ШТАММ 1Н8 ПОСТОЯННОЙ ГИБРИДОМНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. Musculus - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К IgG ОВЦЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к получению штаммов гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы для приготовления высокоспецифических диагностических реагентов для выявления антител к различным инфекционным агентам, в частности вирусу лейкоза крупного рогатого скота.

Вирус лейкоза крупного рогатого скота вызывает злокачественное лимфопролиферативное заболевание крупного рогатого скота - лейкоз, который занимает первое место в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота в Российской Федерации. Инфекционный процесс характеризуется отсутствием виремии с одновременной продукцией антител к белкам вируса, среди которых преобладают антитела к гликопротеиду вирусной оболочки (gp51). Для диагностики болезни широко применяются серологические методы исследования, а именно реакция диффузионной преципитации в геле агара и иммуноферментный анализ.

Необходимость данной работы обусловлена тем, что наибольшей чувствительностью и специфичностью при выявлении антител к вирусу лейкоза обладают тест-системы, в основу которых положен принцип иммуноферментного анализа. Использование моноклональных антител для приготовления меченных пероксидазой видоспецифических антител к иммуноглобулину IgG крупного рогатого скота позволяет повысить специфичность анализа. В состав диагностических тест-систем входит антиген вируса лейкоза, который получают из культуральной жидкости перевиваемых культур клеток, в частности культуры клеток почки эмбриона овцы, хронически инфицированной вирусом лейкоза. Использование моноклональных антител для иммобилизации антигена на пластике планшета для титрования позволяет отказаться от трудоемкой и зачастую неэффективной очистки антигена и значительно повысить специфичность и чувствительность анализа. В разработанной нами тест-системе, предназначенной для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологических жидкостях крупного рогатого скота, для иммобилизации антигена применяются моноклональные антитела овцы Ovis aries к гликопротеидному антигену вируса лейкоза, продуцируемые межвидовой гибридной линией 8С12. Необходимость использования моноклональных антител к иммуноглобулинам IgG овцы в качестве антител, фиксирующих комплекс гликопротеидный антиген - моноклональные антитела к гликопротеидному антигену на твердой фазе, обусловлена тем, что культивирование межвидовой гибридной линии 8С12 возможно только in vitro, но не в организме животных. Однако содержание антител в культуральной жидкости гораздо ниже, чем в асцитической, и, кроме того, в состав питательной среды для культивирования постоянных культур клеток входит сыворотка крови (10-20%), которая загрязняет препарат моноклональных антител. Это обусловило необходимость использования для фиксации антигена моноклональных антител к иммуноглобулину IgG овцы, не обладающих перекрестной реактивностью с иммуноглобулинами крупного рогатого скота.

В доступной нам литературе сведения о штаммах гибридомных культур клеток, продуцирующих моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG овцы, не найдены.

В задачу наших исследований входило получить штамм гибридных клеток, обладающих in vitro высокой продукцией моноклональных антител к иммуноглобулину IgG овцы, не дающих перекрестных реакций с иммуноглобулинами крупного рогатого скота.

Способ получения предложенного штамма состоит в следующем.

Штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток перевиваемой культуры миеломы мыши P3-X63-Ag-8.653 с лимфоцитами селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной двукратно введением 100 мкг препарата иммуноглобулина IgG овцы, очищенного хроматографическими методами.

На высоте иммунного ответа (через 3 дня после последней инъекции) провели слияние спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии P3-X63-Ag-8.653.

Слияние клеток проводили по стандартной методике с использованием ПЭГ с м.м. 1500. Соотношение клеток миеломы и лимфоцитов составляло 1:4-1:10. Селекцию гибридом проводили на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибридомы культивировали на 96-луночных панелях производства фирмы «Nunc» на среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров в атмосфере, содержащей 5% СО₂.

Скрининг гибридом на продукцию специфических моноклональных антител проводили методом твердофазного ИФА с использованием препаратов очищенных IgG овцы и крупного рогатого скота для сенсибилизации твердой фазы и конъюгата поликлональных антител к иммуноглобулину IgG мыши с пероксидазой для выявления связавшихся антител. Клонирование и реклонирование клеточных культур проводили на 96-луночных панелях методом предельных разведений с использованием макрофагального фидерного слоя.

В результате был отобран и размножен клон клеток 1Н8, продуцирующий моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG овцы, не дающий перекрестных реакций с иммуноглобулинами крупного рогатого скота. Этот клон клеток был последовательно размножен в 96-, 24-луночных панелях, а затем в культуральных матрасах.

Культуральная жидкость была исследована на содержание специфических антител. Титр специфических антител в ИФА составлял 1:32-1:64. Препараты моноклональных антител получали двукратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом. Была определена видовая принадлежность и специфичность моноклональных антител методами ИФА.

Предложенный штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Клетки однородные, округлой формы с крупным овальным ядром, содержащим от 1 до 3, чаще 1-2, ядрышек. При посеве клетки равномерно распределяются на поверхности субстрата и в культуральной жидкости. Индекс пролиферации равен 5-6.

Культуральные свойства. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров. Клетки размножаются в суспензии и частично - прикрепляясь к поверхности культурального сосуда. Посевная концентрация 1×10⁴ клеток/мл. Через 5-7 суток с момента посева 80% культуральной жидкости удаляют вместе с находящимися в ней клетками. К оставшимся клеткам добавляют такой же объем свежей питательной среды. рН среды 7,2-7,4. Периодичность субкультивирования - 1 раз в 3-5 суток. Кратность рассева 1:5.

Культивирование в организме животных. Клетки вызывают образование асцитов у линейных мышей BALB/c, обработанных пристаном за 7-10 дней до внутрибрюшинного введения 2-10×10⁶ клеток/мышь. Активность в ИФА асцитной жидкости - 1:640-1:5120.

Иммунологические свойства. Штамм продуцирует моноклональные антитела мыши против иммуноглобулина IgG овцы, не имеющие перекрестной реактивности с иммуноглобулинами крупного рогатого скота. Специфичность антител определяют методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG овцы и крупного рогатого скота. В планшет вносят культуральную жидкость и инкубируют 1,5 часа при 37°С, вносят конъюгат антител против иммуноглобулина IgG мыши с пероксидазой, инкубируют в том же режиме. После каждого этапа проводят отмывание лунок от несвязавшихся реагентов. Вносят субстратную смесь. Интенсивность окрашивания оценивают через 5-10 мин. Значения оптической плотности в лунках, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG овцы и крупного рогатого скота, составляют соответственно более 1,5 и менее 0,05.

Определение активности культуральной, асцитической жидкостей проводят методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG овцы. Готовят двукратные серийные разведения исследуемого материала и проводят анализ аналогично исследованию на специфичность. В качестве контроля используют сыворотку крови интактных линейных мышей BALB/c в разведении 1:25. За титр принимают то наибольшее разведение исследуемого материала, для которого оптическая плотность в два или более раз превышает оптическую плотность в контроле.

Контаминация. Контаминация простейшими, грибами, бактериями, микоплазмами, вирусами не выявлена.

Хранение культур. Среда для замораживания: 70% среды RPMI-1640, 20% сыворотки эмбрионов коров, 10% диметилсульфоксида. Концентрация клеток в пластиковых криопробирках 1,5×10⁶ клеток/мл. Режим замораживания: до -70°С, 1°/мин, далее жидкий азот (-196°С). Восстановление после замораживания: быстрое размораживание при 37°С, центрифугирование при 1200 об/мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде. Жизнеспособность после размораживания 70-80%.

Штамм используют при изготовлении диагностической тест-системы для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

Преимущества: антитела к иммуноглобулину IgG овцы, не дающие перекрестных реакций с иммуноглобулинами крупного рогатого скота.

Предложенный штамм 1Н8 гибридной линии клеток мыши Mus. musculus - продуцент моноклональных антител мыши к иммуноглобулину IgG овцы - депонирован в «Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных» (СХЖ РАСХН) под №73.

Штамм гибридных клеток 1Н8 является постоянной линией клеток, пригодной для биотехнологии при наработке диагностических препаратов.

Пример 1. Иммунологические свойства моноклональных антител. Специфичность антител в культуральной жидкости определяют методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG овцы и крупного рогатого скота по приведенному выше методу. Значения оптической плотности в лунках, сенсибилизированных иммуноглобулином IgG овцы и крупного рогатого скота, составляли соответственно 1,750 и 0,032. Отношение значений оптической плотности, превышающее 54, свидетельствует о том, что моноклональные антитела реагируют с иммуноглобулинами овцы, но не реагируют с иммуноглобулинами крупного рогатого скота.

Пример 2. Культивирование штамма in vitro и количественная оценка продукции антител. Клетки штамма 1Н8 культивируют в стеклянных матрасах при температуре 37,0°С в питательной среде, состоящей из среды RPMI-1640 и 10% сыворотки крови эмбрионов крови антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 500000 ед./л). Оптимальная плотность посадки 2×10⁴ клеток/мл среды. Через 2-3 суток после образования суспензии культуральную жидкость частично удаляют и добавляют необходимое количество свежей питательной среды. Титр антител к иммуноглобулину IgG овцы в культуральной жидкости составил в ИФА 1:64.

Пример 3. Культивирование в организме животных и количественная оценка продукции антител. Клетки штамма в дозе 2-10×10⁶ клеток/мышь в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера вводили в брюшную полость линейных мышей BALB/c, которым предварительно за 7 суток ввели 0,3 мл пристана. На 10-14 сутки получали асцитическую жидкость, титр специфических моноклональных антител к IgG овцы в которой составил в ИФА 1:2560.

Пример 4. Проведение иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител. Препараты моноклональных антител получали из асцитической жидкости трехкратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом. Далее их использовали в качестве антител, фиксирующих моноклональные антитела овцы к гликопротеидному антигену gp51 ВЛКРС 8С12, в иммуноферментном анализе для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологических жидкостях крупного рогатого скота. Иммобилизацию антигена на микропанелях проводили в три этапа.

На первом этапе поверхность пластика панели для микротитрования сенсибилизировали за счет неспецифической адсорбции препаратом моноклональных антител к иммуноглобулинам овцы, продуцируемых штаммом 1Н8 (депонирован в СХЖ РАСХН под №73) из раствора с концентрацией 5 мкг/мл при рН 7,2-2-7,4. Инкубацию проводили в течение 16-20 часов при 4°С. На втором этапе проводили иммобилизацию за счет специфического иммунологического взаимодействия моноклональных антител к гликопротеидному антигену gp51 ВЛКРС из культуральной жидкости штамма 8С12 (депонирован в СХЖ РАСХН под №72) в течение 1,5 часов при 37°С. На третьем этапе проводили иммобилизацию также за счет специфического иммунологического взаимодействия антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота из культуральной жидкости вируспродуцирующей культуры. Избыток реагентов после каждой стадии сенсибилизации твердой фазы и проведения иммуноферментного анализа отмывали раствором детергента на фосфатно-солевом буферном растворе. Вносили контрольные и анализируемые образцы сыворотки крови крупного рогатого скота и инкубировали в течение 1,5 часов при 37°С. В качестве детектирующих антител использовали меченные пероксидазой моноклональные антитела против глобулинов крупного рогатого скота, не дающие перекрестных реакций с иммуноглобулинами овцы, продуцируемые штаммом 5А10 (депонирован в СХЖ РАСХН под №71). Инкубацию проводили в течение 1,5 часов при температуре 37°С. Учет реакции проводили по изменению оптической плотности анализируемых образцов по сравнению с контрольными образцами после добавления субстратной смеси, содержащей тетраметилбензидин (ТМВ) и перекись водорода Н₂О₂. Положительными считали пробы, оптическая плотность которых в два и более раз превышала оптическую плотность отрицательного контроля.

При проведении исследования 662 сывороток крови из неблагополучного по лейкозу хозяйства параллельно в реакции диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментном анализе совпадение результатов (РДП+/ИФА+; РДП-/ИФА-) отмечали в 560, или 84,6%, несовпадение (РДП+/ИФА-; РДП-/ИФА+) - в 15,4% случаев. Только 3 положительные по результатам РДП пробы прореагировали отрицательно в ИФА (0,5%). В ИФА было выявлено 190 (28,7%) положительных проб, тогда как в РДП - только 94 (14,2%), т.е. на 14,5%, или в два раза, больше. По чувствительности метод иммуноферментного анализа превосходил РДП с гликопротеидным антигеном и не уступал ей по специфичности.

Предложенный штамм апробирован с положительным результатом в лабораторных условиях ГНУ Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко и Курской биофабрики с 2006 по 2007 гг.

Технико-экономическое обоснование. Полученный штамм 1Н8 гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к иммуноглобулину IgG овцы, характеризуется следующими полезными свойствами:

- является постоянной линией клеток, пригодной для биотехнологии при наработке диагностических препаратов;

- обладает высоким уровнем продукции моноклональных антител. При определении методом иммуноферментного анализа титры антител в нативной культуральной жидкости составляли в ИФА 1:32-1:64, в асцитической жидкости 1:640-1:512;

- монокональные антитела специфичны к иммуноглобулину IgG овцы;

- моноклональные антитела не реагируют с иммуноглобулинами крупного рогатого скота;

- моноклональные антитела при использовании их для фиксации на твердой фазе гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота (в составе комплекса гликопротеидный антиген - моноклональные антитела овцы к гликопротеидному антигену) в иммуноферментном анализе обеспечивают прочность фиксации и оптимальную доступность антигена для антител в испытуемых пробах.

Штамм 1Н8 - продуцент моноклональных антител к IgG овцы - найдет применение при изготовлении иммуноферментной тест-системы для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Использование этой тест-системы позволит повысить эффективность оздоровительных мероприятий, уменьшить сроки оздоровления неблагополучных по лейкозу животноводческих хозяйств и в итоге резко снизить заболеваемость крупного рогатого скота лейкозом.

Источники информации

"Immunofluorescence and related staining techniques" под ред. W. Knapp. - Elsevier: North-Holland Biomedical Press. - 1978. - 215-221.

Получен штамм 1Н8 постоянной гибридомной линии клеток мыши Mus. musculus - продуцент моноклональных антител к IgG овцы, пригодный для биотехнологии при наработке диагностических препаратов. Штамм депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых культур под №73. При определении методом иммуноферментного анализа (ИФА) титры антител в нативной культуральной жидкости составляли в ИФА 1:32-1:64, в асцитической жидкости 1:640-1:5120. Моноклональные антитела специфичны к иммуноглобулину IgG овцы и не реагируют с иммуноглобулинами крупного рогатого скота. При использовании их для фиксации на твердой фазе гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС) (в составе комплекса гликопротеидный антиген - моноклональные антитела овцы к гликопротеидному антигену) в ИФА обеспечивают прочность фиксации и оптимальную доступность антигена для антител в испытуемых пробах. Штамм 1Н8 может быть использован при изготовлении иммуноферментной тест-системы для диагностики лейкоза КРС, что позволит повысить эффективность оздоровительных мероприятий, сократить сроки оздоровления неблагополучных по лейкозу животноводческих хозяйств. 1 табл.

Штамм 1Н8 постоянной гибридомной линии клеток мыши Mus. Musculus - продуцент моноклональных антител к IgG овцы, депонирован в «Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН)» г.Москвы под №73.