СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2010 года по МПК A61K35/66 A23K1/165 

Изобретение относится к биотехнологии, пробиотическим препаратам для профилактики желудочно-кишечных заболеваний, повышения сохранности и прироста живой массы молодняка сельскохозяйственных животных.

Известен препарат-пробиотик, включающий носитель, представляющий собой сорбент и иммобилизованные на нем микробные клетки пробиотиков совместно с питательной средой. В качестве сорбента используют пористый материал на основе оксида алюминия типа СУМС (патент РФ №2164801, кл. 7 A61K 35/74, A23C 9/12, С12N 1/08, опубл. 10.04.2001 г.).

К недостаткам данного способа относится использование одной группы микроорганизмов, не обеспечивающих в полной мере качественный пробиотический эффект. Используемый в известном методе энтеросорбент не обеспечивает эффективно нормализацию микробиоценоза из-за неселективности сорбции, а также не обладает пищевой и биологической ценностью.

Известен способ получения сухого пробиотического препарата, включающий выращивание в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина штаммами энтеробактерий, например Bifidobacterium globosum БФ-4 или Streptococcus falcium ВГНКИ-27 в течение 12-15 ч, затем нативную культуральную жидкость охлаждают до температуры 15-20°С и концентрируют в 10-15 раз, полученную концетрированную биомассу отмывают 2,5-3,5%-ным раствором сахарозы или лактозы и обезвоживают при температуре минус 25-35°С. При этом концентрацию нативной культуральной жидкости проводят методом ультрафильтрации на полых волокнах или микрофильтрацией на плоских мембранах или сепарированием в полупериодическом режиме работы (см. патент РФ №2065305, кл. 6 A61K 35/74, бюл. №23, опубл. 08.20.1996 г.).

К недостаткам данного способа относится использование технически сложного метода высушивания препарата, а также использование дорогостоящего компонента гидролизата казеина в составе препарата.

Известен способ получения сухого пробиотического препарата, предусматривающий получение маточной культуры штаммов микроорганизмов Rhuminococcus albus Kr, Lactobacillus acidophilus Scav. ВКПМ В 4625, Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, совместное культивирование маточной культуры на подсолнечном шроте при температуре 30-45°С в течение 4-8 суток, с последующим смешиванием получившийся полувлажной формы с сухим шротом в соотношении 1:10-1:12 до получения влажности в готовом препарате 8-10% (патент РФ №2280464, A61K 35/66, A23K 1/165, опубл. 27.07.2006 г.).

Однако используемые пробиотические культуры используются как целлюлозолитики и не могут в полной мере справиться с проявлениями дисбактериоза, вызванным нарушенным балансом молочнокислых и бифидобактерий в кишечнике. Использование для получения сухой формы препарата нестерильного шрота может оказать пагубное воздействие на организм животного из-за наличия посторонней загрязняющей микрофлоры. Предлагаемая авторами данного способа сложная многокомпонентная среда и раздельное выращивание компонентов маточной культуры усложняют и удорожают производство данного препарата.

Техническим результатом предложенного способа является повышение эффективности препарата для профилактики дисбиотических состояний организма у молодняка сельскохозяйственных животных, приводящая к увеличению сохранности и продуктивности поголовья с использованием отработанного сырья после СО₂-экстракции пряно-ароматических трав.

Технический результат достигается тем, что способ получения сухого пробиотического препарата включает в себя получение маточной культуры совместным выращиванием в условиях глубинного культивирования молочнокислых микроорганизмов Enterococcus faecium В 3491, Lactobacillus plantarum В 3242, Bifidobacterium bifidum AC 1247, штаммы которых депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), взятых в соотношении 1:1:1 в жидкой питательной среде, представляющей собой смесь молока коровьего с водой в равной пропорции, при температуре 37-39°С в течение 72 ч до получения биотитра каждого микроорганизма 5·10⁸ КОЕ/мл, готовят смесь шротов пряно-ароматических трав из семян тмина, семян кориандра и травы петрушки после СО₂-экстракции при следующем соотношении компонентов, мас.%:

шрот семян тмина 20-40 шрот семян кориандра 30-50 шрот петрушки 30

засевают маточной культурой полученную смесь шротов в соотношении 1:1 и инкубируют при 35-40°С в течение 4-6 суток с получением в полувлажном препарате не менее 5·10⁹ КОЕ/г, затем полувлажный препарат смешивают с полученной смесью шротов до получения влажности в готовом препарате 8-12% и биотитра каждого микроорганизма не менее 5·10⁸ КОЕ/г.

Штамм Enterococcus faecium В 3491 используется как продуцент молочной кислоты и для борьбы с дисбактериозами сельскохозяйственных животных.

Штамм Lactobacillus plantarum В 3242 проявляет антагонистическую активность по отношению к бактериям кишечной группы, а также обладает пробиотическими свойствами.

Штамм Bifidobacterium bifidum AC 1247 применяется как пробиотик в медицине и ветеринарии.

В качестве маточной культуры используется смесь молочнокислых микроорганизмов, обладающих выраженными пробиотическими свойствами, подавляющих развитие кишечных бактерий и продуцирующих молочную кислоту, необходимую для создания кислой среды в кишечнике для нормализации микробиоценоза.

В качестве субстрата используется смесь шротов из семян тмина, семян кориандра и травы петрушки после СО₂-экстракции, характеризующихся стерильностью, что исключает попадание посторонней микрофлоры в организм животного, также сырье содержит весь биоактивный, витаминный, водорастворимый, микроэлементный и другие комплексы. Белок остается в шроте в неизменном, нативном состоянии, являясь тем самым ценным кормовым сырьем и качественным субстратом для развития на нем молочнокислых микроорганизмов.

Пример 1. Готовят маточную культуру совместным выращиванием молочнокислых микроорганизмов Enterococcus faecium В 3491, Lactobacillus plantarum В 3242, Bifidobacterium bifidum AC 1247, взятых в соотношении 1:1:1. Готовят смесь стерилизованных шротов из семян тмина, семян кориандра и травы петрушки после СО₂-экстракции при следующем соотношении компонентов, мас.%:

шрот семян тмина 21 шрот семян кориандра 49 шрот петрушки 30

Полученную смесь шротов засевают маточной культурой молочнокислых микроорганизмов и инкубируют при температуре 37°С в течении 5 суток с получением титра каждого микроорганизма в полувлажной форме 6·10⁹ КОЕ/г. Полученную полувлажную форму смешивают в соотношении 1:10 со смесью шротов пряно-ароматических трав после СO₂-экстракции с получением биотитра каждого микроорганизма 5·10⁸ КОЕ/г и влажностью готового продукта 9%.

Пример 2. Готовят смесь стерилизованных шротов из семян тмина, семян кориандра и травы петрушки после СО₂-экстракции при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Шрот семян тмина 30 Шрот семян кориандра 40 Шрот петрушки 30

Полученную смесь засевают маточной культурой молочнокислых микроорганизмов и инкубируют при температуре 38°С в течении 4 суток с получением титра каждого микроорганизма в полу влажной форме 8·10⁹ КОЕ/г. Полученную полувлажную форму смешивают в соотношении 1:9 со смесью шротов пряно-ароматических трав после СО₂-экстракции с получением биотитра каждого микроорганизма 9·10⁸ КОЕ/г и влажностью готового продукта 11%.

Пример 3. Готовят смесь стерилизованных шротов из семян тмина, семян кориандра и травы петрушки после СО₂-экстракции при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Шрот семян тмина 38 Шрот семян кориандра 32 Шрот петрушки 30

Полученную смесь засевают маточной культурой молочнокислых микроорганизмов и инкубирут при температуре 39°С в течении 6 суток с получением титра каждого микроорганизма в полувлажной форме 5·10⁸ КОЕ/г. Полученную полувлажную форму смешивают в соотношении 1:11 со смесью шротов пряно-ароматических трав после СО₂-экстракции с получением биотитра каждого микроорганизма 5·10⁸ КОЕ/г и влажностью в готовом препарате 8%.

Хранение данного препарата в течение 6 месяцев показало сохранность микроорганизмов с сохранением биотитра 5·10⁸ КОЕ/г.

Предлагаемый способ позволяет эффективно использовать отработанное сырье после СО₂-экстракции, способ не требует высоких материальных затрат, так как в качестве питательной среды для молочнокислых микроорганизмов используется недорогое и общедоступное сырье - молоко коровье. Полученный препарат обладает выраженным пробиотическим эффектом за счет использования в своем составе комплекса молочнокислых микроорганизмов, обладающих высокой колонизационной активностью в кишечнике, высокой выживаемостью в кислой среде желудка и обеспечивающих своими метаболитами улучшение микробиоценоза организма.

Полученный препарат использовался в опыте на белых лабораторных мышах в качестве добавки к основному рациону.

В лабораторном опыте было сформировано 2 группы по 30 особей в каждой. Мыши контрольной 1-й группы получали стандартный рацион. Мышам 2-й группы добавляли 0,05 г пробиотического препарата. Продолжительность опыта 60 суток. Исследования показали, что применение препарата повысило сохранность мышей и увеличило прирост живой массы тела во 2-й группе на 65%. Препарат не оказывает неблагоприятных воздействий на организм, каких-либо патологических изменений в ходе приема препарата не обнаружено.

Таким образом, предлагаемый препарат пробиотик позволяет повысить сохранность и выживаемость молодняка, увеличить прирост живой массы тела.

Показатель Известный Заявляемый Количество мышей на начало опыта 30 30 На конец опыта 24 30 Сохранность, % 80 100 Живая масса одной мыши на начало опыта, г 9,85 9,80 На конец опыта 23 31,5 Прирост живой массы тела, г 13,15 21,7 % 100 165

Способ предусматривает приготовление маточной культуры совместным выращиванием в условиях глубинного культивирования молочнокислых микроорганизмов Enterococcus faecium В 3491, Lactobacillus plantarum В 3242, Bifidobacterium bifidum AC 1247, взятых в соотношении 1:1:1 до заданного достижения биотитра каждого микроорганизма не менее 5-10⁸ КОЕ/мл. Выращивание ведут в жидкой среде, представляющей собой смесь коровьего молока и воды в соотношении 1:1. Готовят смесь шротов пряно-ароматических трав из семян тмина, семян кориандра и травы петрушки после СO₂ экстракции при следующем соотношении компонентов, мас.%: шрот семян тмина 20-40, шрот семян кориандра 30-50, шрот петрушки 30. Маточной культурой засевают полученную смесь шротов в соотношении 1:1 и инкубируют при 35-40°С в течение 4-6 суток с получением в полувлажном препарате не менее 5·10⁹ КОЕ/г. Полученный полувлажный препарат смешивают с полученной смесью шротов до получения влажности в готовом препарате 8-12% и биотитра каждого микроорганизма не менее 5·10⁸ КОЕ/г. Это обеспечивает повышение сохранности и выживаемости молодняка и увеличение прироста живой массы.

Способ получения сухого пробиотического препарата, характеризующийся тем, что готовят маточную культуру совместным выращиванием в условиях глубинного культивирования молочнокислых микроорганизмов Enterococcus faecium В 3491, Lactobacillus plantarum В 3242, Bifidobacterium bifidum AC 1247, взятых в соотношении 1:1:1 в жидкой питательной среде, представляющей собой смесь коровьего молока с водой в соотношении 1:1 при температуре 37-39°С в течение 72 ч до получения биотитра каждого микроорганизма не менее 5·10⁸ КОЕ/мл, готовят смесь шротов пряно-ароматических трав из семян тмина, семян кориандра и травы петрушки после СО₂ экстракции при следующем соотношении компонентов, мас.%:
шрот семян тмина 20-40 шрот семян кориандра 30-50 шрот петрушки 30,

засевают маточной культурой полученную смесь шротов в соотношении 1:1 и инкубируют при 35-40°С в течение 4-6 суток с получением в полувлажном препарате не менее 5·10⁹ КОЕ/г, затем полувлажный препарат смешивают с полученной смесью шротов до получения влажности в готовом препарате 8-12% и биотитра каждого микроорганизма не менее 5·10⁸ КОЕ/г.