ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК MUS MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К L -ЦЕПЯМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ СВИНЬИ Российский патент 1997 года по МПК C12N5/12 C12N5/18 C12P21/08 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности к получению штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы для приготовления высокоспецифических диагностических реагентов с целью идентификации и количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма свиньи.

В настоящее время существует два основных иммунохимических метода для идентификации и количественного определения уровня иммуноглобулинов животных: радиальной иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный (ИФА). В качестве основных иммунодиагностических реагентов в них используются поликлональные антисыворотки, моноклональные антитела. Полученные гипериммунной антисыворотки, специфичной к L-цепям иммуноглобулинов свиньи трудно осуществимо, поскольку практически невозможно выделить иммунохимически чистые L-цепи в достаточном для иммунизации количестве.

Известно, что штамм гибридных клеток, полученный из одного клона, является постоянным продуцентом антител строго определенной специфичности.

Необходимость данной работы обусловливается важной ролью иммуноглобулинов в инфекционной и неинфекционной патологии животных. При этом большое значение приобретают исследования, связанных с излучением основных иммунных механизмов и роли различных классов иммуноглобулинов при вирусных и бактериальных инфекциях животных. Получение высокоспецифических реагентов также необходимо для определения видовой принадлежности белков крови. Кроме того, излучение антигенной структуры l-цепей иммуноглобулинов свиньи имеет важное научное и практическое значение, поскольку антительная специфичность ряда I_g связана с определенными маркерами L-цепей.

Известны штаммы гибридных клеток, продуцирующие моноклональные антитела к L-цепям иммуноглобулинов человека [1,2] Моноклональные антитела данных клонов используются при эпитопном картировании L-цепей иммуноглобулинов человека и обладают большой диагностической ценностью при аутоиммунных заболеваниях и злокачественных B-клеточных опухолях.

Известен также штамм гибридных клеток, продуцирующий моноклональные антитела к L-цепям иммуноглобулинов свиньи [3] Штамм был получен путем слияния спленоцитов иммунных мышей BALB/c с клетками миеломы Sp 2/0. Однако моноклональные антитела, продуцируемые этой гибридомой, были недостаточно хорошо охарактеризованы и не была показана потенциальная возможность из применения в практике. Кроме того, не показано, что данные антитела стимулируют преципитирующую активность при их смешивании с другими моноклональными реагентами, не обладающими этой способностью.

Технический результат заключается в получении штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к L-цепям иммуноглобулинов свиньи, которые могут быть использованы на практике не только для эпитопного картирования, но и для видовой идентификации иммуноглобулинов, а также как иммунохимические реагенты, стимулирующие преципитационную активность моноклональных антител к I_gG свиньи.

Штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток мышиной миеломы линии Sp 2/0 с лимфоцитами селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных четырехкратно (200 мкг) sIgA, выделенным из бронхо-альвеолярных смывов свиньи хроматографическими методами. Слияние клеток проводили через 3 дня после последней внутривенной инъекции антигена по стандартной методике с использованием ПЭГ с М.м.1500. Клетки миеломы и лимфоциты смешивали в соотношении 1: 4-1:10. Селекцию гибридом проводили на среде, содержащей гипоксатин, аминоптерин и тимидин. Гибридомы культивировали на 96-луночных панелях (фирма "Nunc") на среде RPMI-1640 или ДМЕМ с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере с 5% CO₂.

Скрининг гибридом на продукцию специфических моноклональных антител проводили методами непрямого твердофазного ИФА с использованием антивидовых иммунопероксидазных конъюгатов, а также препарата, содержащего иммунохимически чистый sIgA свиньи. Клонирование и реклонирование клеточных культур проводили на 96-луночных панелях методом предельных разведений с использованием макрофагального фидерного слоя.

В результате был отобран и размножен клон, продуцирующий моноклональные антитела к L-цепям свиньи, которые реагировали с IgG, IgM, sIgA в ИФА, перекрестные реакции с иммуноглобулинами других видов животных отсутствовали. Этот клон клеток последовательно размножен в 96-, 24-луночных панелях, а затем в культуральных матрасах. Культуральная жидкость была исследована на содержание специфических антител. Титр специфических антител в ИФА составлял - 1: 800. Препараты моноклональных антител получали 2-х кратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом. Была определена специфичность моноклональных антител в иммуноблоттинге, ИФА, РДП, дот-блот ИФА.

Предложенный штамм гибридных клеток мышей Mus. Musculus СХЖ РАСХН N 53, продуцент моноклональных антител к L-цепям иммуноглобулинов свинти обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Клетки округлой формы с большим ядром, плохо прикрепляются к субстрату, размножаются в суспензии.

Культуральные свойства. Клетки перевивают один раз в 2-3 дня с полной заменой ростовой среды с коэффициентом 1:2-1:4.

Характеристика культуры животных. Клетки вызывают образование асцитов у линейных мышей BALB/c, обработанных пристаном за 7-10 дней внутрибрюшинного введения 2-10•10⁶ клеток/мышь.

Контаминацмя 1. 0 Тесты на микоплазмы, бактерии, плесневые грибы и дрожжи отрицательны.

Изотип 1 0продуцируемых моноклональных антител IgG₁.

Хранение культуры Среда для замораживания: 90%-эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 10%-диметилсульфоксида. Режим замораживания: до -70^oC 1^o/мин, далее жидкий азот (-196^oC). Восстановление после размораживания: быстрое размораживание при +37^oC, центрифугирование при 1200 об/мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде до концентрации 0,3-0,5•10⁶ кл/мл. Жизнеспособность после размораживания 70-80%
Пример 1. Клетки клона пассировали на среде ДМЕМ с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 4мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глютамина в атмосфере с 5% CO₂. Титр специфических моноклональных антител в культурной жидкости в ИФА составил 1:800.

Пример 2. Клетки клона вводили в брюшную полость линейных мышей BALB/c, предварительно за 7 суток праймированным 0,3 мл пристана по 2-10•10⁶ клеток/мышь в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера. На 10-14 сутки получена асцитическая жидкость, титр специфических моноклональных антител в которой составлял в ИФА- 2:10⁵. Реагенты, полученные при смешивании моноклональных антител данного клона с моноклональными антителами к IgG свиньи обладали преципитирующей активностью в разведении 1:8-1:32 в РДП.

Пример 3. Препараты моноклональных антител, полученные из асцитической жидкости двукратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения, меченные пероксидазой, были использованы в качестве конъюгата в ИФА. Титр конъюгированных антител составил 1:2000 и ИФА.

Табл. 1. Определение специфичности моноклональных антител в радиальной иммунодиффузии, ИФА, иммуноэлектрофорезе и иммуноблоттинге с использование различных антигенов.

Конъюгированные антитела были использованы для определения видовой принадлежности иммуноглобулинов методом дот-блот ИФА.

Табл. 2. Определение видовой специфичности моноклональных антител с использованием сывороток различных видов животных и человека.

Таким образом, установлено, что из исследованных сывороток крови от 11 видов животных и человека конъюгированные моноклональные антитела специфически взаимодействовали только с сывороткой крови свиньи.

Предложенный штамм апробирован нами с положительным результатом в лабораторных условиях в 1994 году.

Штамм гибридных клеток мышей Mus. Musculus L. СХЖ РАСХН N 53, продуцент моноклональных антител к L-цепям иммуноглобулинов свиньи хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под N СХЖ РАСХН 53
Штамм является продуцентом моноклональных антител специфически реагирующих только с L-цепями иммуноглобулинов свиньи, и не дающих перекрестных реакций с иммуноглобулинами других видов животных.

Наработку моноклональных антител можно проводить в неограниченном количестве. Моноклональные антитела являются препаратом, имеющим стандартные характеристики.

Штамм может быть использован в научно-исследовательских институтах, проблемных лабораториях, ведущих работы в области иммунологии и биотехнологии.

Препараты моноклональных антител, полученные из асцитической жидкости, можно использовать для идентификации и количественного определения уровня иммуноглобулинов свиньи методом радиальной иммунодиффузии (РИД) и в иммуноферментном анализе (ИФА).

Источники информации
1. Арсеньева Е. Л, Богачева Г.Т, Ибрагимов А.Р. и др. Способ получения моноклональных антител к легким цепям иммуноглобулинов человека. Авт. свид. N 14021617, БИ N 22, 1988.

2. Арсеньева Е. Л, Богачева Г.Т. Ибрагимов А.Р. и др. Способ получения моноклональных антител к легким цепям иммуноглобулинов человека. Авт. свид. N 1416509, БИ N 30, 1988.

3. Paul P.S. Mengeling W.L. Malstrom C.E. Van Deusen R.A. Production and characterization of monoclonal antibodies to porcine immunoglobulin gamm, alpha and chains. Am.J.Vet.Res. 1989, 50, 471-479 (прототип).

Использование: ветеринарная биотехнология, разработка диагностических реагентов для выявления иммуноглобулинов свиньи в биологических жидкостях. Сущность: получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к легким цепям иммуноглобулинов свиньи. Штамм получают при слиянии спленоцитов мышей линии BALB/c, иммунизированных поверхностным I_gA свиньи, с клетками миеломы Sp 2/0. Антитела относятся к изотипу I_gGI и стимулируют преципитирующую активность моноклональных антител к I_gG свиньи. 2 табл., 3 пр.

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. СХЖ РАСХН N 53, используемый для получения моноклональных антител к L-цепям иммуноглобулинов свиньи.