Способ определения 17-кетостероидов в моче Советский патент 1987 года по МПК G01N33/74 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к способам исследования андрогенов, и может быть использовано для выявления различных вариантов превращения 17-кетостерой- дов (17-КС) в организме, обусловленных физиологическими и патологическими факторами, а также для целей диагностики эндокринной патологии.

Цель изобретения - повьшение чувствительности способа за счет раздельного исследования глюкуронидов и сульфатов 17-кетостероидов, окрашивания их 2,4-динитрофенилгидразииом, раздельного хроматографирования с последующим фотоэлектроколориметриро- ванием в микрокюветах с короткофокусными линзами.

Способ осуществляется следующим образом

Из суточного количества отмеряют IB небольшую эрленмейеровскую колбоч- рку 30 мл профильтрованной мочи, устанавливают рН 6,5, добавляя каплями 2 н. раствор едкого натрия или соляной кислоты, и кипятят 3 мин для разрушения ингибитора фермента -глюку- ронидазы. Пробу охлаждают, добавляют 20 мл ацетатного буфера (рН 4,5) и навеску -глюкуронидазы, соответствующую 30 000 едо активности, затем выдерживают в термостате при 37 С в течение двух суток с повторным oбaвлeниeм через 24 ч той же дозы фермента.

После гидролиза приливают 0,3 мл 40%-ного раствора формальдегида, кипятят 2 мин, охлаждают под водопро- водной водой, отделяют выпавший в осадок денатурированный фермент центрифугированием при 10 000 обо в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают в делительную воронку, экст- рагируют 5 мин двойным объемом смеси хлороформ - диэтиловый эфир (1:1 )о После расслаивания экстракт сливают в чистую делительную воронку. При наличии эмульсии, которая располагается в верхней части экстракта, ее расслаивают центрифугированием и объединяют соответственно с органической и водной фазами.

Экстракт промывают насьш енным ра- створом бикарбоната натрия и дистиллированной водой дважды по 1/5 объема, сушат над безводным сернокислым натрием и выпаривают в круглодонной

коЛбе емкостью 50 мл при 40°Со После отгонки диэтилового эфира систему соединяют с водоструйным насосом для выпаривания хлороформао Сухой остаток смьшают со стенок на дно колбы 5 мл метанола, закрывают пробкой и помещают в морозильную камеру холодильника Через 14-16 ч метанол осторожно сливают в пробирку и выпаривают в токе азота. Таким путем удается освободиться от большинства липидов.

Для более полного освобождения от липидов и пигментов экстракт, скон- центрированньй на дне пробирки, растворяют, добавляя по 3-4 капли хлороформ - метанола, и наносят в виде полоски шириной 2-3 мм и длиной 80 мм на пластинку силуфола так, чтобы расстояние от боковых краев соответствовало 35 мм, а от нижнего - 20 мм Смьгоание экстракта повторяют до полного обесцвечивания растворителей На 1,5 см от экстракта с двух сторон наносят по 5-10 мкг андростандиона и дважды хроматографируют в системе хлороформ - этанол (49,5:0,3)

Места расположения пятен свидетелей проявляют, опрыскивая смесью 2 . %- ного раствора - динитробензола в этаноле и 20%-ного раствора КОН в метаноле (1:1) при экранировании остальных участков хроматограммы, Сорбент от зоны расположения свидетелей и ниже, включая стартовую линию, соскабливают с фольги, переносят в пробирку и дважды экстрагируют по 30 мин 5 мл дихлорэтан - метанола (9;l), центрифугируют,, сливают в пробирку и вьтаривают в токе азота.

Для сальволиза сульфатов к моче после извлечения глюкуронидов приливают небольшими порциями 30%-ный раствор серной кислоты, устанавливая рН 1 и добавляя мелко измельченный сульфат аммония до насыщения. Проводится повторная коррекция рН 30%-ным раствором серной кислоты и смесь дважды экстрагируют по 20 мин равным объемом этилацетата. Объединенные этилацетатные экстракты выдержкнают 3 термостате при 37 С в течение 48 ч, После сальволиза дальнейшую обработку упомянутого экстракта осуществляют аналогично хлороформно-эфирному

Для перевода глюкуронидов и сульфатов 17-КС в окрашенные комплексы к опытным пробам в вытяжном шкафу приливают растворы 2,4-динитрофенилгидРазина (0,03%; 0,5 мл) и трихлорук- сусной кислоты (0,3%; 0,1 мл), Вбт- держивают их в темноте, сначала при

мин

сначала

температуре водяной бани 80 С 10 а затем при 60 С в течение 30 мин. Экстракты выпаривают в токе азота

В отдельные пробирки отмеряют спиртовые растворы эталонов стероидов и переводят их в 2,А-динитрофе- нилгидразоны вышеописанным способом. Опытные пробы после предварительного растворения в 0,2-0,3 мл бензола переносят тонкими иглами (диаметр 0,3- 0,5 мм) из нержавеющей стали с отшлифованными концами На отдельные пластины силуфола (15x15 см) в одну точку слева на расстоянии 2,5 см от нижнего и бокового краев. В правый нижний угол на таком же расстоянии наносят эталоны 17-КСо Повторные смывания и перенесение окрашенных проб стероидов на слой сорбента повторяют до обесцвечивания растворителя.

Разделение 17-КС осуществляют в двух стеклянных камерах с притертыми крьшками для пластинок силуфола, в котдрые за 30 мин до хроматографиро- вания наливают по 50 мл смеси растворителей: в первую хлороформ - ацетон (47:3), а во вторую - диэтиловый эфир - петролейный эфир (35:15). В каждой системе (вначале в первой, затем во второй) хроматографируют дважды, не доводя фронт растворителей до верхнего края пластинки на 2,5 см.

После каждой разгонки выдерживают в вытяжном шкафу 20 мин. Хроматогра- фирование во второй системе проводят в направлении, перпендикулярном первоначальному, перед этим ниже опытной пробы на 0,5 см наносят в одну точку эталоны 17-КС, После разделени в 1-й и 2-й системе растворителей 17-КС с восстановленным кольцом А видны на хроматограмме в виде желтых а с наличием Д -3-кетогруппы - оранжевых пятен Идентификацию стероидов проводят при помощи стандартов

Полученные фракции стероидов и равные по площади участки сорбента соскабливают с алюминиевой фольги глазным копьем, переносят в пробирки, приливают по 1,0 мл этанола, встряхивают 60 мин, центрифугируют, сливают в другой ряд чистых пробирок и вьшаривают досуха Затем добавляют по 0,5 мл этанола, встряхивают и замеряют оптическую плотность хромогенов на ФЭК 56-М при длине волны 360 нм (фильтр № 2) в микро- i кюветах (рабочая длина 4,99 мм) с короткофокусными линзамио

Расчет фракций проводят по концентрированной кривой, построенной после хроматографирования различных 0 количеств дегидроэпиандростерона с учетом суточного диуреза.

Пример 1. Мужчина Ж., 29 лет, здоров. Суточная экскреция 17-КС составила 7,54 мг (глюкурони- 5 ды 2,62 мг, сульфаты 4,92 мг). Б глю- куронидах выделено двенадцать, в сульфатах - семь фракций. Наибольшая , концентрация андростерона и сиандростендиона выявлена в глюкуро- 0 нидах, а андростерона, этиохоланоло- на, дегидроэпиандростерона и эпиан- дростерона - в сульфатах.

Пример 2. Мужчина М., 38 лет, здоров. С суточной, мочой вы- 5 делено 8,59 мг 17-КС (глюкурониды 5,59 мг, сульфаты 3,0 мг).в глюкуро- нидах выявлено двеннадцать, в сульфа-, тах - девять фракций. Концентрация андростендиона, этиохоланолона, де- 0 гидроэпиандростерона, 1 1-,6-оксиандро- стендиона, 1 1- 3-оксиандростерона и 11-8-оксиэтиохоланолона была выше в глюкуронидах, а андростендиона и андростерона - в сульфатах. В суль- 5 фатах не определялись 11- -окси- и I1-кетоандростероНо

Пример 3. Больной Т., 27 лет, с синдромом Штейн-Левинталя. С суточной мочой вьщелено 7,28 мг 0 17-КС (глюкуронидов 3,7 мг, сульфатов 3,58 мг; одиннадцать и семь фракций соответственно). Обнаружено повышенное вьщеление глюкуронидов и сульфатов андростерона, этиохоланоло- 5 на, дегидроэпиандростерона и его производного - андростендиона, что можно объяснить замедлением превращения последнего в экстрогены. В то же время наблюдается увеличение суточной 0 экскреции 11-кетоандростендион-суль- фата. Это обстоятельство, очевидно, обусловлено отклонением направленности метаболизма андростендион-суль- фата. Вместо эстрогенов андростенди п 5 он-сульфат в повьщтенных количествах превращается в 11-кетоандростендион- сульфат. Отмечается также повышение глюкуронидов 11-|Й-оксиандростерона и I1-р-оксиэтиохоланолона, что может

513287586.

свидетельствовать об ускорении окис- 1дии коры надпочечников и половьпс же- лительного пути метаболизма кортизо- лез, в изучении особенностей метабола,лизма означенных стероидов при различных физиологических и патологичесПредлагаемый способ выгодно отли- 5 состояниях организма. чается от других тем, что позволяет

раздельно анализировать 17-KG, нахо- Формула изобретения дящиесд в соединении с глюкуроновой

и серной кислотами, В результате раз- Способ определения 17-кетостерои- деления глюкуронидов и сульфатов на tO дов в моче путем хроматографии с по- 12 фракций представляется возможность следующим фотоэлектроколориметрирова- исследования до 24 индивидуальных нием, отличающийся тем, 17-КС. Применение никрокювет с корот- что, с целью повьшения чувствительно- кофокусными линзами позволяет опреде- сти способа, из мочи больного вьщеля- лять в опытной пробе с достаточно 5 ют глюкурониды и сульфаты 17-кетосте- высокой точностью небольшие количест- роидов, окрапшвают их 2,4-динитрефе- ва (0,5-1,0 мкг) анализируемых гормо- нилгидразином, раздельно хроматогра- нов. Выявление более широкого спект- : фируют, а фотоэлектроколориметрию ра индивидуальных 17-КС имеет важное проводят в микрокюветах с короткофо- значение в оценке андрогенной функ- 20 кусными линзами.

Изобретение относится к биологии и медицине, точнее к способам исследования андрогенов, предназначено для вьшвления вариантов превращения 17-кетостероидов (17-КС) в организме, а также для диагностики эндокринной патологии. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Для этого пробы из суточндго количества мочи с рН 6,5 охлаждают, добавляют ацетатный буфер (рН 4,5) и навеску И-глюкуронидазы 30000 ед. активности, вьщерживают .в термостате при 37°С, через сутки добавляйТ ту же дозу фермента и держат еще сутки. После гидролиза приливают 40%-ный раствор формальдегида, кипятят 2мин, охлалвдают, отделяют выпавший в осадок денатурированный фермент центрифугированием. Надосадок сливают, экстрагируют двумя объемами смеси хлороформ - диэтиловый эфир (1:1). Образовавшуюся эмульсию расслаивают, как и весь экстракт, и объединяют с органической и водной фазами. Экстракт промьшают насьлценным раствором бикарбоната натрия и дистиллированной водой, сушат и выпаривают при 40 С. После отгонки диэтилового эфира выпаривают хлороформ, освобождают от большинства липидов. В пробе мочи хроматографированием выделяют глюку- рониды и сульфаты 17-кетостероидов, окрашивают их 2,4-динитрофенилгидра- зином, раздельно хроматографируют. Затем фотоэлектроколориметрируют в микрокюветах с короткофокусными линзами. Расчет фракций проводят по концентрационной кривой, построенной после хроматографирования различных количеств дегидроэпиандростерона с учетом суточного диуреза. Способ позволяет раздельно анализировать 17-КС, находящиеся в соединений с глюкуро- новой и серной кислотами, В результате исследуют До 24 индивидуальных 17-КС, что имеет важное значение в оценке андрогенной функции коры надпочечников и половых желез (Л ел 00