СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АБСЦИЗОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК A01N63/04 C12P27/00 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к микробному синтезу регуляторов роста растений, а именно фитогормона абсцизовой кислоты (АБК).

АБК представляет собой оптически активный сесквитерпеноид, обладающий высокой физиологической активностью. Она отвечает за такие важные функции жизнедеятельности растений, как обеспечение состояния покоя, регуляция процессов старения и опадения органов, формирование реакций на повреждающее воздействие, в частности защита от водного стресса, осуществление коррелятивного ингибирования (Муромцев Г.С. и др. Регуляторы роста растений-, М. Колос, 1979).

АБК необходимый реактив при проведении научных исследований, а при организации производства АБК в необходимых объемах этот фитогормон может стать важной составной частью технологий возделывания и хранения сельскохозяйственных культур.

Однако, в настоящее время в СССР АБК не производится. За рубежом АБК получают с помощью тонкого химического синтеза, что приводит к образованию рацемической смеси. Поэтому цена 1 мг чистого (99%) физиологически активного цис-транс-изомера очень высока. В то же время микробиологический синтез позволяет избирательно получать активный стереоизомер и производство АБК на его основе может быть значительно эффективнее.

Из литературы известно несколько способов микробиологического синтеза АБК. Наиболее высокие концентрации фитогормона были получены в работах Нормана с соавторами и Токаяма с соавторами.

Способ Токаяма с соавторами (Tokayamo I. et al. Microbial production of a abscisic acid with C. rosicola. Biotechnology letters, 5, 59 62, 1983) состоит в погруженном культивировании гриба Cercospora rosicola на среде, содержащей отвар зерен пшеницы и картофельный бульон, концентрацию которого увеличивали в продолжение всей ферментации за счет подпиток в течение 20 дн при освещении голубым светом. Концентрация АБК при этом способе составляет около 300 мг в л культуральной жидкости. Полное описание способа в СССР отсутствует, в связи с чем невозможно использование его в качестве прототипа. Недостатком способа является длительный 20 сут процесс культивирования.

Способ Нормана (Norman S.M. et al. "Development of a defined medium for growth of a C. rosicola Passerini. Appl. and Environ. microbial. 41, 1, 334 336, 1981) заключается в выращивании гриба Cercospora rosicola Pass. на среде, содержащей, в мас.

Глюкоза 2,0
Глюконат натрия (или аспарагин) 0,30
KH₂PO₄ 0,08
KCl 0,05
MgSO₄ 0,02
CaCl₂ H₂O 0,001
Тиамин 0,000001
и 1 мл раствора смеси микроэлементов, в г на 100 мл воды:
FeSO₄•7H₂O 0,05
MnCl₂ 0,033
ZnSO₄ 0,25
CuSO₄•4H₂O 0,4
H₃BO₃ 0,00005
в течение 14 дн в колбах на качалке. Концентрация АБК достигает 30 мг/л. Этот способ был выбран нами в качестве прототипа. К его недостаткам следует отнести низкое содержание целевого продукта и использование в питательной среде дорогостоящих и дефицитных аминокислот в качестве источников азота.

Целью изобретения является увеличение выхода и удешевление целевого продукта, сокращение длительности процесса его получения.

Поставленная цель достигается с помощью предлагаемого микробиологического способа получения АБК, который заключается в глубинном культивировании гриба Cercospora sp. F-444 в питательной среде следующего состава, в мас.

Растительное масло 1,5 2,5
Или глицерин 2,0 3,0
Пептон (или гидролизат белка) 0,8 1,2
KH₂PO₄ 0,2
MgSO₄ 0,02
K₂SO₄ 0,02
и 1 мл смеси микроэлементов, в г на 100 мл воды:
Fe₂SO₄•7H₂O 0,05
MnCl₂ 0,033
ZnSO₄ 0,25
CuSO₄•4H₂O 0,4
H₃BO₃ 0,00005
в течение 7 сут при контролируемом температурном режиме, обеспечивающем 25^oC в первые 90 96 ч ферментации, 28^oC в последующие 70 76 ч.

Гриб культивируют в колбах на ротационной качалке (240 об/мин). Содержание АБК в культуральной жидкости составляет 150 210 мг/л. Штамм-продуцент Cercospora sp. F-444, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов от 16.04.90 (заявка "Штамм гриба Cercospora sp F-444 продуцент фитогормона абсцизовой кислоты", поданная одновременно). Штамм утилизирует широкий набор источников углерода и азота (глюкоза, сахароза, крахмал, маннит, растительные масла, отвар картофеля, солодовое сусло, дрожжевой и кукурузный экстракты, пептон, соевая мука, нитраты аммония, калия и натрия). Гриб растет на средах с широким диапазоном значений pH от 3,5 до 8,0. Интенсивный вегетативный рост обеспечивают температуры 23^o - 28^oC. При выращивании на плотных средах гриб образует бархатистые колонии с прямыми, короткими воздушными гифами, образующими плотный слой. Цвет воздушных гиф от белого до коричнево-зеленого. Отмечены случаи выделения в среду темно-зеленого пигмента. Спороношение отсутствует. В глубинной культуре растет в виде пеллет.

Предлагаемый способ получения АБК обеспечивает значительное содержание фитогормона в культуральной жидкости при сокращении длительности процесса культивирования.

Удешевление целевого продукта достигается за счет
увеличения концентрации АБК в культуральной жидкости до 150 210 мг/л;
сокращения длительности процесса ферментации до 7 8 сут;
исключения из питательной среды дорогостоящих и дефицитных аминокислот.

Поскольку в литературе не описано использования указанного штамма и питательной среды для получения АБК длительное хранение гриба Cercospora sp. F-444 осуществляется на разбавленном в 3 раза картофельно-глюкозном агаре, агаризованном на разбавленном пивном сусле (7 Б) и на агаризованной разбавленной среде Чапека с добавлением кукурузного экстракта при ограниченном доступе воздуха и температуре 5^oC. Для вегетативного размножения культуру гриба выращивают на скошенном картофельно-глюкозном агаре или агаризованном пивном сусле в течение 20 -26 дн при температуре 26^oC. Мицелиальную суспензию гриба в стерильной воде вносят в модифицированную жидкую посевную среду Нормана. Режим стерилизации 0,5 доб. атм. в течение 20 мин. Жидкий посевной материала выращивают в течение 6 7 дн в колбах на ротационной качалке (240 об/мин) при 25^oC. Затем его используют для инокуляции колб с ферментационной средой в количестве 1/10 объема среды. Состав ферментационной среды, в мас.

Растительное масло 1,5 2,5
Или глицерин 2,0 3,0
Пептон (или гидролизат белка) 0,8 1,2
KH₂PO₄ 0,2
MgSO₄ 0,02
K₂SO₄ 0,02
и 1 мл смеси микроэлементов. Ферментацию проводят на качалке (240 об/мин) в течение 7 дн, первые 90 96 ч при 25^oC, далее при 28^oC. Содержание АБК в культуральной жидкости определяли с помощью спектрофотометрического метода, описанного в приведенной выше работе Нормана.

Пример 1. Гриб Cercospora sp. F-444 выращивали на скошенном агаризованном пивном сусле в течение 20 дн. В качестве посевной среды использовали среду на основе глюкозы и аспарагина.

Ее состав, в мас.

Глюкоза 2,0
Аспарагин 0,14
KH₂PO₄ 0,08
MgSO₄ 0,02
K₂SO₄ 0,02
Тиамин 0,000001
и 1 мл смеси микроэлементов. После 7 сут выращивания посевной материал инокулировали в колбы с ферментационной средой следующего состава, в мас.

Растительное масло 1,5
Соевый пептон 0,8
KH₂PO₄ 0,2
MgSO₄ 0,02
K₂SO₄ 0,02
и 1 мл смеси микроэлементов. Температура оставалась 25^oC. Длительность ферментации 7 дн. В данных условиях содержание АБК в культуральной жидкости составило 170 мг/л.

Пример 2. Условия культивирования продуцента соответствовали приведенным в примере 1. Возраст культуры на агаризованной среде 22 дн, возраст посевного на среде с глюкозой и на аспарагине 6 дн. Длительность ферментации 7 дн.

Состав ферментационной среды, в мас.

Растительное масло 2,5
Казеиновый гидролизат белка 1,0
KH₂PO₄ 0,2
MgSO₄ 0,02
K₂SO₄ 0,02
и 1 мл смеси микроэлементов. Казеиновый гидролизат белка получают путем гидролиза молочной сыворотки. Температура оставалась 25^oC. Концентрация АБК составила 190 мг на 1 л культуральной жидкости.

Пример 3. В приведенных выше условиях возраст культуры на агаризованной среде 20 дн. Возраст посевного 8 дн.

Состав ферментационной среды, в мас.

Подсолнечное масло 2,0
Соевый пептон 1,2
KH₂PO₄ 0,2
MgSO₄ 0,02;
K₂SO₄ 0,02
и 1 мл смеси микроэлементов. Длительность ферментации 7 дн, температурный режим: первые 90 ч при 25^oC, далее при 28^o В приведенных условиях концентрация фитогормона в культуральной жидкости составила 200 мг/л.

Пример 4. Условия культивирования гриба Cercospora sp. F-444 аналогичны примерам 1 3.

Состав ферментационной среды, в мас.

Подсолнечное масло 2,0
соевый пептон 1,0
KH₂PO₄ 0,2
MgSO₄ 0,02
K₂SO₄ 0,02
и 1 мл смеси микроэлементов. Температурный режим аналогичен описанному в примере 3. Концентрация АБК в этих условиях достигает 210 мг/л.

Пример 5. Культуру гриба выращивали на скошенном картофельно-глюкозном агаре в течение 22 дн при температуре 26^oC. Затем мицелиальную суспензию вносили в колбы с жидкой посевной средой, описанной в примере 1 и выращивали посевной материал в течение 8 дн. В качестве ферментационной среды использовали среду на основе глицерина.

Ее состав, в мас.

Глицерин 2,0
Пептон 1,0
KH₂PO₄ 0,2
MgSO₄ 0,02
K₂SO₄ 0,02
и 1 мл смеси микроэлементов. Длительность ферментации 7 дн, температурный режим аналогичен примерам 3, 4. Концентрация АБК 150 мг/л.

Пример 6 (сравнительный). Как и в предыдущих примерах, использовали штамм Cercospora sp. F-444, способ соответствовал предложенному Норманом с соавторами. Гриб выращивали на скошенном картофельно-глюкозном агаре в течение 20 дн при температуре 26^oC. Затем мицелиальную суспензию вносили в среду на основе глюкозы и аспарагина, описанную выше. Ферментацию проводили в течение 14 дн при 25^oC. При использовании этого способа выход продукта составил 120 мг АБК в 1 л культуральной жидкости.

Пример 7 (сравнительный). Условия культивирования гриба Cercospora sp. F-444 соответствовали условиям, приведенным в примере 1. Длительность ферментации и ферментационная среда также соответствовали примеру 1. Температурный режим ферментации: первые 96 ч при 25^oC, затем при 28^oC. Концентрация фитогормона при этом повышалась до 160 мг/л.

Предлагаемый способ получения АБК имеет следующие преимущества перед известными способами:
1) значительное увеличение и стабильность выхода целевого продукта и ускорение ферментационного процесса за счет оригинальной рецептуры ферментационной среды, позволяющей реализовать генетический потенциал штамма, и оптимального температурного режима процесса ферментации;
2) исключение из состава питательной среды дорогих и дефицитных аминокислот;
3) удешевление целевого продукта за счет увеличения его выхода и ускорения процесса ферментации.

Указанные преимущества позволяют считать, что предлагаемый способ соответствует критериям изобретения "существенные отличия" и "полезный эффект".

Предлагаемый способ может служит основой для получения АБК в промышленных условиях.

Использование: микробиологиеская промышленность, производство регуляторов роста, в частности абсцизовой кислоты (АБК). Сущность изобретения: АБК получают путем глубинного культивирования микромицета Cercospora sp F-444 на питательной среде, содержащей (мас. %): растительное масло 1,5 - 2,5 или глицерин 2,0 - 3,0, пептон или гидролизат белка 0,8 - 1,2, фосфорнокислый калий 0,2, сернокислый магний 0,02, сернокислый калий 0,02, а раствор микроэлементов культивируют в течение 7 сут, причем первые 90 - 96 ч культивируют при температуре 25^oС, а последующие при 28^oC.

Способ получения абсцизовой кислоты путем глубинного культивирования микромицета рода Cercospora на питательной среде, содержащей источники азота, углерода, однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний и раствор микроэлементов, содержащий в 100 л воды 0,05 г сернокислого железа, 0,033 г хлористого марганца, 0,25 г сернокислого цинка, 0,74 г сернокислой меди, 0,00005 г борной кислоты, отличающийся тем, что из микромицетов рода Cercospora используют штамм Cercospora sp. F-444, в среду дополнительно вносят 0,02 мас. сернокислого калия, в качестве источника углерода используют растительное масло или глицерин в количестве, соответственно равном 1,5 2,0, 2,0 3,0 мас. в качестве источника азота пептон или гидролизат белка в количестве 0,8 1,2 мас. а фосфорнокислый однозамещенный калий вносят в количестве 0,2 мас. культивирование осуществляют в течение 7 сут, при этом в первые 90 96 ч при температуре 25^oС, а в последующие при 28^oС.