Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к J @ М рогатого скота Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

овец, IgM крупного рогатого скота (КРС) и IgG KPC.

Реклонирование проводят в полужидком агате - 1%, а также методом лимитирующих разведений на плашках. В результате отобран и размножен клон, продуцирующий моноклональные антитела (монАТ), которые образуют кольцо преципитации с овечьей сывороткой и положительны на IgH KPC и овец в им- муноферментном тесте, перекрестные реакции с IgG не наблюдаются

Положительный клон клеток последовательно размножали в 96- 24- и 12- луночных платах, а затем в культу- ральных матрасах (100 мл).

Полученный штамм обозначен как МиМ, РС.Ц-205 депонирован под номером ВСКК (П) № 166Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Стандартные условия культивирования - на среде ДНЕЙ или RPM- 1640 с 10% эмбриональной сыворотки КРС или лошадиной сыворотки, 1 мМ пирувата натрия, 2% глутамина, 50 мкг/мл ген- тамицина. Стационарная суспензия. Клетки перевивают через 2-5 дней с заменой не менее 50% ростовой средьц коэффициент рассева 1:3 - 1:5. Посев- ная доза (0,3-0,5)10й кл/мл.

Культивирование в организме животного ,

При внутрибрюшинном введении штамм в количестве 10-10й кл/мышь мышам линии 3AL3/C вызывает образование асцита.

Характеристика полезного продукта. Штамм продуцирует монАТ класса IgG мыши, специфичные к IgM.рогатого скота, не реагирующие с IgA и G, Продуцирующая активность, В культуральной жидкости монАТ накапливаются в титрах 1:500- 1:1000 (ИАФ) или 1:3 - 1:16 (РДП - реакция диффузионной преципитации),

3 асцитной жидкости титры в ИФА 0,5 -() ), в РДП 1:160-1:640, Контаминация, Никоплазмы, бактерии, плесневые грибы и дрожжи не выявлены.

Криоконсервиоование. Среда для замораживания: 45% среды Игла, 45% эм- бриональной сыворотки к,р.с., 10% ДМСО, Режим замораживания до -30°С со скоростью 1 град/мин(до -30°С со скоростью 2 град/мин, далее - жидкий азот. Размораживают при 40°С, центри

Q

0

5 п

Q

5

0

фугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, ресуспендируют в ростовой среде до концентрации 0,5х 10е кл/мл.

Использование штамма и продуцируемых монАТ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Клетки клона пассируют на среде Дульбекко с 10% сыворотки эмбриона коровы, 1 мИ пирувата натрия в атмосфере 5% СС2.

Титр специфических антител в культуральной жидкости в РДП составляет 1:8 - 1:16, в иммуноферментном тесте 1:500 - 1:1000.

Пример 2. Клетки клона вводят в брюшную полость мышам линии BALB/c, предварительно за 7 сут прай- мированным 0,5 мл пристана, по 2 клеток в 0,5 мл фосфатно-соле- вого раствора.

На 16 сут получена асцитическая жидкость, титр специфических антител в ней составляет в РДП 1:600 - 1:640, в ИФА (1 :500)х10э - 1У106.

Пример 3, Гибридомную жидкость, содержащую специфические анти IgM-антитела с титром в РДП 1:8, используют для определения IgM в сыворотках крови КРС методом Манчини. 1 мл культуральной жидкости используют для приготовления 10 мл 1,2%-ного агара (на стекло) для исследования 48 образцов сыворотки методом радиальной иммунодиффузии. Вокруг лунок при наличии IgM в образцах сыворотки через 2 сут образуется четкое кольцо преципитации, диаметр которого увеличивается и сравнивается со стандартным образцом для определения количества IgM.

Пример 4, Препараты монАТ, полученные из асцитной и культуральной жидкости высаливанием сульфатом аммония 50%-ного насыщения, конъюги- рованы перйодатным методом с перок- сидазой из хрена в соотношении 1:1 (вес/вес). Рабочее разведение конъюгата в ИФА с использованием в качестве антигена IgM КРС (Ю мкг/лун- ку) 1: 1000. Реакция на IgG и IgA крупного рогатого скота в иммуноферментном тесте - на уровне контроля с неспецифическим белком.

Характеристика МиМ РСЦ-20 по классу продуцируемых антител, их специфичности и активности в серологических тестах представлена в таблице.

Пример 5.В лунки полистироловых плат вносят по 100 мкл препарата иммуноглобулинов - IgM, IgG, IgA на фосфатном буфере при рН 7,2 с содержанием белка 500 мкг/мл и одно- временно вносят в другой ряд лунок раствор ЙСА той же концентрации. Проводят адсорбцию при 37°С в течение 2 ч. После 3-разового отмывания раст- вором 0,05%-ного твина-20 на фосфат- но-солевом буфере в каждый ряд лунок вносят по 1000 мкл гибридомной жидкости, инкубируют 18 ч при 4°С. После 6-кратного отмывания моющим раствором в лунки вносят по 100 мл антимышиного конъюгата с пероксидазой в оптимальном разведении. Инкубируют 2 ч при 37°С, тщательно отмывают платы моющим раствором (6 раз) и добавляют по 100 мкл в лунку субстратной смеси - 0,08%-ный раствор 5-аминосали- циловой кислоты с 0,005% , рК5,8. Через 30 мин производят визуальный учет реакции по образованию коричневого окрашивания. Окрашивание наблюдается только в ряду лунок с адсорбированным IgM рогатого скота до разведения 1:320 - 1:640.

Использование нового штамма гибри- домы позволит получить моноклональные антитела высокой специфичности, обладающие преципитирующими свойствами.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клето животных Mus musculus ВСКК (П) № 166 Д, используемый для получения монокло- нальных антител к IgM рогатого скота.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в ветеринарии. Цель изобретения - повышение специфичности моноклональных антител (монАТ). Штамм гибридных клеток мышей получен при слиянии миеломных клеток РЗХ63-AG8. 653 со спленоцитами мышей BALB/C, иммунизированных JG M рогатого скота, и депонирован под номером ВСКК(П) N 166Д. Штамм продуцирует монАТ, специфически реагирующие с JG M рогатого скота, перекрестная реактивность с JGG и JGA не выявлена. МонАТ выявляются в реакции диффузионной преципитации (РДП) и в иммуноферментном тесте (ИФА). Титр специфических антител в культуральной жидкости составляет в РДП 1:8-1:16, в ИФА 0,5^.10³-1^.10³. Штамм перевивается мышам BALB/C праймированным пристаном в виде асцитных опухолей, титр специфических антител в которых составляет в РДП 1:160-1:640, в ИФА - 0,5^.10⁶ - 1^.10⁶. МонАТ, продуцируемые штаммом, используются для иммунохимического выявления JGM и приготовления иммуноферментного конъюгата для диагностики специфического JGM. 1 табл.

IgG

Составитель Г.Смирнова Редактор Л.Веселовская Техред Л.Олийнык --Корректор С.Шекмар

Заказ 951

Тираж 498

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

0,2-2,0- 1:160- 1:2- 0,5-1:3200,35,0 1:640 1:32 2-10- 1:2560

Подписное