ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS LICHENIFORMIS-ПРОДУЦЕНТ ЩЕЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ Российский патент 2007 года по МПК C12N9/56 C12N1/20 C12R1/66 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для производства ферментных препаратов протеаз, применяемых в различных областях промышленности и сельского хозяйства, где требуется гидролиз белковых веществ.

Протеазы (протеолитические ферменты) применяются в производстве моющих средств (для удаления белковых загрязнений); в текстильной промышленности для обработки изделий из шерсти, шелка и кожи и улучшения их потребительских свойств, для обезволашивания шкур при производстве кожи; в различных отраслях пищевой промышленности для получения белковых гидролизатов, для мягчения мяса и рыбы, для получения клеев; в сельском хозяйстве - в качестве кормовой добавки, а также для утилизации перьев и получения из них кормовых продуктов.

Известны различные микроорганизмы - продуценты щелочных протеаз и способы их культивирования в аэробных условиях. Выбор штамма-продуцента определяется его способностью обеспечить высокий уровень активности протеаз в ферментационной среде, скоростью их биосинтеза, выходом ферменты с единицы массы используемых для ферментации субстратов, а также стоимостью этих субстратов.

Известен штамм Bacillus subtilis-103 (SU, авторское свидетельство 283152, 1970). При выращивании в колбах на качалке максимальное образование ферментов в среде наблюдается после 48-50 часов роста. Максимальная протеолитическая активность (60-70 ед/мл и 29-30 мг тирозина на 1 мл) проявляется в слабокислых и нейтральных зонах рН, 6,6-7,5. Однако штамм Bacillus subtilis-103 не обладает достаточно высокой протеазной активностью, что усложняет процесс получения высокоактивных препаратов протеолитических ферментов. Кроме того, при глубинном культивировании штамма результаты ферментации малостабильны, сама культура подвержена фаголизису, и, как следствие, выход продукции невысок.

Известен штамм Bacillus licheniformis ВКМ В-222OД - продуцент кератиназы (сериновой протеазы) (RU, патент 2177994, 2002), который может быть использован в микробиологической промышленности для производства ферментных препаратов, применяемых в легкой промышленности и в сельском хозяйстве, где требуется гидролиз нативного кератина. Штамм Bacillus licheniformis ВКМ В-222ОД обладает повышенной способностью к биосинтезу кератиназы и продуцирует не менее шести внеклеточных ферментов, в том числе щелочную протеазу и α-амилазу, которые усиливают гидролизующий эффект кератиназного препарата. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях при температуре 40°С в течение 48-72 часов, рН среды 7,5-7,8. Кератиназа активна в широком диапазоне рН - от 5,5 до 10,0 с оптимумом при рН 7,5; в диапазоне температуры от 30 до 70°С с оптимумом при 50°С.

Однако штамм Bacillus licheniformis BKM В-222OД обладает высокой продуктивностью, преимущественно в отношении фермента кератиназы, специфично гидролизующей кератиноподобные белки, которые отличаются устойчивостью к деградации обычными протеолитическими ферментам, и гораздо в меньшей степени - в отношении комплекса щелочных протеаз, необходимых для гидролиза растительных белков.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является штамм Bacillus subtilis V-50 - продуцент протеазы (SU, авторское свидетельство 677504, 1984 г.). Выращивание штамма производят на стандартной производственной среде при 37°С в термостате на круговой качалке, а также на бродильных установках типа «Биолофит». Во всех опытах в качестве контроля использовали производственный штамм Bacillus subtilis-103. Максимальная активность проявлялась на 48 часу роста и составляла 70-80 ед/мл, что составляло 117% по отношению к активности штамма Bacillus subtilis-103. Однако заявляемая активность штамма Bacillus subtilis V-50 все же остается невысокой, что делает нецелесообразным его практическое применение.

Техническая задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, состоит в получении нового высокоактивного бактериального штамма - продуцента щелочной протеазы, пригодного для культивирования с использованием дешевого сырья.

Технический результат, получаемый при осуществлении изобретения, состоит в обеспечении высокого уровня активности протеаз в ферментационной среде.

Сущность объекта изобретения - новый специально селекционированный штамм бактерий Bacillius licheniformis-60 - продуцент щелочной протеазы.

Bacillius licheniformis-60 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ В-2366 Д.

Штамм Bacillus licheniformis-60 ВКМ В-2366 Д получен с использованием многоступенчатой генетической селекции с применением методов эффективного мутагенеза - ультрафиолетового облучения с одновременным воздействием химических мутагенов из штамма Bacillus licheniformis-78 ВКМ B-2184D.

Условия хранения. Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет на косяках с агаризованной средой следующего состава: мясо-пептонный бульон и солодовое сусло (7°С) в соотношении 1:1; казеин 1,0%; агар-агар - 2,5%; рН среды 7,5; с обязательным пересевом не реже одного раза в 2 месяца на эту же среду.

Культурально-морфологические признаки штамма.

Клетки представляют собой грамположительные, одиночные подвижные палочки размером 0,6-0,8 и 0,2-0,3 мк, спорообразующие. В логарифмической фазе роста образуются цепочки из 2-3-х клеток более вытянутой формы, к 56 часам роста (стационарная фаза) цепочки распадаются, клетки утолщаются, появляются споры, имеющие центральное положение и овальную форму.

На мясо-пептонном агаре (37°С, 24 часа) штамм дает нормальный рост клеток, колонии неправильной формы с приподнятым центром, слизистые, гладкие, непрозрачные, 2-5 мм в диаметре, в процессе роста постепенно приобретают светло-коричневый пигмент.

На мясо-пептонном бульоне (37°С, 24 часа) штамм дает нормальный рост клеток, в процессе роста среда мутнеет, к 24 часам роста появляется светло-коричневый оттенок.

На агаризованной среде с казеином или микробными клетками штамм дает нормальный рост и образование зон гидролиза вокруг колоний. Колонии неправильной формы, слизистые, гладкие, непрозрачные с приподнятым центром, 3-5 мм в диаметре, с ровными краями. К 72 часам роста появляются споры на всей поверхности колонии, цвет спор - светло-коричневый, переходящий к 120-144 часам роста в темно-коричневый.

Физиолого-биохимические свойства штамма

Аэроб. Температурный диапазон роста - 10-55°С. Оптимальная темпратура роста - 37°С. Растет при значениях рН среды - 5-10. Оптимум рН роста - 7,3-7,8.

Желатин разжижает. Казеин быстро гидролизует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Вызывает гемолиз. Сбраживает с образованием кислоты арабинозу, ксилозу, фруктозу, маннозу, маннит, сорбит, глицерин, декстрин, гликоген без выделения газа, глюкозу ферментирует анаэробно, утилизирует лимонную кислоту.

Штамм способен расти на средах с аммонийными солями в качестве единственного источника азота, а также на среде, содержащей дрожжевые клетки (прессованные пекарские дрожжи, кормовые дрожжи или белково-витаминный комплекс БВК) как источник углеродного и азотного питания.

Вид Bacillus licheniformis, к которому отнесен штамм Bacillus licheniformis-60 ВКМ В-2366 Д, не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения». Отсутствует в списках патогенных бактерий по Положению Минздрава и в списках патогенных бактерий в Official Journal of the European Communities NC 217/3237, 24.08.92.

Полученный мутант по своим морфологическим свойствам отличается от исходного штамма более слабым спороношением, цветом пигмента спор, более коротким циклом роста, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу протеаз.

При изучении морфологической изменчивости при рассеве штамма Bacillus licheniformis-60 ВКМ В-2366 Д на селективных средах наблюдается выщепление нетипичныых колоний в количестве 3-5%, что свидетельствует о стабильности культуры.

Культивирование штамма Bacillus licheniformis-60 ВКМ В-2366 Д осуществляют в аэробных условиях в погружном состоянии при температуре 37°С в течение 48-72 часов, рН среды 7,5-7,8. Для роста культуры и биосинтеза протеазы источником углерода и азота могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, кукурузная, соевая или другая зерновая мука, либо их экстракты, дрожжевые клетки, пептон, дрожжевой экстракт, казеин, мочевина, аммонийный азот.

Активность щелочной протеазы определяют по методу Ансона, модифицированному Е.Д.Каверзневой для комплексных ферментных препаратов протеаз, при рН субстрата 9,5; температуре 30°С, используя казеин в качестве субстрата [Каверзнева Е.Д. «Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз». Прикл. биохим. микробиол. 1980, т.7., вып.2, с.225-228]. За единицу активности щелочной протеазы принимается такое количество фермента, которое приводит к образованию в не осаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние количество казеина, содержащее 1 мкмоль тирозина.

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрапии или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов, получаемых осаждением этанолом или другими органическими растворителями из ультрафильтрата культуральной жидкости, а также высушиванием или гранулированием.

Протеаза активна в широком диапазоне рН - от 5,5 до 12,0 с оптимумом при рН 7-10,5 в диапазоне температуры от 30 до 70°С, с оптимумом при 60-65°С.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Для получения посевного материала (инокулята) культуру бактерий Bacillus licheniformis-60 BKM В-2366 Д выращивают на жидкой питательной среде состава: казеин - 1%; мясо-пептонный бульон и солодовое сусло в соотношении 1:1, рН среды 7,5. Культивирование проводят в качалочных колбах, содержащих 50 мл стерильной питательной среды, на качалке с 240 об/мин при 37°С в течение 36-48 часов.

Полученный посевной материал в количестве 0,3% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащие 50 мл питательной среды состава, г/л: кукурузная мука - 100, соевая мука - 10, СаСО₃ - 2,5, MgSO₄×7Н₂О - 2,5; рН среды 7,5-7,8.

Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях на качалке (240 об/мин) при температуре 37°С. Каждые 24 часа, начиная с 48 часов роста, отбирают пробы, в которых определяют протеазную активность.

Протеазная активность в культуральной жидкости на 60 часов роста составляет 210 ед/мл.

Пример 2. Культивирование осуществляют в качалочных колбах, как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: кукурузная мука - 120, соевая мука - 20, СаСО₃ - 2,5, MgSO₄×7Н₂О - 2,5; рН среды 7,5-7,8.

Колбы инкубируют на качалке при 37°С и 240 об/мин в течение 60 часов. Протеазная активность в культуральной жидкости составляет 260 ед/мл.

Пример 3. Культивирование осуществляют в качалочных колбах, как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: кукурузная мука - 120, кукурузный крахмал - 20, соевая мука - 20, СаСО₃ - 2,5, MgSO₄×7Н₂О - 2,5; рН среды 7,5-7,8.

Колбы инкубируют на качалке при 37°С и 240 об/мин в течение 60 часов. Протеазная активность в культуральной жидкости составляет 280 ед/мл.

Пример 4. Проводят процесс культивирования в ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6,0 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Ферментер инокулируют 500 мл выросшей культуры, полученной через 36 ч культивирования на качалочных колбах (по примеру 1).

Культивирование осуществляют в течение 60 часов при 37°С, рН среды 7,5-7,8, используя состав среды, как описано примере 3. Протеазная активность в культуральной жидкости составляет 320 ед/мл.

Активность сухого спиртоосажденного препарата щелочной протеазы составляет 1600 ед/г.

Пример 5. Культивирование осуществляют в качалочных колбах, как описано в примере 3, используя в качестве продуцента исходный штамм Bacillus licheniformis-78 BKM B-2184D.

Колбы инкубируют на качалке при 37°С и 240 об/мин в течение 60 часов. Протеазная активность в культуральной жидкости составляет 45 ед/мл.

Таким образом, предлагаемый штамм Bacillus licheniformis-60 BKM В-2366 Д обладает способностью продуцировать щелочную протеазу, что создает возможность получения высокоактивных ферментных препаратов щелочной протеазы.

Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.

Ферментные препараты, получаемые на основе предлагаемого штамма, позволяют существенно увеличить эффективность их использования в различных областях биотехнологии и, особенно, в качестве кормовых добавок.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для производства ферментных препаратов протеаз, применяемых в различных областях промышленности и сельского хозяйства, где требуется гидролиз белковых веществ. Штамм Bacillus licheniformis BKM В-2366Д получен из штамма В. licheniformis BKM В-2184Д с использованием многоступенчатой генетической селекции с применением ультрафиолетового облучения с одновременным воздействием химических мутагенов. Протеазная активность в культуральной жидкости на 60 ч достигается 320 ед/мл. Активность сухого спиртоосажденного препарата щелочной протеазы составляет 1600 ед/г. Изобретение обеспечивает возможность получения высокоактивных ферментных препаратов щелочной протеазы.

Штамм бактерий Bacillus licheniformis-60 BKM В-2366 Д (Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) - продуцент щелочной протеазы.