СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДИГИОЗИНА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения бактериальных пигментов, в частности ярко-красного пигмента продигиозина, синтезируемого энтеробактериями Serratia marcescens, который может быть использован в промышленности и медицине. В промышленности продигиозин рекомендуется в качестве красителя для пластмасс, маркера нефтепродуктов. В медицине продигиозин и продигиозинподобные пигменты рассматриваются как новое семейство противоопухолевых препаратов и иммунодепрессанты. Применение пигмента в промышленности тормозится из-за его высокой стоимости.

Известны способы получения продигиозина с использованием различных штаммов-продуцентов и различных питательных сред [1, 2, 3, 4, 5].

Недостатком этих способов является потеря способности к образованию продигиозина штаммами продуцентами при длительном хранении в лабораторных условиях, низкий выход пигмента, наличие в питательной среде в качестве источника азота дорогостоящих пептона и других органических источников, длительное выращивание бактерий, использование в отдельных случаях агаризованной среды, что ограничивает применение пигмента.

Наиболее близким к предлагаемому, выбранному в качестве прототипа по совокупности признаков и достигаемому результату, является способ получения продигиозина, описанный Трутко и Акименко [3].

Serratia marcescens BKM В-851 выращивают в колбах на качалках с перемешиванием при 200 об/мин при температуре 29°С на жидкой питательной среде Кинга А [3].

Недостатком прототипа является низкий выход целевого продукта, использование в питательной среде в качестве источника азота высокого содержания дорогостоящего пептона, что не реально в условиях промышленного получения пигмента, ввиду дороговизны способа.

Задачей или техническим результатом заявляемого изобретения является повышение выхода целевого продукта (продигиозина).

Сущность заявляемого способа заключается в том, что с целью повышения выхода бактериального пигмента продигиозина, в условиях, предусматривающих культивирование при аэрации и перемешивании культуры на жидкой питательной среде, содержащей источник азота, глицерин, K₂SO₄, MgCl₂, в качестве продуцента пигмента штамм Serratia marcescens BKM В-851, экстракцию пигмента из клеток, отделение пигмента от бактериальной массы, в качестве источника азота питательная среда содержит колламин (гидролизат коллагена), при следующем содержании компонентов, г/литр дистиллированной воды:

Колламин - 5,0

Глицерин - 10,0

K₂SO₄ - 10,0

MgCl₂ - 1,4, a экстракцию проводят подкисленным 96% этанолом.

Штамм Serratia marcescens BKM B-851 отобран в результате исследования пигментообразования 22 штаммов Serratia marcescens из коллекции микроорганизмов, хранящихся на кафедре микробиологии Казанского государственного университета. Исследованные штаммы были получены в различные годы из различных коллекций, а также выделены из воздуха и почвы. Штамм Serratia marcescens BKM B-851 отличается от других изученных штаммов высоким выходом продигиозина. Кроме того, для штамма Serratia marcescens BKM B-851, в отличие от других исследованных штаммов, характерно сохранение способности к пигментообразованию при длительном хранении в лабораторных условиях в коллекции без пересева (в течение четырех лет).

В работе использовали «колламин 80 пищевой» гидролизат коллагена (сырье для производства БАД, СПП) (ТУ9186-002-18045931-07), изготовленный ЗАО «Биопрогресс» (141142, Московская обл., Щелковский р-н, п. Биокомбинат, ВНИТИБП). Источник получения колламина 80 - коллагеновый слой кожи млекопитающих. Колламин 80 является протеолитическим гидролизатом коллагена и содержит все аминокислоты этого белка (в том числе незаменимые) в природно-сбалансированном соотношении: аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, валин, гистидин, глицин, глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин, оксилизин, орнитин, лизин, метионин, пролин, серин, тирозин, треонин, триптофан, фенилаланин, цистеин, оксипролин, таурин.

Колламин 80 представляет собой смесь аминокислот, ди-, три-, и тетрапептидов. Водорастворимая фракция составляет 100%, где 45% - свободные аминокислоты, ди-, три- и тетрапептиды около 52%, полипептиды с молекулярной массой более или равной 2000D - менее 1%.

В препарате, согласно паспорту, массовая доля влаги, %, не более 2,41; массовая доля аминного азота, %, не менее 4,2; рН 1% раствора - 5,15 [http://www.kollamin80.ru/].

Изобретение позволяет существенно увеличить выход продигиозина и соответственно удешевить его стоимость.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Приготовление питательной среды

В 0,5 литра дистиллированной воды растворяют последовательно: колламин (гидролизат коллагена) - 5,0 г; глицерин - 10,0 г; K₂SO₄ - 10,0 г; MgCl₂ - 1,4 г, и среду доводят дистиллированной водой до литра. рН среды доводят до 7,6-7,8 при помощи NaOH. Полученную таким образом среду разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при 0,5-0,7 атм.

Подготовка посевного материала

Культуру Serratia marcescens BKM B-851 выращивают в течение суток в пробирках со скошенной агаризованной средой при температуре 28±0,1°С.

Выросшие клетки смывают 0,5% физиологическим раствором из расчета 5 мл физиологического раствора на пробирку. Полученный таким образом посевной материал засевают в колбы с питательной средой из расчета 1% от объема среды в колбах.

Постановка опыта

Посевной материал засевают в конические колбы с питательной средой. Отношение объема питательной среды к объему колбы - 1:5. Посевы выращивают на качалке (200 об/мин) при 28±0,1°С в течение 48 часов. Затем бактериальные клетки собирают центрифугированием при 16000 g в течение 10 мин.

Экстракция пигмента из клеток

Экстракцию пигмента из клеток проводят подкисленным 96% этанолом (9 мл 96% этанола + 1 мл 1N HCl). 2 г биомассы заливают 40 мл подкисленного этанола и встряхивают в течение 1 часа. Затем центрифугированием либо отстаиванием клетки отделяют от надосадочной жидкости, содержащей пигмент, и вторично заливают новой порцией этанола, обработку клеток этанолом повторяют дважды. Затем бактериальную массу отделяют, и пигмент высушивают в вакуумном шкафу при температуре 30°С. Полученный пигментный препарат растворяется в нефтепродуктах, этаноле, ацетоне, метаноле, неполярных растворителях и не растворяется в воде.

Определение содержания пигмента в полученных препаратах

Для этого полученный пигмент растворяют в подкисленном этаноле (9 мл 96% этанола + 1 мл 1N HCl). Количество пигмента рассчитывают по коэффициенту абсорбции продигиозина на спектрофотометре при длине волны 535 нм в 1 см кюветах. При длине волны 535 нм коэффициент абсорбции продигиозина составляет 51,5*10³ мг/мл/см² (пятьдесят одна целая и пять десятых, умноженное на десять в третьей степени мг/мл) [6].

Выход пигмента составляет 0,90-0,92 г/л питательной среды (таблица 1).

Пример 2. Проводят аналогичным образом, кроме того, что в качестве питательной среды используют агаризованную овсяную среду [4]

Пример 3. Проводят аналогичным образом, кроме того, что в качестве питательной среды используют пептон-глицериновую среду [2]. Пептон-глицериновая среда широко используется различными авторами для получения пигмента - продигиозина.

Пример 4. Проводят аналогичным образом, кроме того, что в качестве питательной среды используют среду Кинга А (прототип) [3].

Пример 5. Проводят аналогичным образом, кроме того, что содержание колламина в среде составляет 20 г/л.

Пример 6. Проводят аналогичным образом, кроме того, что содержание колламина в среде составляет 10 г/л.

Пример 7. Проводят аналогичным образом, кроме того, что содержание колламина в среде составляет 2,5 г/л.

Пример 8. Проводят аналогичным образом за исключением того, что бактерии выращивают в течение 144 ч, в процессе роста из опытной колбы отбирают пробы через каждые 24 часа в течение 144 часов.

Сравнительное изучение биосинтеза пигмента штаммом Serratia marcescens BKM В-851 на предлагаемой и известных средах показывает, что на предлагаемой среде выход пигмента выше в 2,4 - 5,0 раза в зависимости от сравниваемой среды, а стоимость 1 г продигиозина (из расчета стоимости среды) удешевляется в 8 раз по сравнению с пептон-глицериновой средой, в 28 раз по сравнению с агаризованной овсяной средой, в 20 раз по сравнению с прототипом (таблица 1).

Таблица 1 питательная среда пигмент (г/л) Стоимость литра среды (рубли) предлагаемая 0,920±0,078 7,0 известная, агаризованная овсяная (4) 0,380±0,050 75,0 известная, пептон-глицериновая (2) 0,185±0,006 11,0 известная, Кинга А прототип (3) 0,230±0,040 36,0

Значения относительного выхода продигиозина при использовании штамма Serratia marcescens BKM В-851 в зависимости от соотношения компонентов среды (колламина, г/л Н₂О) представлены в таблице 2. Снижение либо повышение концентрации колламина относительно оптимального его количества (5 г/л среды) приводит к снижению выхода пигмента.

Результаты изучения времени культивирования, необходимого для получения максимального количества пигмента, представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, на рекомендуемой среде максимальное количество пигмента штаммом Serratia marcescens BKM В-851 образуется на 48 час роста бактерий.

Таблица 3 Время культивирования продуцента на рекомендуемой среде, ч Количество продигиозина, % от оптимального значения 24 94 48 100 72 78 96 60 120 51 144 50

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Предлагаемый способ имеет изобретательский уровень, так как не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с его отличительными признаками и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение можно реализовать в полупроизводственных условиях и в промышленности посредством использования стандартных устройств, например ферментеров и лабораторного оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.

Литература

1. Williams R.P. Studies on pigmentation of Serratia marcescens. / R.P. Williams, C.L.Gott, J.A.Green // J. Bacteriol. - 1961. - V.81, №3. - P.376-379.

2. Katz D.S. Detection of pigment precursors in white clinical strains of Serratia marcescens/ D.S. Katz, R.J. Sobleski // J. Gen. Microbiol. - 1979. - V.9, №2. - P.301-303.

3. Трутко С.М. Роль процесса биосинтеза продигиозина в регуляции окислительного обмена продуцента / С.М.Трутко, В.К.Акименко // Микробиология. - 1989. - Т.58, №3. - С.723-729.

4. Гарейшина А.З. Композиция, включающая нефтепродукт и маркер, способ и раствор для маркирования нефтепродукта, способ идентификации нефтепродукта и способ получения маркера / А.З.Гарейшина, Е.В.Петухова, Д.В.Юсупова, Н.А.Лебедев, Т.Н.Чертилина, А.З.Пономарева // Патент на изобретение RU №2218381, C10L 1/00, С10М 159/02, C10N 30:20, приоритет от 22.07.02. - 2003. Бюл. №34.

5. Wei J.H. Enhanced production of prodigiosin - like pigment from Serratia marcescens SM delta R by medium improvement and oil - supplementation strategies / J.H. Wei, W.C. Chen // J. BiosciBioeng. - 2005, №6. - P.616-622.

6. Williams R.P. Influence of temperature of incubation and type of growth medium on pigmentation in Serratia marcescens // R.P.Williams, C.L.Gott, S.M.Qadri // J.Bacteriol. - 1971, - V.106, №2. - P.438-443.

7. Колламин 80 [Электронный ресурс]. - 2008. - Режим доступа: http://www.kollamin80.ru/ - Дата доступа: 09.10.2008.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в промышленности в качестве красителя для пластмасс, маркера нефтепродуктов, в медицине как новое семейство противоопухолевых препаратов и иммунодепрессант. Штамм Serratia marcescens BKM В - 851 культивируют в условиях аэрации на жидкой питательной среде, содержащей колламин (гидролизат коллагена), глицерин, K₂SO₄, MgCl₂ и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов. Проводят экстракцию пигмента из клеток подкисленным 96% этанолом с последующим отделением пигмента от бактериальной биомассы. Изобретение позволяет увеличить выход продигиозина. 3 табл.

Способ получения продигиозина, предусматривающий культивирование штамма Serratia marcescens BKM В-851 в условиях аэрации на жидкой питательной среде, содержащей источник азота, глицерин, K₂SO₄, MgCl₂, экстракцию пигмента из клеток, отделение пигмента от бактериальной биомассы, отличающийся тем, что в качестве источника азота питательная среда содержит колламин, при следующем содержании компонентов дистиллированной воды, г/л.
колламин 5,0 глицерин 10,0 K₂SO₄ 10,0 MgCl₂ 1,4