ПРОБИОТИК ДЛЯ ТЕЛЯТ БИФИЦИН Российский патент 2002 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, производству пробиотиков, биотехнологии и предназначено для получения препаратов из живых микроорганизмов, обладающих высокой антагонистической активностью против условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, синтезирующих биологически активные вещества, конкурентноспособных и проявляющих выраженный профилактический и лечебный эффект при нарушениях пищеварения у телят раннего возраста.

Одним из средств для получения препаратов является использование чистых культур бифидобактерий, лактобактерий и Bacilus subtilis, адаптированных к составу питательной среды на молочной основе и условиям производства.

Культуры бифидо- и лактобактерий, В. subtilis для препаратов должны обладать большей биологической активностью по сравнению с известными.

В настоящее время для получения препаратов ветеринарного назначения применяют бифидумбактерин (В. bifidum), ветом-1.1.(В. subtilis), лактоамиловарин (Lactobacillus amilovorus) [1, 2, 3].

Но эти препараты включают штаммы одного вида бактерий и не обладают высокой биологической активностью.

Целью изобретения является получение комплекса активных штаммов, обладающих широким спектром антимикробного действия к общим патогенным микроорганизмам, синтезом биологических веществ, способностью адаптироваться к условиям пищеварительного тракта и антибиотикам, интенсивностью размножения в производственных условиях.

Сущность изобретения.

Поставленная цель достигается использованием штаммов Bifidobacterium longum B-12, Lactobacillus plantarum P-19, Enterococcus faecium Е-18, Bacillus subtilus B-26, выделенных из кишечного канала здоровых телят раннего возраста (5-20 дней) и обладающих широким антимикробным спектром действия против условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, синтезирующих биологически активные вещества, устойчивы к антибиотикам и условиям среды пищеварительного тракта. Штаммы непатогенны, токсичных и токсигенных свойств не проявляют, находятся в коллекции музея чистых культур микроорганизмов ВГМХА им. Н. В. Верещагина. Штаммы используют для получения пробиотика бифицина в жидкой и сухой форме.

Применяют препарат телятам, начиная с первого дня жизни вместе с молозивом. В пищеварительном тракте телят штаммы стимулируют размножение полезной микрофлоры и ее ферментативную активность, обеспечивают поддержание оптимального микробного баланса в кишечнике телят.

При скармливании телятам раннего возраста штаммы повышают неспецифическую резистентность, вероятность заболевания и гибели, обладают значительным лечебно-профилактическим эффектом при расстройствах пищеварения, клинически проявляющиеся диареей.

Штаммы характеризуются следующими признаками.

Штамм Bifidobacterium longum В-12.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки штамма представлены средней длины с ветвлением или рассеченными концами палочками. Неподвижны, спор не образуют. Односуточные культуры по Граму окрашиваются положительно.

Колонии на печеночном агаре поверхностные, размером 2-3 мм в виде чечевичек, внутренняя структура однородная. Глубинные колонии в виде гвоздиков.

В жидких печеночной и гидролизатно-молочной средах образуют взвешенные в нижней части пробирки и фиксированные на стенках пробирки мелкие хлопья, выпадающие в светло-коричневый осадок.

Физиолого-биохимические признаки.

Анаэроб. Оптимальная температура развития (37±1)^oC, минимальная (20±1)^oС, максимальная (49±1)^oС. Хорошо растет при рН 6,0-7,5. Газа из глюкозы не образует. Каталазоотрицателен. Нитраты не редуцирует. Не образует индол, сероводород, аммиак. Молоко свертывает. Растет в средах с 2% хлористого натрия, 20% желчи. Обладает протеолитической активностью. Ферментирует арабинозу, рибозу, ксилозу, лактозу, мелецитозу, крахмал, трегалозу. Не усваивает глюконат, целлобиозу, маннит, салицин. Сбраживает лактозу с образованием уксусной и молочной кислот. Проявляет антимикробный спектр действия к бактериям родов Staphylococcus, Proteus, Escherichia, Salmonella, Klebsiella.

Штамм проявляет устойчивость к тетрациклину, стерептомицину, канамицину, неомицину.

Штамм непатогенен, токсичных и токсигенных свойств не проявляет.

Штамм Lactobacillus plantarum P-19.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки штамма имеют форму палочек, средней длины, сочетание в мазках одиночное, попарно. Неподвижны, спор не образуют. По Граму окрашиваются положительно.

Колонии на МРС и гидролизатно-молочном агаре (30^oС, 48 ч) крупные, гладкие, светлые, профиль приподнятый.

В жидких средах образуется умеренная муть, осадок плотный, легко взмучивающийся при встряхивании.

На глюкозном МПБ помутнение, мелкие хлопья, пристеночный рост и плотный осадок.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб. Оптимальная температура развития (30±1)^oС, минимальная (10±1)^oС, максимальная (38±1)^oС. Хорошо растет в пределах рН 5,2-7,4. Газа из глюкозы не образует. Каталазоотрицателен. Нитраты не редуцирует. Растет в средах с 2, 4 и 6% хлористого натрия, 20% желчи, 0,4% фенола. Молоко свертывает. Обладает протеолитической активностью.

Кислоту продуцирует из арабинозы, галактозы, лактозы, мальтозы, маннозы, раффинозы, рибозы, сахарозы, фруктозы, маннита, салицина, сорбита, целлобиозы, мелецитозы. Не ферментирует крахмал, ксилозу, рамнозу.

Лактозу ферментирует с образованием молочной и уксусной кислот. Обладает антимикробным спектром действия к бактериям родов Staphylococcus, Proteus, Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Candida.

Штамм проявляет устойчивость к хлорамфениколу, тетрациклину, cтерептомицину, полимиксину.

Штамм непатогенен, токсичных и токсигенных свойств не проявляет.

Штамм Enterococcus faecium E-18.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки штамма имеют форму эллипсовидных кокков в сочетаниях парами и цепочками. Неподвижны, спор не образуют, грамположительные.

Колонии на молочно-ингибиторной среде черного цвета, гладкие, выпуклые, мелкие. На средах с полимиксином колонии голубые, на МПА с углеводами прозрачные, круглые, мелкие.

В МПБ с глюкозой пленки не образуют, муть умеренная, осадок плотный, обильный.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб. Оптимальная температура роста (37±1)^oС, минимальная (10±1)^oС, максимальная (75±2)^oС. Хорошо растет при рН 7,4-10,5. Растет в средах с 6% натрия хлорида, 40% желчи, 0,4% фенола, 0,1% метиленового голубого. Молоко свертывает. Каталазоотрицателен. Нитраты не редуцирует. Газа из глюкозы не образует.

Ферментирует арабинозу, галактозу, ксилозу, лактозу, мальтозу, маянозу, раффинозу, сахарозу, фруктозу, салицин, экскулин, целлобиозу с образованием кислоты. Рамнозу, рибозу, крахмал, маннит, мелецитозу не ферментирует.

Штамм проявляет антимикробный спектр действия к бактериям родов Staphylococcus, Proteus, Escherichia, Salmonella, Klebsiella.

Обладает устойчивостью к неомицину, тетрациклину, стерептомицину, бензилпенициллину.

Штамм непатогенен, токсичных и токсигенных свойств не проявляет.

Штамм Bacillus subtilus B-26.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки штамма палочковидной формы средней длины, концы клеток срезанные, капсулы отсутствуют, подвижны. Окрашиваются по Граму положительно. Имеют центральное расположение спор в клетке, форма спор эллипсовидная.

Колонии на МПА (37^oС, 24 ч) неправильной формы, крупные с изрезанным краем, с шероховатой поверхностью, плоским профилем, светло-серого цвета.

На МПБ образует пленку, помутнения среды не вызывает, осадка через 24 ч не дает.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Оптимальная температура развития (37±1)^oС, минимальная (18±2)^oС, максимальная (48±2)^oС. Растет в питательных средах со значением рН 6,0-8,5. Каталазоположителен. Нитраты редуцирует. Молоко не свертывает. Обладает протеолитической, амилазной, желатиназной активностью. Образует кислоту из глюкозы, арабинозы, ксилозы, маннита.

Штамм обладает антимикробным спектром действия к бактериям родов Staphylococcus, Proteus, Escherichia, Salmonella, Klebsiella.

Штамм не чувствителен к неомицину, тетрациклину, рифампицину, ампициллину.

Штамм непатогенен, токсичных и токсигенных свойств не проявляет.

Пример 1. Питательную среду, содержащую: молоко, гидролизированное панкреатином - 10,0%, глюкозу - 5,0%, дрожжевой экстракт (рН 6,5) 1,0 % подвергают стерилизации, охлаждают до (37±1)^oС, инокулируют суточными культурами штаммов: B. longum B-12, L.plantarum P-19, E.facium E-18, B.subtilis B-26 в дозе 5-10% к объему среды. Посевы инкубируют при (37±1,0^oС) в течение 14-18 ч и получают титр жизнеспособных клеток (1-1,2 млрд/мл).

Жидкий препарат фасуют в стеклянные флаконы объемом 200 мл, герметически укупоривают и выпускают для использования.

Пример 2. Сухой препарат получают при отделении клеток микроорганизмов от питательной среды центрифугированием при 3000 х g в течение 15 мин. Затем полученную биомассу смешивают с одним из адсорбентов - глюкозой, сухим обезжиренным молоком, крахмалом - в соотношении 1:10.

Сухой препарат имеет белый или кремовый цвет, консистенция - мелкий порошок с содержанием влаги 4,5-5,0%, титр жизнеспособных клеток до 10¹⁰ в 1,0 г в равном соотношении между видами микроорганизмов.

При скармливании препарата телятам штаммы Bifidobacterium longum B-12, Lactobaccillus plantarum P-19, Enterococcus faecium E-18, Bacillus subtilis B-26 ингибируют гемолитические микроорганизмы, увеличивают содержание бифидо-молочнокислых бактерий, регулируют биоценоз кишечника молодняка сельскохозяйственных животных.

Штаммы микроорганизмов обеспечивают профилактическое и лечебное действие при диспептических заболеваниях.

Источники информации
1. А.с. 343588.

2. Патенты РФ 97113452, 97113006, 97112246.

3. Патент РФ 2054478.

Изобретение относится к биотехнологии. Для получения пробиотика Бифицина используют биомассу штаммов Bifidobacterium longum В-12, Lactobacillus plantarum P-19, Enterococcus faecium E-18, Bacillus subtilus B-26, выделенных от здоровых телят раннего возраста и эффективных в качестве профилактического и лечебного препарата при диарейных заболеваниях телят. Пробиотик обладает широким антимикробным спектром действия против условно-патогенных и патогенных микрооорганизмов, синтезирует биологически активные вещества, повышает неспецифическую резистентность организма телят.

Пробиотик для телят, содержащий биомассу штаммов Bifidobacterium longum В-12, Lactobacillus plantarum P-19, Enterococcus faecium E-18, Bacillus subtilus B-26 в коллекции музея чистых культур микроорганизмов Вологодской государственной молочнохозяйственной академии им. Н. В. Верещагина.