СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ МАНИФЕСТНОЙ ИЛИ СТЕРТОЙ ФОРМЫ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ОБЕЗЬЯН И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для диагностики хламидийной инфекции человека и обезьян.

Хламидии являются широко распространенной группой внутриклеточных облигатных паразитов, вызывающих заболевания человека и животных. Среди возбудителей хламидиозов в настоящее время особо важное значение для медицины представляет Chlamydia trachomatis, вызывающая различные инфекционные заболевания, в том числе инфекции урогенитального тракта, трахому, венерическую лимфогранулему, воспалительные заболевания лимфаденоидного кольца глотки, инфекционную патологию органов дыхания и конъюнктивы новорожденных.

Для информативного исследования клиники, патогенеза и лечения хламидийных инфекций необходимо использование оптимальной экспериментальной модели. Такой моделью могут быть обезьяны как более близкие к человеку животные по эволюционной лестнице. Известно экспериментальное заражение данных животных хламидиями, выделенными от человека (Patton D.L., Cosgrove Y.T., Kuo Cho-Chou, Campbell L.A. Effects of quinolone analog CI-960 in a monkey model of Chlamydia trachomatis salpingitis. // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 1993. - Vol.37, N 1. - P.8-13). Однако до наших исследований не было известно о наличии у обезьян собственной хламидийной инфекции. В связи с этим для исключения ложных результатов экспериментального изучения хламидийной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis, мы провели исследования по выявлению у видов обезьян, перспективных для использования в качестве модели для изучения хламидиоза, собственной хламидийной инфекции, вызванной этим видом хламидий. В результате проведенных нами исследований было установлено, что у обезьян существуют собственные заболевания урогенитального тракта, органов дыхания и органов зрения, вызванные Chlamydia trachomatis. Известно, что у человека инфекции, вызванные Chlamydia trachomatis, могут протекать в виде манифестных или стертых форм, и это требует как можно более раннего выбора соответствующих форме инфекции оптимальных вариантов лечения (Интерфероновый статус, препараты интерферона в лечении и профилактике инфекционных заболеваний и реабилитации больных. / Под редакцией С.С.Афанасьева, Г.Г.Онищенко, В.А.Алешкина, Л.В.Феклисовой, М.С.Афанасьева, А.В.Алешкина. - М.: «Триада-Х». - 2005. - С.421-465; RU патент №2222018, 2004.01.20, G01N 33/53). При динамичных наблюдениях нами было установлено, что у обезьян свежие и хронические инфекции, вызванные Chlamydia trachomatis, так же как и у человека могут протекать в виде преимущественно манифестных или преимущественно стертых форм (термин «преимущественная форма» использован для обозначения той формы инфекции, которая чаще наблюдалась при динамичном обследовании конкретного животного).

Поэтому нами был разработан способ на основе наиболее чувствительного метода выявления хламидий - полимеразной цепной реакции (ПЦР), обеспечивающий при хламидиозе, вызванном Chlamydia trachomatis, и у человека, и у обезьян ранний выбор соответствующих формам хламидийной инфекции оптимальных вариантов лечения благодаря возможности дифференцированного прогнозирования как манифестных, так и стертых форм хламидийной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis.

Известен способ диагностики хронического урогенитального хламидиоза путем оценки показателей резистентности к хламидийной инфекции, заключающийся в том, что дополнительно определяют в соскобном материале из уретры с использованием ПЦР в реальном времени уровни экспрессии TL-рецептора-2 и TL-рецептора-4 и диагностируют хронический урогенитальный хламидиоз при уровнях экспрессии в соскобном материале из уретры TL-рецептора-2 не более 5 единиц и TL-рецептора-4 не более 5 единиц (RU патент №2327995, 2008.06.27, G01N 33/569, C12Q 1/68).

Недостатком данного способа является то, что он не может быть использован для дифференцированного прогнозирования манифестных и стертых форм хламидийной инфекции как у человека, так и у обезьян, в связи с отсутствием определения комбинаций нуклеотидных последовательностей Chlamydia trachomatis, типичных для изолятов возбудителя, вызывающих манифестные или стертые формы хламидийной инфекции.

Известно, что экспрессия 16S рибосомальной РНК обычно связана с клинически активным течением хламидиоза у больного трахомой. Обнаружение гена omp1 ДНК реже связано с активным течением данного хламидиоза (Burton M.J., Holland M.J., Jeffries D., Mabey D.C.W., Bailey R.L. Conjunctival chlamydial 16S ribosomal RNA expression in trachoma: is chlamydial metabolic activity required for disease to develop? // Clinical Infectious Diseases. - 2006. - Vol.42, N 4. - P.463-470).

Однако по нашим данным гены 16S рибосомальной РНК выявляются в большинстве случаев клинических проявлений хламидийной инфекции у человека и обезьян вне связи с формой заболевания, что не позволяет использовать их идентификацию для дифференцированного прогнозирования манифестных или стертых форм хламидийной инфекции человека или обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis.

Известен способ диагностики манифестной и латентной форм хронического урогенитального хламидиоза у мужчин путем определения ДНК Chlamydia trachomatis, специфических иммуноглобулинов (G, А) к Chlamydia trachomatis и оценки очагов хронического инфекционного процесса, который при наличии отрицательных подтверждающих тестов на хламидии у мужчины (ПЦР и IgA) дополняют определением ДНК Chlamydia trachomatis, специфических иммуноглобулинов (G, А) к Chlamydia trachomatis и очагов хронического инфекционного процесса у женщины, с которой ведутся постоянные половые контакты (не менее 3 месяцев) без барьерных методов защиты, и при положительном ПЦР-тесте и/или наличии иммуноглобулинов класса А к Chlamydia trachomatis в крови, а также при наличии или отсутствии одного или нескольких хронических очагов определяют у женщины манифестную или латентную форму хронического урогенитального хламидиоза, у мужчины при этом и при условии наличия одного или нескольких хронических очагов инфекции и диагностического титра иммуноглобулинов G диагностируют манифестную форму урогенитального хламидиоза, а при отсутствии у мужчины клинических и лабораторных признаков инфекции диагностируют латентную форму (RU патент №2222018, 2004.01.20, G01N 33/53).

Недостатком данного способа также является то, что он не может быть использован для дифференцированного прогнозирования манифестных и стертых форм хламидийной инфекции как у человека, так и у обезьян, в связи с отсутствием определения комбинаций нуклеотидных последовательностей Chlamydia trachomatis, типичных для изолятов возбудителя, вызывающих манифестные или стертые формы хламидийной инфекции. Кроме того, он является сложным в связи с большим перечнем используемых вариантов лабораторных методов.

Известен способ диагностики персистентной или хронической инфекции у пациента, вызванной микроорганизмом семейства Chlamydiaceae, включающий детекцию в биологическом образце, полученном от пациента, относительно литической фазы цикла развития хламидий, изменение уровня и/или функциональной активности продукта экспрессии гена, выбранного из руk, nlpd, CpnO585, или гена, принадлежащего тому же регулирующему или биосинтетическому пути как руk, nlpd, CpnO585, ompA, oynpB, hsp60 или как гена, вовлеченного в биосинтез ЛПС, или варианта вышеуказанного гена.

Согласно известному способу для анализа экспрессии генов проводят ПЦР или ПЦР в реальном времени как вариант с использованием праймеров, специфичных для Chlamydophila pneumoniae:

Ct16S-F2 5'-GGATTTATTGGGCGTAAAGG

Ct16S-R 5'-TCCACATCAAGTATGCATCG

CpnompA-F 5'-GCTGCAAACTATACTACTGC

CpnompA-R 5'-GAAAACATCAAAGCGATCCC

CpnompB-F 5'-GTGATGGGAAATTAGTCTGG

CpnompB-R 5'-ATCCTGTGTTCACTACTTCG

CpnomcB-F 5'-AGCAGAAGTTTACTCTGTCG

CpnomcB-R 5'-CTACTGATGGAAACCTAAGC

Cpn76kDa-F 5'-AAGATATCAAGGCTACTGATGAGGAAACCG

Cpn76kDa-R 5'-TTGATATCTAGAACTTGCTGCAGCGGGA

Cpnpmp1-F 5'-GACTACTGCTATAGGTAAGG

Cpnpmp1-R 5'-GAGATGCTAAGTTTCCTAGC

Cpng1tX-F 5'-TCTCTTTCGTCCATTGATCG

Cpng1tX-R 5'-CTCAGGATTGTTAGAGTACC

Cpnhsp60B-F 5'-GTCCAGTGAAATCATGGCCG

Cpnhsp60AI-5'-CCCATGTTTTCATGTTTGTC

CpnyaeT-F 5'-TCAGGAAATCAAGTCGTTCC

CpnyaeT-R 5'-AGATTCCTGAGAACGTAAGC

Cpnpyk-F 5'-TGTTGTTGTCTCTTCAGAGG

Cpnpyk-R 5'-CTACCCCAAACTTAAGATCC

Cpnn1pD-F 5'-TCAATGATCTTACCACCACC

Cpnn1pD-R 5'-GTTACGCAATGCTATTGTCC

Cpn0585-F 5'-TGCATCTTATCAAGAGCTCG

Cpn0585-R 5'-GAAGTTAGCGGATTTAGAGG

Cpn1046-F 5'-GAGGAGAACTGATAAGAACG

Cpn1046-R 5'-CTTAACTCCTGATCTCATCC.

Для измерения концентрации полипептида - продукта экспрессии вышеуказанных генов, биологический образец смешивают с антигенсвязывающими молекулами, специфически взаимодействующими с данным полипептидом, измеряют концентрацию комплекса, включающего полипептид и антигенсвязывающую молекулу и по концентрации комплекса определяют концентрацию полипептида в исследуемом образце. Для определения уровня продукта экспрессии вышеуказанных генов биологический образец можно также смешивать с антигеном, соответствующим, по крайней мере, части полипептида, закодированного геном. В этом случае определяют уровень антиген-специфической пролиферации Т-лимфоцитов. Диагностически значимым является 10%-ное изменение уровня и/или функциональной активности продукта экспрессии гена (WO патент №02/14516, 2002.02.21, C12N 15/30).

Основными недостатками известного способа диагностики персистентной или хронической инфекции являются следующие:

- известный способ не может быть использован для дифференцированного прогнозирования манифестных и стертых форм хламидийной инфекции как у человека, так и у обезьян, в связи с отсутствием определения комбинаций нуклеотидных последовательностей Chlamydia trachomatis, типичных для изолятов возбудителя, вызывающих манифестные или стертые формы хламидийной инфекции;

- известный способ является сложным в связи с большим перечнем используемых вариантов лабораторных методов;

- последовательность используемых в известном способе праймеров и их кинетика не позволяет осуществлять мультиплексную детекцию экспрессии разных генов, что дополнительно усложняет способ в связи с раздельным проведением ПЦР для выявления экспрессии каждого гена.

В основу изобретения положена задача обеспечения расширения возможности использования ПЦР для прогнозирования как манифестных, так и стертых форм хламидийной инфекции и у человека, и у обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis, при упрощении способа диагностики хламидийной инфекции.

Задача решена тем, что для прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis, после выделения ДНК из клинического материала или культуры клеток, зараженной хламидиями, выделенными из клинического материала, проводят мультиплексную ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3' и затем электрофоретический анализ продуктов амплификации и прогнозируют: манифестную форму хламидийной инфекции человека или обезьян при положительной ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'- AATCAATGCCCGGGATTGGT-3'; стертую форму хламидийной инфекции человека или обезьян при положительной ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3' и отрицательной ПЦР с праймерами PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3'. Набор для осуществления заявляемого способа содержит праймеры Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'- AATCAATGCCCGGGATTGGT-3', термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль, отрицательный контроль, воск и масло для проведения ПЦР.

Проведенные нами исследования позволили разработать сочетание двух новых пар праймеров (Ctr и R, PLf и PLr), специфичных для Chlamydia trachomatis, пригодных для использования в мультиплексной ПЦР, обеспечивающих расширение возможности использования ПЦР для дифференцированного прогнозирования как манифестных, так и стертых форм хламидийной инфекции и у человека, и у обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis, при упрощении способа диагностики хламидийной инфекции.

Заявляемый способ прогнозирования формы хламидийной инфекции является новым и в литературе не описан.

Техническим результатом заявляемого изобретения является обеспечение расширения возможности использования ПЦР для прогнозирования как манифестных, так и стертых форм хламидийной инфекции и у человека, и у обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis, при упрощении способа диагностики хламидийной инфекции за счет сочетания двух новых пар праймеров (Ctr и R, PLf и PLr), специфичных для Chlamydia trachomatis, пригодных для использования в мультиплексной ПЦР.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих при использовании заявляемого способа прогнозирования формы хламидийной инфекции и заявляемого набора для его осуществления обеспечение прогнозирования как манифестных, так и стертых форм хламидийной инфекции и у человека, и у обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis, при упрощении способа диагностики хламидийной инфекции.

Пример 1. 19 обезьян вида Макак резус и вида Макак яванский обоего пола, в возрасте от 5 до 10 лет, с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта.

Первоначально выделяли ДНК из соскобного материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки, уретры животных. Затем проводили мультиплексную ПЦР с использованием набора для прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis, содержащего праймеры: Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3', термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль, отрицательный контроль, воск и масло для проведения ПЦР, с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации.

В результате проведенного исследования у 8 обезьян была установлена положительная ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3'. На основании результатов ПЦР у данных обезьян была спрогнозирована манифестная форма хламидийной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis, что было подтверждено при их последующих клинико-лабораторных обследованиях.

У остальных 11 обезьян была установлена положительная ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3'. На основании результатов ПЦР у данных обезьян была спрогнозирована стертая форма хламидийной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis, что было подтверждено при их последующих клинико-лабораторных обследованиях.

Пример 2. Пациент С., возраст 19 лет. Клинический диагноз - уретрит.

Первоначально выделяли ДНК из культуры клеток, зараженной соскобным материалом со слизистой оболочки уретры пациента. Затем проводили мультиплексную ПЦР с использованием набора для прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis, содержащего праймеры: Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3', термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль, отрицательный контроль, воск и масло для проведения ПЦР, с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCАТСС-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3'. На основании результатов ПЦР у обследуемого пациента была спрогнозирована манифестная форма хламидийной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis, что было подтверждено при последующих клинико-лабораторных обследованиях.

Пример 3. Пациентка А., возраст 28 лет. Обратилась в диагностический центр с жалобами на отсутствие возникновения беременности. Клинический диагноз - бесплодие.

Первоначально выделяли ДНК из соскобного материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки пациентки. Затем проводили мультиплексную ПЦР с использованием набора для прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis, содержащего праймеры: Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCАТСС-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3', термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль, отрицательный контроль, воск и масло для проведения ПЦР, с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3'. На основании результатов ПЦР у обследуемой пациентки была спрогнозирована стертая форма хламидийной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis, что было подтверждено при последующих клинико-лабораторных обследованиях.

Таким образом, приведенные примеры доказывают возможность применения заявляемого способа для прогнозирования как манифестной, так и стертой формы хламидийной инфекции и у человека, и у обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis, при использовании только двух пар праймеров, что расширяет возможность использования ПЦР для прогнозирования формы хламидийной инфекции при упрощении способа.

Изобретение относится к медицине и биологии. Выделяют ДНК из клинического материала или культуры клеток, зараженной хламидиями, выделенными из клинического материала. Проводят мультиплексную ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3'. Затем проводят электрофоретический анализ продуктов амплификации и прогнозируют: манифестную форму хламидийной инфекции человека или обезьян при положительной ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGC АТСС-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3'; стертую форму хламидийной инфекции человека или обезьян при положительной ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3' и отрицательной ПЦР с праймерами PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3'. Изобретение может быть использовано для диагностики хламидийной инфекции человека и обезьян, для прогнозирования как манифестной, так и стертой формы хламидийной инфекции и у человека, и у обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis, при упрощении способа диагностики хламидийной инфекции. 2 н.п. ф-лы.

1. Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis, характеризующийся тем, что после выделения ДНК из клинического материала или культуры клеток, зараженной хламидиями, выделенными из клинического материала, проводят мультиплексную ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3' и затем электрофоретический анализ продуктов амплификации и прогнозируют:
манифестную форму хламидийной инфекции человека или обезьян при положительной ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3'; стертую форму хламидийной инфекции человека или обезьян при положительной ПНР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-31, R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3' и отрицательной ПЦР с праймерами PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3'.

2. Набор для прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян, вызванной Chlamydia trachomatis, характеризующийся тем, что он содержит праймеры Ctr 5'-TGGCGAT ATTTGGGC АТСС-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', PLf 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' и PLr 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3', термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль, отрицательный контроль, воск и масло для проведения ПЦР.