СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ НАДПОЧЕЧНИКОВОГО ГИПЕРКОРТИЗОЛИЗМА Российский патент 2010 года по МПК A61B5/00 G01N1/28 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, эндокринологии, физиологии, и может быть использовано для диагностики состояний, обусловленных высоким содержанием гормона кортизола в надпочечниках человека.

Кортизол - стероидный гормон, выделяемый корой надпочечников. Он составляет 75-90% кортикоидов, циркулирующих в крови, и регулирует все физиологические и биохимические процессы в организме.

Содержание кортизола в крови увеличивается:

- при заболеваниях гипоталамо-гипофизарной системы, связанных с усиленным выбросом адренокортикотропного гормона (АКТГ), способствующего повышению функции коры надпочечников;

- при заболеваниях коры надпочечников (гиперплазия, гипертрофия, аденома, киста, опухоль);

- при гипотиреозе, циррозе печени, астме, сахарном диабете;

- при АКТГ-эктопированном синдроме;

- при беременности;

- при постоянном приеме глюкокортикоидов в целях повышения защитных свойств иммунной системы.

В клинике синдром гиперкортизолизма наблюдается в виде:

- болезни Иценко-Кушинга;

- синдрома Иценко-Кушинга (кортикостерома - доброкачественная или злокачественная, двусторонняя мелкоузловая дисплазия коры надпочечников);

- при наличии опухоли бронхов, поджелудочной железы, печени, яичников, секретирующих АКТГ и котикотропин-рилизинг гормон (КРГ);

- синдроме феминизации и вирилизации;

- при раке щитовидной железы, молочных желез, желудка, толстой кишки (Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. М.: 2000. - С.404-407; Bates S.E. et al., 1985).

Концентрация кортизола в крови повышается при стрессе, болевом синдроме, лихорадках, менингитах, опухолях ЦНС, акромегалии, правожелудочковой недостаточности, почечной гипертензии, психической депрессии, приеме синтетических аналогов глюкокортикоидов.

Клиническое использование синтетических глюкокортикоидов, содержащих кортизол, на протяжении длительного времени при таких заболеваниях, как диффузные заболевания соединительной ткани, астма, острый лейкоз, нейродермиты, экзема, аллергические заболевания (анафилактический шок, сывороточная болезнь, ангионевротический отек), может привести к синдрому передозировки, к развитию фармакологического синдрома гиперкортизолизма (П.В.Сергеев, П.А.Галенко-Ярошевский, Н.П.Шимановский. Очерки биохимической фармакологии. М., 1996).

Концентрацию кортизола в сыворотке крови обычно оценивают иммунохимическими способами (радиоиммунологическим, иммуноферментным). Используют набор реактивов Стерон-К^-125 1-М (Инструкция по применению набора реактивов для радиоиммунологического определения кортизола в сыворотке крови человека с использованием кортизола, меченного J¹²⁵, и преципитирующего реагента Стерон-К^-125 1-М. Минск.: Пламя, 1988.

Для иммуноферментного способа используют тест-набор "Стероид ИХЛА КОРТИЗОЛ" ЗАО "Алкор-Био", Россия. С.Петербург, ул. Корпусная, 28а.

Вышеуказанные способы, наряду с несомненными достоинствами (высокая чувствительность и специфичность), имеют ограничения в применении. Проведение хода исследования трудоемко, требует длительного времени.

Аналог. Радиоиммунологическое определение кортизола в сыворотке крови (набор реактивов Стерон-К^-125 1-М).

Для проведения радиоиммунологического определения кортизола сыворотки крови человека необходимо наличие набора, в состав которого входят:

1) J¹²⁵ кортизол, лиофилизованный препарат, 1 флакон, общая активность 90-180 кБк;

2) 7 калибровочных проб сыворотки крови, содержащих известные количества кортизола - 0, 20, 50, 150, 400, 1000, 2000 нмоль/л после растворения, лиофилизованные препараты или жидкости;

3) буферный раствор;

4) антисыворотка;

5) преципитирующий реагент.

Принцип работы набора состоит в следующем:

1) компоненты набора и образец сыворотки крови J¹²⁵, кортизол и эндогенный кортизол вступают в обратную иммунохимическую реакцию с кроличьими антителами против кортизола;

2) одновременно с этой реакцией протекает взаимодействие антител против кортизола со вторыми антителами (против иммуноглобулинов кролика) и в результате образуется тройной комплекс;

3) количество связанного антителами J¹²⁵ кортизола находится в обратной зависимости от концентрации кортизола в системе;

4) концентрацию кортизола в пробе сыворотки крови пациента определяют из графика зависимости активности осажденного связанного J¹²⁵ кортизола от концентрации кортизола в калибровочных пробах.

Главные недостатки указанного аналога:

1) наличие источника гамма-излучения в виде J¹²⁵ кортизола;

2) соблюдение правил работы с радиоактивными веществами по третьему классу;

3) наличие счетчика измерения типа "Гамма-1";

4) трудоемкость хода определения;

5) высокая стоимость оборудования.

Ближайший аналог. Использован иммунометрический способ количественного определения кортизола в сыворотке крови человека (тест-набор Стероид ИХЛА КОРТИЗОЛ - ЗАО "Алкор-Био" С.Петербург, ул. Корпусная 28а. Тел. 7(812) 230-78-56).

В основе способа лежит конкурентный метод, основанный на усиленной люминесценции (конкуренция эндогенного кортизола, содержащегося в образце с кортизолом, меченным пероксидазой хрена, конкуренция за связывание с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок).

Способ осуществляют следующим образом:

1) приготавливают рабочий раствор (конъюгат кортизолпероксидаза) путем смешивания концентрированного раствора "Конъюгата Е" и "Буфера А" в пропорции 1:25 в соответствии с таблицей:

- стрипов - 2-8;

- конъюгат Е - 320-400-520-600-680-800-920 мкл;

- буфер А-8-10-13-15-17-20-23 мл;

2) приготавливают восстановленные калибровочные пробы, для чего добавляют во флаконы с калибровочными пробами "1"-"6" и во флакон с контрольной сывороткой по 0,5 мл бидистиллированной воды;

3) приготавливают сигнальный раствор, для чего во флакон вместимостью 35 мл, адаптированный к диспенсеру Амерлайт, вносят сигнальные реагенты А и В в соотношении 1:1 и перемешивают;

4) готовят промывочный буфер, для чего в сосуд вместимостью 1000 мл вносят 450 мл бидистилированной воды и добавляют 50 мл концентрированного "Буфера Б";

5) осуществляют следующую последовательность операции:

- устанавливают в держателе достаточное количество ячеек для анализа всех необходимых проб и образцов;

- пипеткой вносят в соответствующие лунки по 50 мкл калибровочных проб контрольной и исследуемых сывороток;

- диспенсором вносят в каждую лунку с антителами по 200 мкл конъюгата;

- накрывают лунки крышкой, встряхивают в течение 1 часа в инкубаторе-встряхивателе Амерлайт при 37°С;

- промывают лунки в устройстве для промывки Амерлайт;

- вносят во все лунки с антителами по 250 мкл сигнального раствора LIANA;

- через 2-20 минут после внесения сигнального раствора считывают лунки на анализаторе Амерлайт, предварительно введя в анализатор значения содержания кортизола в калибровочных пробах;

- распечатывают анализы.

Недостатки способа:

1. Трудоемкость.

2. Дороговизна способа.

3. Применение ряда устройств, дорогостоящего оборудования.

4. Наличие потенциально инфицированного материала (продукты крови человека).

Задачи предлагаемого изобретения

1. Обеспечение экспресс-диагностики функции коркового слоя надпочечников (пучковая зона), синтезирующего кортизол.

2. Повышение информативности диагностики.

3. Снижение материально-технических затрат.

Для разработки предлагаемого изобретения использовали возможность регистрации биологического излучения надпочечников человека при помощи биологического индикатора (БИ), представленного 1% водным раствором аспарагиновой аминокислоты.

Биологическое информационное излучение от различных объектов (живых, биокосных, косных) - один из общих принципов энергоинформационного взаимодействия в природе (В.П.Казначеев, Л.П.Михайлова. Биоинформационные функции естественных электромагнитных полей. Новосибирск, 1985).

В настоящее время в науке активно разрабатываются принципы информационно-волновой биологии и медицины. Под влиянием фронта информационного волнового излучения исследуемого объекта аминокислоты, изменяя свою структуру, тем самым передают информацию о структуре источника излучения, в итоге в ней формируется "зеркальное" отражение структуры исследуемого объекта (П.П.Гаряев. Волновой геном. Энциклопедия Русской Мысли: Русское физическое общество. М.: 1993. - 5 т. - 280 с.; И.В.Прангишвили, П.П.Гаряев, Г.Г.Тертышный и др. Трехмерная модель процессов эндогенного голографического управления развитием пространственной структуры биосистем. М.: 2004; Л.В.Савина. Энергоинформационные взаимодействия. Краснодар, 2008).

Технической новизной изобретения является физический метод исследования функционального состояния глюкокортикоидной функции надпочечника - состояние гиперкортизолизма, отличающийся тем, что в зону проекции надпочечника локально в область, расположенную между XI грудным и I поясничным позвонками, помещают стеклянную пластину, на которую в виде дорожки наносят биологический индикатор - 1% водный раствор аспарагиновой аминокислоты объемом 0,01-0,03 мл, выдерживают пластину на поверхности органа на протяжении 3-5 минут, препарат высушивают в термостате при Т=+18-20°С в течение 2-3 минут, затем исследуют в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и при наличии в препарате кристаллов - дискоидных сферолитов и/или скелетных кристаллов типа ледяных узоров - диагностируют надпочечниковый гиперкортизолизм.

Технический результат

- Для диагностики надпочечникового гиперкортизолизма применен биологический индикатор, представленный 1% раствором аспарагиновой аминокислоты, которая регистрирует биологическое излучение надпочечника.

- Способ обеспечивает высокую селективную информативность, эффективность диагностики. Соблюдается физиологичность и нативность способа. По сравнению с базовыми способами диагностики гиперкортизолизма время исследования сокращается на 70-72%, а материальные затраты - на 80-88%.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Готовят биологический индикатор (БИ) - 1% водный раствор аспарагиновой аминокислоты.

2. Тарированной пипеткой БИ наносят на стеклянную пластину в виде тонкой пленки-дорожки, объемом 0,01-0,03 мл.

3. Стеклянную пластину с нанесенным на нее БИ помещают на исследуемый участок кожи в зону проекции надпочечника - область между XI грудным и I поясничным позвонками, выдерживают на ней на протяжении 3-5 минут.

4. Препарат высушивают в термостате при Т=+18-20°С на протяжении 2-3 минут.

5. Образец исследуют в поляризованном свете с кварцевым компенсатором.

При наличии в препарате кристаллов - дискоидных сферолитов и/или скелетных кристаллов типа ледяных узоров - диагностируют надпочечниковый гиперкортизолизм.

Приводим структуру БИ, представленную 1% водным раствором аспарагиновой аминокислоты, фиг.1, присутствуют крупные и мелкие кристаллы, представленные, преимущественно, ромбической формой.

На фиг.2 приведена типовая структура БИ, полученная при получении информации с таблеток кортизол-ацетата (25 мг каждая). Для этой цели на стеклянную пластину наносят БИ и окружают его по периферии валиком из таблеток кортизол-ацетата, выдерживают в нем 3-5 минут, затем сушат при Т=+18-20°С и изучают структуру в поляризованном свете с кварцевым компенсатором (КК). См. патент изобретения "Способ экспресс-идентификации фарма- и парафармацевтиков, вводимых в организм человека. Авторы: Савина Л.В., Кузнецова Е.А. №2271001. М., 2006 г.). На фиг.2 представлено 2 вида кристаллов - скелетный кристалл типа ледяных узоров и дискоидный сферолит, найденные в одном препарате.

На фиг.3 приведена типовая структура БИ, полученная при помещении стеклянной пластины с нанесенным на нее БИ в зону проекции надпочечника здорового человека. Видна цепочечно ориентированная упорядоченная структура.

Проведено 212 клинических исследований.

Примеры

Пример 1, фиг.4. Больная К., история болезни (ИБ) №489. Диагноз (Дз): болезнь Иценко-Кушинга. На фиг.4 присутствуют кристаллы - дискоидный сферолит и скелетные кристаллы типа ледяных узоров, выделенные в одном препарате.

Технология. На стеклянную пластину нанесли 0,01 мл БИ в виде дорожки и поместили в зону проекции надпочечника - область между XI грудным и I поясничным позвонками, выдержали в ней 3 минуты. Пластину высушили при Т=+18°С на протяжении 2 минут, затем исследовали в поляризованном свете с КК. Видны кристаллы - дискоидный сферолит и скелетные кристаллы типа ледяных узоров. Одновременно в сыворотке крови (СК) больной определили содержание кортизола, оно оказалось повышенным и составило 980 нмоль/л (норма - 270,0±1,3 нмоль/л). Предполагаемый надпочечниковый гиперкортизолизм подтвердился.

Пример 2, фиг.5. Больной У. Дз: Кортикостерома правого надпочечника. ИБ №9181. На фиг.5 приведены кристаллы: дискоидный сферолит и скелетный кристалл типа ледяных узоров обнаружены в одном препарате.

Технология. На стеклянную пластину в виде дорожки нанесли 0,03 мл БИ. Пластину расположили в зону проекции правого надпочечника - область между XI грудным и I поясничным позвонками, выдержали 4 минуты, высушили в термостате при Т=+19°С и исследовали в поляризованном свете с КК. Выявлены кристаллы - дискоидный сферолит и скелетный кристалл типа ледяных узоров. Одномоментно в СК определили уровень кортизола, который оказался повышенным и составил 1050 нмоль/л. Диагноз надпочечникового гиперкортизолизма подтвердился.

Пример 3, фиг.6. Больная Ф. Дз: Гипоталамический синдром пубертантного периода, гиперплазия левого надпочечника. ИБ №598. На фиг.6 приведены скелетные кристаллы типа ледяных узоров.

Технология. На стеклянную пластину нанесли 0,03 мл БИ в виде дорожки и поместили ее в зону проекции левого надпочечника и выдержали 4 минуты, высушили при Т=+20°С на протяжении 3 минут и исследовали в поляризованном свете с КК. Присутствуют скелетные кристаллы типа ледяных узоров. Одновременно в СК определили уровень кортизола, он оказался повышен и составил 698 нмоль/л. Предполагаемый надпочечниковый гиперкортизолизм подтвердился.

Пример 4, фиг.7. Больная Б. Дз: Аденома правого надпочечника. ИБ №2112. На фиг.7 приведены кристаллы дискоидных сферолитов.

Технология. На стеклянную пластину в виде дорожки нанесли 0,02 мл БИ. Пластину поместили в зону проекции правого надпочечника, выдержали в ней 5 минут, затем высушили в термостате при Т=+20°С на протяжении 2 минут, изучили в поляризованном свете с КК. Обнаружены дискоидные сферолиты. Одновременно в СК определили уровень кортизола, он оказался повышенным - 799 нмоль/л. Предполагаемый надпочечниковый гиперкортизолизм подтвердился.

Изобретение относится к медицине, эндокринологии, патофизиологии и биологии. Для экспресс-диагностики надпочечникового гиперкортизолизма в зону проекции надпочечника - на кожу в область между IX грудным и I поясничным позвонками - помещают стеклянную пластину, на которую в виде дорожки наносят биологический индикатор - 1% водный раствор аспарагиновой аминокислоты объемом 0,01-0,03 мл. Пластину выдерживают в зоне проекции надпочечника на протяжении 3-5 минут. Препарат высушивают в термостате при Т=+18-20°С в течение 2-3 минут, затем исследуют в поляризованном свете с кварцевым компенсатором. При наличии в препарате кристаллов - дискоидных сферолитов и/или скелетных кристаллов типа ледяных узоров - диагностируют надпочечниковый гиперкортизолизм. Способ повышает информативность экспресс-диагностики гиперкортизолизма при снижении материально-технических затрат. 7 ил.

Способ экспресс-диагностики надпочечникового гиперкортизолизма, включающий физический метод исследования, отличающийся тем, что в зону проекции надпочечника - на кожу в область между IX грудным и I поясничным позвонками помещают стеклянную пластину, на которую в виде дорожки наносят биологический индикатор - 1%-ный водный раствор аспарагиновой аминокислоты объемом 0,01-0,03 мл, пластину выдерживают в зоне проекции надпочечника на протяжении 3-5 мин, препарат высушивают в термостате при Т=+18-20°С в течение 2-3 мин, затем исследуют в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и при наличии в препарате кристаллов - дискоидных сферолитов и/или скелетных кристаллов типа ледяных узоров диагностируют надпочечниковый гиперкортизолизм.