 5% CO₂. Титр специфических моноклональных антител в культуральной жидкости в ИФА составил 1:640, в РДП 1:2.

Пример 2. Клетки клона вводили в брюшную полость линейных мышей BALB/c, предварительно за 7 суток праймированным 0,3 мл пристана по 2-10•10⁶ клеток/мышь в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера. На 10-14 сутки получена асцитическая жидкость, титр специфических моноклональных антител в которой составлял в ИФА 1:10⁵, в РДП 1:32.

Пример 3. Препараты моноклональных антител, полученные из асцитической жидкости двукратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения, были использованы в качестве реагентов в радиальной иммунодиффузии. Антитела, меченные пероксидазой, были использованы в качестве конъюгата в ИФА. Титр конъюгированных антител составил 1:2000 в ИФА. Все препараты моноклональных антител были исследованы на специфичность с использованием различных иммунохимических методов.

Табл. 1. Определение специфичности моноклональных антител в радиальной иммунодиффузии, ИФА, иммуноэлектрофорезе и иммуноблоттинге с использованием различных антигенов.

Предложенный штамм апробирован нами с положительным результатом в лабораторных условиях с 1991 по 1994 год.

Штамм гибридных клеток мышей Mus.Musculus ВСКК(П) N 549 Д, продуцент моноклональных антител к IgM свиньи хранится в Коллекции клеточных культур Института Цитологии г. Санкт-Петербурга под N ВСКК(П) 549 Д.

Штамм является продуцентом моноклональных антител специфически реагирующих только с IgM свиньи и не дающих перекрестных реакций с иммуноглобулинами других классов.

Наработку моноклональных антител можно проводить в неограниченном количестве. Моноклональные антитела являются препаратом, имеющим стандартные характеристики.

Штамм может быть использован в научно-исследовательских институтах, проблемных лабораториях, ведущих работы в области иммунологии и биотехнологии.

Препараты моноклональных антител, полученные из асцитической жидкости, можно использовать для идентификации и количественного определения уровня IgM свиньи методом радиальной иммунодиффузии (РИД) и в иммуноферментном анализе (ИФА).

Источники информации.

1. Федоров Ю.Н. Сологуб В.К. Феоктистова Т.А. и др. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgM рогатого скота //Авторское свидетельство N 1560549 от 3.01.90.

2. Paul P.S. Van Deusen R.A. and Mengeling W.L. Monoclonal precipitating antibodies to porcine immunoglobulin M. Vet. Immunol. Immunopathol. 1985, 8, 311-328. (прототип)ч

Использование: ветеринарная биотехнология, разработка диагностических реагентов для выявления IgM свиньи в биологических жидкостях. Сущность: получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к IgM свиньи. Штамм получают при слиянии спленоцитов мышей линии Balb/c, иммунизированных IgM свиньи, с клетками миеломы РЗ-Х63-Ag8-653. Антитела относятся к изотопу IgG_2b, сохраняют активность в течение долгого времени и высокоспецифичны по отношению к определенному эпитопу IgM свиньи. 1 табл.

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. ВСКК(П) N 549 D, используемый для получения моноклональных антител к IgM свиньи.