СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛИНИЧЕСКИ ВАЖНЫХ СТЕРОИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 

Предлагаемое изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к способу одновременного определения клинически важных стероидов в биологической жидкости человека, используемого для выявления целого ряда гинекологических и онкологических заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма стероидных гормонов, причем многие из них могут быть диагностированы только по стероидному профилю (СП). Кроме того, СП дает информацию о ряде стероидов одновременно, что особенно важно для диагностических целей.

Исследования гормонов в крови иммунными методами можно использовать только для приблизительных оценок, так как результаты зависят от сиюминутного состояния организма человека и, как следствие, колеблются от 200 до 500%. Исследования мочи представляют собой более точный, а, главное, неинвазивный метод диагностики, предотвращающий опасность заражения пациента СПИДом, гепатитом В и т.д.

Суточная моча, как объект исследования, имеет существенные преимущества перед иммунными методами определения гормонов в крови, распространенными в настоящее время в клинической медицине, так как позволяет исключить влияние на результаты циркадных ритмов и мгновенных колебаний гормонов в крови, которые часто бывают значительными.

Известен способ определения СП в суточной моче, который описан в статье Leunissen W.J.J., Thijssen J.H.H., J. Chromat, Biomed Appl., 1978, v.146, p.365.

Недостатком этого способа является ферментативный гидролиз, с использованием дорогостоящих ферментов, активность которых меняется со временем; присутствие дополнительной стадии очистки образца перед вводом в испаритель хроматографа с использованием колонки Lipidex-5000, с последующим элюированием дериватов смесью дериватов, что значительно усложняет процесс и делает его крайне громоздким. Для реализации способа применяют смеси легкокипящих растворителей, что повышает опасность возгорания.

Наиболее близкий способ определения стероидного профиля мочи (СПМ) (прототип) изложен в обзоре «Profiling steroid hormones and urinary steroids» журнала "Journal of chromatography biomedical applications", vol.379, June 20, 1986 г. крупным исследователем в данной области C.H.L. Shakelton, стр.91-156.

В этом способе для извлечения конъюгатов стероидов используют различные вариации твердофазной экстракции, например с использованием С24-картриджей, стоимость которых относительно велика, вследствие чего для исследования в России они неприемлемы, кроме того, для работы с ними необходим высокотоксичный метанол (на работу с которым требуется специальное разрешение).

С другой стороны, в прототипе для гидролиза конъюгатов стероидов используют очень дорогостоящий фермент, полученный извлечением из виноградной улитки, активность которого меняется со временем, что сказывается на качестве гидролиза и требует дополнительного тестирования указанного фермента. Кроме того, при помощи этого фермента не удается достигнуть количественного гидролиза, для чего вводится еще одна дополнительная стадия - сольволиз, что увеличивает трудоемкость процедуры и занимает много дополнительного времени.

Недостатком способа также является двухступенчатая защита функциональных групп: силирование и получение метокси - производных, что еще более усложняет и без того сложный и многоступенчатый процесс.

Задачей предлагаемого изобретения является определение СП по суточной моче человека более простым и дешевым способом.

Решение поставленной задачи заключается в том, что в способе одновременного определения клинически важных стероидов в биологической жидкости человека, включающем экстракцию конъюгатов стероидов, выделение сухого остатка конъюгатов стероидов и их последующее расщепление с одновременной защитой функциональных групп, используют экстракцию конъюгатов стероидов по типу «жидкость-жидкость» в среде этилацетата, расщепление конъюгатов стероидов проводят комбинированным кислотным гидролизом при температуре 80°С путем взаимодействия бензола, конъюгатов стероидов и соляной кислоты, разбавленной до соотношения 1:2, в присутствии металлического шарика, причем используют металлический шарик из стали ШХ15 диаметром 3,175 мм.

Защиту функциональных ОН-групп проводят в одну стадию путем силилирования.

По сравнению с другими полярными растворителями, этилацетат имеет следующие преимущества: является хорошим растворителем как для сульфатов, так и для глюкуронидов стероидов; имеет относительно невысокую температуру кипения при нормальных условиях (77,1°С); обладает незначительной токсичностью, а также низкую стоимость.

Задача комбинированного кислотного гидролиза (ККГ) коньюгатов состоит в том, чтобы как можно быстрее осуществить переход образующихся в процессе гидролиза в водной среде свободных стероидов в органическую гидрофобную фазу и тем самым защитить стероиды от деструктивного влияния сильной ионизирующей протонной среды.

Сравнительный анализ соответствующих характеристик ряда растворителей, апробированных в работе, позволяет остановиться на таком недорогом и доступном растворителе, как бензол, обладающий температурой кипения 80°, высокой способностью растворять необходимые стероиды, менее токсичным по сравнению, например, с галогенпроизводными углеводородами, а главное, из-за отсутствия ионов бензола вообще не разрушает стероиды. Именно поэтому сразу же после гидролиза гидрофильной молекулы конъюгата образовавшаяся гидрофобная молекула стероида быстро переходит в объем растворителя и, тем самым, надежно защищается в дальнейшем от деструктивного влияния кислой среды.

Главными критериями, по которым осуществляют выбор кислоты для проведения ККГ, являются следующие: во-первых, способность не растворяться в органическом растворителе, во-вторых - образовывать плохо разделяемые взвеси и эмульсии с растворителем, в-третьих, химическая инертность реагента по отношению к растворителю, а также доступность в России и низкая стоимость реактива. С учетом всего нами была выбрана соляная кислота. Сравнительная экспериментальная проверка ряда реагентов показала, что в случае использования соляной кислоты после выдувания органического растворителя током азота в осадке не обнаруживалось даже следов хлористого водорода. Изучение кинетики и механизма реакции гидролиза с использованием соляной кислоты проводят на примере расщепления PdGl.

После процедуры экстракции и удаления растворителя стероиды находятся на дне конусообразной колбы в виде сульфатов и глюкуронидов, что удобно при проведении последующих стадий анализа.

Как правило, в процессе проводимого гидролиза образуется система, состоящая из двух фаз: нижняя - это разбавленная соляная кислота, верхняя - бензол, причем при температуре проведения реакции 80°С нижняя фаза является неподвижной, тогда как верхняя - интенсивно кипит. Существование неподвижной нижней фазы является отрицательным фактором, поскольку гидролизующиеся стероиды длительное время находятся в агрессивной среде и поэтому подвержены относительно большему разрушению.

Для устранения данного недостатка комбинированный кислотный гидролиз проводят в присутствии металлического шарика, изготовленный из стали ШХ15

(03,175 мм). Металл взаимодействует с разбавленной соляной кислотой (при температуре 80°С), в результате чего в системе образуются мельчайшие пузыри водорода, являющиеся в то же время центрами кипения.

В этом случае вся смесь интенсивно кипит, хорошо перемешиваясь, что в свою очередь приводит к увеличению числа переноса стероидов в процессе гидролиза. Таким образом, образующиеся свободные стероиды гораздо быстрее переносятся в углеводородную фазу, где они надежно защищены от разрушительно влияния соляной кислоты.

В серии контрольных опытов показано, что присутствие металла не сказывается на качестве проводимого гидролиза.

Пример

Определяют клинически важные стероиды в биологической жидкости человека (беременной женщины).

С этой целью 4 мл, взятые из суточной мочи беременной женщины, помещают в конусообразную колбу, приливают этилацетат в количестве 10 мл и проводят экстракцию конъюгатов стероидов по типу «жидкость-жидкость» при постоянном встряхивании в течении 5-10 мин, после чего этилацетат упаривают и на дне конусообразной колбы остаются конъюгаты стероидов в виде сухого налета (фиг.1).

Затем для расщепления конъюгатов стероидов проводят комбинированный с экстракцией кислотный гидролиз, для чего добавляют 10 мл бензола и 2 мл хлористоводородной кислоты, разбавленной в соотношении 1:2.

Кроме того, на дно помещают металлический шарик (сталь марки ШХ15, диаметр 3,175 мм) для обеспечения равномерного кипения.

Колбу, снабженную обратным холодильником, помещают в водяную баню с температурой 80-83°С. Гидролиз длится 20 мин, начиная с момента начала кипения. Затем смесь быстро охлаждают, переливают в делительную воронку и отбрасывают нижний слой.

Оставшийся экстракт последовательно промывают 2 мл 0,5 N раствора щелочи, 4 мл дистиллированной воды и центрифугируют. Остаток после центрифугирования (супернатант) переносят в коническую колбу и выпаривают досуха.

После проведения кислотного гидролиза, полученные в результате подобной процедуры свободные стероиды нельзя сразу вводить в хроматограф, так как экстракт содержит массу примесей. В предлагаемом изобретении в качестве основного метода очистки выбран способ промывки гидролизата раствором щелочи с целью удаления кислотных и других остатков. После щелочной обработки экстракт промывают дистиллированной водой, при этом удаляется остаток щелочи. С целью достижения наименьших потерь стероидов стадию очистки гидролизата также оптимизируют.

Для проведения анализа клинически важных стероидов проводят газохроматографический анализ.

Полученные количественные характеристики клинически важных стероидов и профиль концентрации клинически важных стероидов в суточной моче представлены в таблице и на фиг.2 соответственно.

При газохроматографическом анализе используют два вида колонок - традиционные насадочные и высокоэффективные капиллярные. Поскольку преимуществами капиллярных колонок являются высокая селективность и долговечность, именно их рекомендуется применять при анализе СП. Оптимальными условиями хроматографирования являются следующие: температура термостата 150°-300°С, испарителя 250°-300°С, детектора 250°-300°С.

Таблица. Количественное определение стероидов в суточной моче беременной женщины Нормы (мкМоль/24 часа) Названия и аббревиатура стероидов Результаты опред. Абс. знач. % 3.8-15.1 Андростерон (An) 15,4 43,7 3.0-14.8 Этиохоланолон (Et) 12,2 34,8 0-2.8 Дегидроэпиандростерон (DHEA) 2,4 7,0 0.3-2.7 11-Кетоандростерон (11-Keto-An) 1,0 2,7 0.4 -2.5 11-Кетоэтиохоланолон (11-Keto-Et) 1,3 3,6 2.0-7.5 11в-Гидроксиандростерон (11-OH-An) 2,2 6,4 0.5-3.1 11в-Гидроксиэтиохоланолон (11-OH-Et) 0,6 1,8 9.9-35.5 Сумма 17-КС 35,2 100,0 <3.0 Дискриминанта ван де Калсейде 2,8 32.2 - 220 Прегнандиол (Pd) 101,1 2.2-8.0 алло-Прегнандиол (allo-Pd) 17,4 1.3-21.7 Прегнанолон 32,1 дельта5-Прегнандиол (дельта5-Pd) 0,9   Прегнантриол (Pt) 0,5   16альфа-Гидрокси-Et 0,0 4.3-39.5 16альфа-Гидрокси-An 0,0   16альфа-Гидрокси-DHEA 0,0 Только для беременных Эстрадиол 37,0 Только для беременных Эстрон 13,6 5.6-9.8 Холестерин (Ch) 8,5 0,5-1,8 Суточное количество мочи (литры) 2,05

Предположенное изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к способу одновременного определения клинически важных стероидов в биологической жидкости человека, используемого для выявления гинекологических и онкологических заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма стероидных гормонов. Способ включает экстракцию коньюгатов стероидов, выделение сухого остатка и их последующее расщепление с одновременной защитой функциональных групп. Экстракцию коньюгатов стероидов проводят по типу «жидкость-жидкость» в среде этилацетата. Расщепление коньюгатов стероидов проводят комбинированным кислотным гидролизом при температуре 80°С путем взаимодействия бензола, коньюгатов стероидов и соляной кислоты, разбавленной до соотношения 1:2, в присутствии металлического шарика. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.

1. Способ одновременного определения клинически важных стероидов в биологической жидкости человека, включающий экстракцию коньюгатов стероидов, выделение сухого остатка конъюгатов стероидов и их последующее расщепление с одновременной защитой функциональных групп, отличающийся тем, что используют экстракцию конъюгатов стероидов по типу «жидкость-жидкость» в среде этилацетата, а расщепление конъюгатов стероидов проводят комбинированным кислотным гидролизом при температуре 80°С путем взаимодействия бензола, конъюгатов стероидов и соляной кислоты, разбавленной до соотношения 1:2, в присутствии металлического шарика.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что защиту функциональных OH-групп проводят в одну стадию путем силирования.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют металлический шарик из стали ШХ15 диаметром 3,175 мм.