Штамм @ @ @ @ -3 @ -продуцент эндонуклеазы рестрикции @ @ Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 C12R1/43 

lib

Vl

О Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано дл/i получения эндонуклеазы рестрикции Sma 1 (R.Sma 1). R.Sma 1 - эндонуклеаза рестрикции разрезающая двунитевую молекулу ДНК в участках, имеющих нуклеотидную последовательность R.Sma 1 ССС GGG GGG GCC В результате образуются фрагменты с тупыми концами, R.Sma 1 испол зуется в работе в области молекулярной биологии, генетики, генной инженерии. Известен единственный штамм - про дуцент R.Sma 1 - Serratia marcescens Sft tn. Известный штамм - продуцент рестриктазы Sma. 1 Serratiamarcescens S устойчив ко многим антибиотикам (Su, Km, Тс, Cm, Pn, Pr, Ox, Sm), но чувствительный к ампициллину. Нами был взят вариант продуцента Serratia marcescens SBR, который устойчив к ампициллину. Подобной множественной устойчивостью к антибиотикам обладают многие штаммы Serrati marcescens, не являющиеся продуцента ми рестриктазы Sma 1. Для подготовки штамма-продуцента R.Sma 1 к фермента ции в условиях производства целесообразно ввести специфический генетический маркер. Цель изобретения - обесечение воз можности отбора и контроля при культивировании штамма, что особенно важ но в условиях промьшшенного получения фермента R.Sma 1. Поставленная цель достигается тем, что в качестве штамма-продуцента R.Sma 1 используют штамм Serratia marcescens SBRTp. Он депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМ R-ЗД. Штамм обладает селективньм маркером, обеспечивающим устойчивость к триметоприму (Тр), который он стабил но сохраняет. Описание штамма-продуцента R.Sma Serratia marcescens ВКМ R-ЗД. Морфологические признаки. Грамотрицательная подвижная палочка с пери трихальньми жгутиками. Принадлежит к семейству Enterobacteriaceae. Образо вание недяффундируюгцего пигмента продигиозина варьирует в зависимости от условий культивирования и среды. Физиoлoгo-биoxи пlчecкиe признаки. В качестве источника углерода могут быть использованы цитрат и ацетат. Из углеводов сбраживает целлобиозу, инозитол, глицерол без выделения газа и мальтозу, сахарозу, глюкозу с вьщелением небольшого количества газа. Не сбраживает арабинозу. Реакция с метилротом - отрицательная, а реакция Фогеса-Проскауера положительная. Содержание Г+Ц в ДНК 58-58,4 мол.%. Образует эндонуклеазу рестрикции ДНК Sma 1 и неспецифические ДНКазы. В зависимости от условий культивирования уровень активности фермента Sma варьирует от 200 до 800 ед На 1 г биомассы. Культуральные признаки. Хорошо растет на твердых и жидких мясопептонных и минеральных средах. Оптимальная температура роста 30°С. Генетические признаки. Содержит рекомбинантную плазмидную ДНК мол. веса 5,4 тысяч п.о., обеспечивающую устойчивость штамма к триметоприму (1,5-500 мкг/мл). Чувствителен к налидиксовой кислоте, канамицину, гентамицину и неомицину. Штамм получен . трансформацией штамма S. marcescens SBR плазмидной ДНК pBR 322 frd. Было показано, что штамм S.marcescens SBR чувствителен к присутствию в минимальной питательной среде 1-2 мкг/мл триптометоприма, химического вещества антибактериального и противоопухолевого действия. В основе механизма устойчивости к триметоприму лежит его взаимодействие с ферментом дигидрофолатредуктазой, катализирующей восстановление дигидрофолиевой кислоты в тетрагидрофолиевую. Последняя участвует в биосинтезе пуринов и пиримидинов. Как аналог фолиевой кислоты, триметоприм является конкурентным ингибитором фермента. Этим объясняется чувствительность бактериальных штаммов к триметоприму (Escherichia coli, Straphylococcus aureus, Proteus vulgaris). При исследовании некоторых мутантов Escherichia coli, устойчивых к Тр, показано два типа устойчивости. В одном случае устойчивость объясняется повышенным синтезом дигидрофолатредуктазы мутантом по сравнению с диким штаммом, в другом случае - несколько измененными свойствами дигид рофолатредуктазы у мутанта. В результате клонирования структурного гена, кодирующего дигидрофолатредуктазу фага Т4 в плазмидный вектор pBR 322, получена рекомбинант ная плазмидная ДНК pBR 322 frd. В плазмиду pBR 322 интегрирован Hind I фрагмент фага Т4 размером 1,1 тыс. пар оснований, содержащий структурны ген дигидрофолатредуктазы. Введение плазмидной ДНК pBR 322 frd в бактери альные клетки придает им устойчивост к триметоприму. Цель достигнута тем, что вводится новый специфический мар кер в микроорганизм с множественной устойчивостью к традиционным лекарст венным веществам. Это позволяет при вьфащивании S. marcescens SBRTp использовать селективные среды, содержащие Тр. Генетический маркер в составе плазмидной ДНК стабилен - при выращивании в неселективных условиях лишь около 6% клеток S.marcescens, SBRTp за 50 генераций теряют устойчи вость к триметоприму. Это дает возможность следить за штаммом при его хранении, пересевах и больших фермен тациях в промышленном масштабе. Пример. Получение штамма Serratia marcescens ВКМ R-ЗД. Трансформация Serratia marcescens SBR. Кальциевые клетки Serratia marcescens SBR трансформируют ДНК рекомбинантной плазмиды pBR 322 frd, несущей ген дигидрофолат-редуктазы фага Т4 и обеспечивающей устойчивост реципиентных клеток к триметоприму. Трансформированные клетки Serrati marcescens высевают на поверхности агаризованной среды, содержащей, г/л: 1; Na2.HPO 6; KHjPO 3; NaCl 5; MgCla. 7HiO 0,1; CaCla-2HiO 0,015; глюкоза 2,бакто-агар 15, с добавкой триметоприма 10 мкг/мл. Доказательство наличия плазмидной ДНК, обуславливающей устойчивость к триметоприму клеток Serratia marcescens . Методом скрининга выделяют плазмидную ДНК из всех полученных клонов Serratia marcescens ВКМ R-ЗД, растуя их на агаризованной среде с 10 мкг/мл триметоприма. Выделенной ДНК одного из этих клонов трансформи руют клетки Escherichia coli 802 с последующим высевом на селективную среду, содержащую Тр. Рестрикционный анализ полученной плазмидной ДНК с помощью рестриктазы Hind III указывает на наличие в ней фрагмента размером 1,1 тыс. пар оснований, обеспечивающего Тр-устойчивость бактериальных клеток. Проверка стабильности плазмидной ДНК в клетках Serratia marcescens ВКМ R-ЗД. После 50 генераций в неселективных условиях (без добавки триметоприма) не более 6% клеток штамма-продуцента Serratia marcescens ВКМ R-ЗД теряют плазмидную ДНК. Из этих данных следует, что клетки Serratia marcescens ВКМ R-ЗД стабильно сохраняют плазмидную ДНК, обеспечивающую их устойчивость к триметоприму. Культивирование Serratia marces- cens ВКМ R-ЗД. Получение посевного материала.Хра-. нящуюся исходную культуру Serratia marcescens ВКМ R-ЗД рассевают на чашки Петри с агаризованной средой М-9, содержащей 10 мкг/мл триметоприма, и выращивают при в течение 12 ч. Полученную на чашках культуру засевают петлей в пробирки с 10 мл среды М-9, содержащей 1 мкг/мл триметоприма, и вьфащивают при 30°С на качалке в течение 8 ч. Культуру из пробирок переносят в количестве 1 в колбы с 0,5 л среды М-9 с 1 мкг/мл Тр и выращивают при на качалке 12 ч (о.п. 0,9, кювета 0,3 см, ФЭК). Посевной материал в колбах используется для засева ферментера. Культивирование Serratia marcescens ВКМ R-ЗД в ферментере. Количество посевного материала - 3% от объема загруженной среды. Культивирование в ферментере ведут при , подаче воздуха 1,2 объема на 1 объем среды в минуту (90 л/мин), перемешивании 500 об/мин и до оптической плотности суспензии клеток 1,25 ед (кювета 0,3 см, ФЭК). Продолжительность культивирования 5 ч на среде следующего состава,г/л: бакто-пептон 5, дрожжевой экстракт5, 1, глюкоза 2. Вьщеление R. Sma. 1. Фермент вьделяют стандартным методом. Выход фермента из клеток Serratia marcescens БКМ R-ЗД 400 ед на 1 г биомассы.

} 11147006

Рассмотренный пример подчеркиваетфага Т4, обуславливающий устойчивость

основное преимущество предлагаемогоклеток S. marcescens к триметоприму.

штамма-продуцента R.Sma перед исход-Таким образом, при использовании пгтамным штаммом SBR (базовый объект).Онома в качестве продуцента R.Sma в прозаключается в том, что штамм содержит5 мьшшенном производстве значительно

маркерный ген дигидрофолатредуктазыупрощается его отбор и селекция.

Штамм Serratia marcescens BKM R-3D (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) - продуцент эндонуклеазы рестрикции Sma 1.