Способ количественного определения стероидных гормонов в биологических субстратах Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

00 00 Изобретение относится к способам определения стероидных гормонов. Известны способы раздельного определения экстрадиола-17В, тестосте рона и др, fl и 2J. Однако известные способы не прэволяют вести одновременное определе ние нескольких стероидных гормонов одной пробе. Известен также способ одновремен ного определения гормонов в пробе, включающий экстракцию субстрата, очистку получаемого экстракта и последунвдее биохимическое измерение содержания гормонов . Однако этот метод трудоемок,- не достаточно точен, не позволяет вест определение связанных форм стероидо Целью изобретения является сниже ние трудоемкости способа путем одно временного определения эстрадирла-1 эстрона и этриола в одной пробе и повышение точности способа. Цель достигается тем, что соглас но способу количественного определе ния стероидных гормонов в биологических субстратах, включающему проведение экстракции исследуемого субстрата и количественное биохимическое измерение содержания стероид ных гормонов, экстракцию проводят с помощью смеси спиртов с последукяц пропусканием полученного продукта через целитЬвую колонку, проводят гидролиз полученного экстракта гидролизата и последующее разделение, искомых стерсЯ дов с помощью адсорбционной„хроматографии на микроколон ке из AljO- и распределительной, хроматографии, после чего осуществл ют их количественное биохимическое измерение. Пример. Экстракцию из тканей животных (мышц, печени, почек и др.) проводят в 2 этапа. Сначала тщательно измельченную ткань (150200 г) экстрагируют в скоростном смесителе смесью полярных растворителей: этанол-метанол-вода (1:1:0,6 300-400 мл. Остатки ткани отделяют фильтрованием через бумажный фильтр фильтраты объединяют (1 этап). ЗаTewf тканевые остатки смешивают с целитом (1)-3 веса ткани) и смесь переносят на колонку (используют колонку размером 3x30 см). В колонк вносят экстрагент: этанол-метанол (1;1) и экстрагируют в течение 910 ч ( П этап экстракции). Экстракты объединяют и концентрируют на ро торном испарителе до объема 100150 мл. Выпавший осадок отделяют фильтрованием и отбрасывают. Кислотный гидролиз. К экстракту добавляют соляную кислоту до концен рации 12% и гидролизуют 30 мин при 75 С. К гидролизату добавляют 2 объ ма дистиллированной воды, добавлени 2н.МаОН доводят рН до 5,5 и дважды экстрагируют равным объемом эфира. Эфирные экстракты объединяют, фильт-. руют через Ма SO. и выпаривают в вакууме досуха. Хроматографирование на чколонке ). Перед хроматографией обезвоживают (при 180° в течение 4 4)f затем адсорбент стандартизируют добавлением 10% воды и встряхивают в течение 2 ч, суспендируют в хлороформе и формируют колонку размером 6,0 X 0,5 см. Колонку промывают -20 мл хлороформа и на нее наносят исследуемую пробу. Элюцию осуществляют: 10 мл хлороформа (фракция 1 - не содержит стероидов), 15 мл 0,5% этанола в хлороформе (фракция 2 - содержит эстрон), 15 мл 3% этанола в хлороформе (фракция 3 - содержит, эстрадиол-), 20 мл 20% этанола в хлорофос«4е (фракция 4 - содержит эстриол) . Фракции, содержащие эстро-гены, выпаривают на роторном испарителе до минимального объема Экстракция смесью полярных растворителей: этанол метанол(1:1:0,6) Гидролиз кислотный или . фехшентный iо Хроматография на колонке Хроматография в тонком слое силикагеля ГЖХ Флюорометрия Радиоиммунологическое определение . Метод одновременного определения эстрадиола-17, эстроиа и эстриола в тканях животных проводят по следующей схеме. Хроматография в тонком слое силикагеля. Исследуемую пробу наносят на пластину силикагеля (20x20 см, толщина слоя О,4 мм). Пластины предварительно активируют 50 мин, при 120. тех проводят в системе растворителей бензол-этилацетат (2:3). Элюцию с тонкого слоя осуществляют смесью растворителей: этанол-бензол (3:1). Элюаты выпаривают на роторной испарителе. Количественное измерение. Предлагается 3 метода количественного измерения. каяууаЛ из которых с успе-1хом может быть применен в зависимос-г ти от конкретных условий. Флюорометрический метод наиболее доступен: измерение флюоресценции проводят иа спектрофлюорометре (любой марки)или же на отечественном флюорометре типа СКБ с интерференционными светофильтрг1ми. Для получения флюоресцирующих производных сухие остатки, соответствующие каждому из исследованных стероидов, растворяют в 0,3 мл этанола и добавч ляют 1,5 мл реагента 96% этанолконцентрированная серная кислота (It4) и прогревают в течение 5 мин при 6С I смесь охлаждают и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Затем измеряют флюоресценцию. Максимум флюоресценции для эстрона,. эстргщиола-17|) и эстриола при Л -50.0-520 нм (,Лв( 75-495 им). , ;Чувствительность метода 0,04 0,08 мкг для каждого из эстрогенов)

ГЖХ способ количественного измерения основан на исследовании фторпроизводных стероидов (детектор электронного захвата). Для получения фторпроиэводных, сухой остаток, соответствующий эстрону или эстрадиолу, растворяют в 0,5 мл бензола и добавляют 2 капли гептафтормасляного ангидрида;.смесь прогревают при 70 в течение 40 мин и высушивают под струей азота.При фторировании от каждого из эстрогенов получают несколько фторпроизводных. Применение тонкослойной хроматографии на силикагеле позволяет выделить дигептафторбутираты стероидов, которые в дальнейшем измеряют методом ГЖХ. Тонкослойную хроматографию (двумерную) проводят в системах растворителей: безол-метиленхлорид-этилацетат 2:1:1 и 1:1:2. При проведений

.ГЖХ (хроматограф Цвет-106) в качест:Ве жидкой фазы используют 3% 8Б-30, нанесенную на хроматон, применяют стеклянные колонки -2м, Т,мю1«кн , « 20б«; Т е«ар1П-ем 230, TJ ereKrofOа 240°. В этих условиях время удерживания эстрона равно 8,2 мин, эстра диола - 7,6 мин. ГЖХ анализ фторпроиэводных позволяет определить 0,,0 кг эстрогена.-В связи с тем, 0 1что эстриол дает большое число фтор производных (что затрудняет коли:чественное измерение) данный метЬД ;мы рекомендуем в основном для эстрона и эстрадиола.

5 I Радиоикмунологический способ коли чественного определения основан на использовании радиоиколунологических наборов (фирмы CEA-1PE-SORW и др.) после изложенной выше очистки экстрактов тканей. Метод позволяет определить 10-100 рд стероидов,.

Варианты использования метода. Метод предназначен для определения основных биологически гистивных эстр генов в тканях животных. Предлагаемые способы очистки и количественного измерения могут быть использованы также при исследовании Эстрогенов в биологических жидкостях. При atott экстракция неконьюгиррванных эстрогенов проводится с применением общепринятого экстрагента эфира (2x3 объема).

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ-В БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТАХ, включашвий проведение экстракции исследуемого субстрата и количественное биохимическое измерение содержания стероид ных гормонов, отличающийс я тем, что, с целью снижения трудоемкости способа путем одновременного определения эстрадиола г 17р, эстрона и эстриола в одной пробе и повышения точности, экстракцию проводят с помощью смеси спиртов с последующим пропусканием полученного продукта через целитовую колонку, проводят гидролиз полученного экстракта, очищают полученный тидролизат и затем разделяют искомые стерои ды с помощью адсорбционной хроматографии на микроколонке из . распределительной хроматографии, . после чего проводят их количественное биохимическое измерение. (Л