СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА И ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике во внутренних болезнях.

Известный лабораторный способ дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и цирроза печени заключается в прижизненном морфологическом исследовании биоптатов печени (Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты в клинической практике. СПб, «ТЕЗА», 1996, с.31-32; The role of liver biopsy in chronic hepatitis C. Saadeh S., Cammell G., Corey W.D. et al. Hepatology, 2001, v.33, p.196-200; Nainon O., Xiq G., Vanghan G. Diagnosis of hepatitis a virus infection: a molecular approach. Clin. Microbiol. Rev., 2006, №19 (1), p.63-79).

Недостатки способа диагностики: несмотря на высокую информативность, метод пункционной биопсии печени является трудоемким, достаточно травматичным, имеется техническая сложность получения материала и значительная вероятность развития тяжелых осложнений.

Технический результат: снижение травматичности, повышение доступности исполнения при высокой чувствительности, специфичности и эффективности.

Способ дифференциальной диагностики заключается в следующем. У больных определяют уровень общего оксида азота (NO) в плазме крови с целью оценки наличия и степени дисфункции эндотелия. Общее количество оксида азота (Total Nitric Oxide Assay) в плазме крови определяют методом иммуноферментного анализа набором SYSTEMS (США). Метод основан на ферментном превращении нитрата в нитрит с участием фермента нитрит редуктазы. Реакция регистрирует колориметрически концентрацию нитрита по азокрасителю, образующемуся в реакции Грисса. Реакция Грисса основана на двухстадийной реакции диазотирования, в которой кислый NO₂ производит нитрозализирующий агент, реагирующий с сульфаниловой кислотой с образованием иона диазония. Этот ион присоединяется к N-(1-нафнил) этилендиамину с формированием цветного азопроизводного, который поглощает свет на длине волны 540 нм, на изоляции клеток эндотелия вместе с тромбоцитами с последующим осаждением с помощью аденозиндифосфата. При значении NO более или равно 17 мкмоль/л диагностируют хронический вирусный гепатит, при количестве NO менее 17 мкмоль/л - цирроз печени.

Способ осуществляют следующим образом. Для сбора образцов крови из локтевой вены используют вакуумные пробирки объемом 2,7 мл с антикоагулянтом ЭДТА. Плазму отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 1000 g. Все образцы разбавляют в 2 раза реакционным буфером, фильтруют через молекулярный фильтр (ультрафильтрация) с массой 10000 для удаления белков. После приготовления реагентов, рабочих разведений стандартов и образцов по инструкции, а также необходимого количества стрипов в ячейку для бланка добавляют 200 мкл реакционного буфера, в ячейку для нулевого стандарта - 50 мкл реакционного буфера. В оставшиеся ячейки вносят по 50 мкл стандарта нитрата и образца, добавляют по 25 мкл NADH и по 25 мкл нитратредуктазы в ячейки для всех стандартов и образцов, перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°C под пленкой в термостате. Затем во все ячейки, кроме бланка, вносят по 50 мкл реактива Грисса 1 и по 50 мкл реактива Грисса 11, перемешивают и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Затем определяют оптическую плотность ячеек при 540 нм. Концентрацию общего NO измеряют в мкмоль/л. При значении NO более или равно 17 мкмоль/л диагностируют хронический вирусный гепатит, при количестве NO менее 17 мкмоль/л - цирроз печени.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Больной Ж., 44 года, диагноз: хронический гепатит С, фаза реактивации, анти-ВГС - с 2005 г. Жалобы на слабость, снижение аппетита, боли в правом подреберье. Объективно - гепатомегалия +2 см, безболезненная, гладкая. Биохимическое исследование: АЛТ - 114 Ед./л, ACT - 52,5 Ед./л, общий билирубин - 12 мкмоль. По данным УЗИ - диффузные изменения в печени. Уровень NO в плазме крови 17,2 мкмоль/л. Диагноз хронического вирусного гепатита С подтвержден.

Пример 2. Больной Ш., 31 год, диагноз: хронический гепатит С и B в фазе реактивации, анти-ВГС, HBsAg положительные. Объективно - гепатомегалия +3 см, плотная. Биохимическое исследование: АЛТ - 157 Ед./л, ACT - 88 Ед./л, общий билирубин - 8,9 мкмоль/л, тимоловая проба - 3,2 Ед. По данным инструментальных исследований - диффузные изменения в печени. Уровень NO в плазме крови 20,2 мкмоль/л. Диагноз хронического вирусного гепатита подтвержден.

Пример 3. Больная Т., 60 лет, диагноз: цирроз печени в исходе хронического гепатита С, стадия субкомпенсации, портальная гипертензия, асцит. Анти-ВГС положительные. Жалобы на слабость, периодическое повышение температуры тела, зуд. Объективно - гепатомегалия +2 см, плотная, бугристая; спленомегалия +1 см, телеангиэктазии, асцит. Биохимическое исследование: АЛТ - 121 Ед./л, ACT - 119 Ед./л, общий билирубин - 143 мкмоль/л, прямой билирубин - 69,2 мкмоль/л, тимоловая проба - 3,3 Ед.; тромбоцитопения.

По данным инструментальных исследований - гепатоспленомегалия, асцит, признаки портальной гипертензии. Уровень NO в плазме крови 11,9 мкмоль/л. Диагноз цирроза печени подтвержден.

Пример 4. Больная М., 48 лет, диагноз цирроз печени в исходе хронического гепатита В и Д, стадия декомпенсации, портальная гипертензия, асцит, варикозное расширение вен пищевода 11 ст. HBsAg положительный, 2000 г. - суперинфекция гепатит Д. Жалобы на слабость, тяжесть в правом подреберье, одышку, периодическое повышение температуры тела. Объективно - гепатомегалия +3 см, плотная, бугристая; спленэктомия в 2002 г., телеангиэктазии, асцит. Биохимическое исследование: АЛТ - 25,9 Ед./л, ACT - 47 Ед./л, общий билирубин - 18,3 мкмоль/л, щелочная фосфатаза - 139 Ед., тимоловая проба - 5,7 Ед.; анемия, тромбоцитопения. По данным УЗИ - гепатомегалия, асцит, признаки портальной гипертензии. Уровень NO в плазме крови 9,1 мкмоль/л. Диагноз цирроза печени подтвержден.

Данные статистики определения уровня NO в группах больных хроническим вирусным гепатитом С и циррозом печени в сравнении с группой практически здоровых лиц представлены в таблице.

Таблица Сравнительный анализ NO в группах больных хроническим гепатитом С, циррозом печени и в группе практически здоровых лиц (М±δ) Показатели Контрольная группа n=20 Больные ХГС
n=4 Больные ЦП
n=30 Р1 Р2 Р3 NO, мкмоль/л 29,43±3,34 18,6±3,02 13,1±4,52 0,001 0,001 0,01

Примечание: Р1 - достоверность отличий в группах здоровых и больных хроническим гепатитом С; Р2 - достоверность отличий в группах здоровых и больных циррозом печени; Р3 - достоверность отличий в группе больных хроническим гепатитом С и группе пациентов с циррозом печени.

Операционные характеристики лабораторного теста определения уровня NO в плазме крови у больных хроническим вирусным гепатитом С и циррозом печени с целью их дифференциации по степени дисфункции эндотелия: диагностическая чувствительность (ДЧ) составила 80%, диагностическая специфичность (ДС) - 87%, диагностическая эффективность - 70%. Точка разделения для больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени по уровню NO при построении кумулятивных кривых зарегистрирована на уровне 17,0 мкмоль/л. Соответственно при значении NO более или равно 17 мкмоль/л диагностируют хронический вирусный гепатит, при количестве NO менее 17 мкмоль/л - цирроз печени.

Положительный эффект от использования предлагаемого способа дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и цирроза печени по уровню оксида азота с целью оценки степени дисфункции эндотелия заключается в его нетравматичности, отсутствии осложнений, информативности, чувствительности и специфичности.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике внутренних болезней. Сущность способа: дополнительно у больного в плазме крови определяют общее количество оксида азота, и при значении NO более или равно 17 мкмоль/л диагностируют хронический вирусный гепатит, при количестве NO менее 17 мкмоль/л - цирроз печени. Технический результат: нетравматичная, чувствительная, специфичная и эффективная дифференциальная диагностика хронического вирусного гепатита и цирроза печени вирусного генеза по степени дисфункции эндотелия. 1 табл.

Способ дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и цирроза печени путем иммуноферментного исследования крови, отличающийся тем, что дополнительно у больного в плазме крови определяют общее количество оксида азота, и при значении NO более или равно 17 мкмоль/л диагностируют хронический вирусный гепатит, при количестве NO менее 17 мкмоль/л - цирроз печени.