СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОСУСПЕНЗИИ БЕТУЛИНА И/ИЛИ ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ Российский патент 2010 года по МПК A61K36/185 A61K31/15 

Изобретение относится к области прикладной биотехнологии, а именно к способам получения нанопрепаратов для коррекции лечения и профилактики заболеваний и патологических состояний человека и животных, а также в качестве биологически активной добавки к пище и обогащения продуктов питания.

Известны способы получения препаратов путем диспергирования компонентов в растворителе и последующего получения липосом. Для этого фосфолипиды диспергируют в водной среде, содержащей лекарственные вещества. В результате интенсивного перемешивания образуются многослойные липосомы с включенным во внутренний объем лекарственным веществом. Размер липосом можно уменьшить путем обработки раствора ультразвуком (RU 2153328).

При использовании способа диспергирования с помощью растворителя фосфолипиды растворяют в органическом растворителе, которые затем вливают в водную фазу, содержащую лекарственный препарат. При перемешивании он включается в структуру липосом, а растворитель затем удаляют отгонкой.

Например, смешение в определенных количествах спиртового раствора фосфатидилхолина, хлороформенного раствора холестерина и витамина Е, с последующим формированием пленки липидов на стенках круглодонной колбы, путем упаривания органических растворителей в вакууме при температуре не выше 40°С. Затем водным раствором лекарства (цитарабина) диспергируют липидную пленку путем встряхивания колбы в течение 15 мин. В ходе процесса образуется дисперсия липосом, содержащих лекарственные средства (RU 2068262).

Недостатком данных способов является получение нестабильных водных или водно-спиртовых дисперсий липосомальных препаратов, которые должны быть стабилизированы с помощью дополнительных процессов лиофилизации или распылительной сушки.

Известен способ получения лекарственных препаратов путем приготовления при смешивании лекарственного средства или биологически активного вещества, фосфолипидов, органического растворителя, порошкообразного наполнителя в одной емкости с последующим удаления растворителя в условиях пониженного давления (вакуума) при постоянном перемешивании (RU 2130771).

Недостатком способа получения липосом является получение эмульсий с размером липосом от 1 до 15 мкм. После высушивания эмульсии под вакуумом образуется агломерированный порошок с размером частиц от 100 до 500 мкм, который при диспергировании в воде образует липосомальный препарат с размером от 50 до 300 мкм.

Такие крупные частицы сохраняют биологическую активность введенных в них препаратов на уровне исходных лекарственных средств.

Основной недостаток липосом как лекарственной формы - относительная небольшая стабильность при хранении. Этого недостатка лишены полимерные наночастицы, имеющие практически те же области возможного применения. Но в отличие от липосом полимерные наночастицы состоят из менее безопасного материала, чем фосфолипиды.

Основной объект воздействия современной фармакологии - это клетки с размером 1-5 мкм, потому необходимо, чтобы доставляемые к ним лекарства были соизмеримы по размеру с порами капилляров. Чтобы избежать эмболии - закупорки капилляров гидрофобные биологически активные вещества должны обладать этими размерами. Диаметр эритроцитов, которые свободно проходят через любые сосуды, - 7 мкм. С учетом их деформируемости (с запасом) считается, что безопасными могут быть дисперсии с размером частиц менее 1 мкм, то есть нанодиапазона, т.к. при переходе к этим размерам лекарственный препарат приобретает качественно новые свойства.

В основе прицельной доставки нанопрепаратов к мишеням лежат два основных механизма. Во-первых, они обладают свойством пассивного нацеливания: в районе воспаления в капиллярах расширяются поры, и нанолекарства проходят как раз через эти поры, то есть, попадают именно туда, куда нужно. Второй вариант - это активный транспорт, который реализуется присоединением к наночастице "молекулярного адреса" к рецепторам на мембранах клеток-мишеней. Для этих целей наночастица включается в липосомный лекарственный препарат на стадии их приготовления. В липосомном виде увеличивается растворимость многих лекарственных веществ, что крайне важно для их действия. Уменьшается токсичность, поскольку действующее вещество защищено липосомной оболочкой. Поэтому лекарственный препарат действует только тогда, когда достигает клетки-мишени, никак не раньше, и по пути не деградирует, а доходит в активной форме. Все это позволяет снизить эффективную дозу лекарства и значительно уменьшить негативные эффекты.

Известно, что бетулиновая кислота, действующая против меланомы, в липосомной форме существенно повышает ее растворимость, а еще лучше она растворяется в форме нанокристаллов. Наночастицы бетулиновой кислоты проникают в клетки меланомы, предположительно, по механизму эндоцитоза.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому способу является изобретение по патенту RU 2322091.

Пентациклические тритерпеновые соединения лупанового ряда - бетулин и его производные, получаемые в виде экстракта березовой коры, обладают широким набором биологических и терапевтических активностей: антиоксидантной, иммуномодулирующей, антимутагенной и пр. Сущность изобретения состоит в том, что из продуктов экстракции бересты были изготовлены наночастицы, которые приемлемы для внутрисосудистого введения.

Для этого смесь, состоящую из бетулина, лупеола, 3-O-кофеат бетулина растворяют в органическом растворителе (тетрагидрофуран, ацетон, диоксан) при концентрации 2,5-5 г/л. Затем к раствору добавляют воду при соотношении 1:25. Процесс удаления растворителя и основной части воды ведут при температуре, близкой к 0°С, на роторном испарителе под вакуумом. При этом получены наночастицы бетулина с размером частиц от 90 до 220 нм при концентрации 1,5 мг/мл или 0,15 г/100 мл, т.е. 0,15% в количествах нескольких миллилитров.

Недостатком данного способа является его непригодность для промышленного применения - авторами получены лишь лабораторные количества с низкой концентрацией наночастиц.

Для приготовления суспензий лекарственных препаратов, биологически активных добавок и продуктов питания (в т.ч. функциональных или обогащенных) на основе бетулина или его производных с размером частиц меньше 1 мкм (1000 нм), обладающих повышенной биологической активностью, предлагается новый способ. Сущность его сводится к тому, что гидрофобные субстанции бетулина или его производных первоначально растворяются в органическом растворителе (растворяющемся или не растворяющемся в воде или масле) в количестве от 0,001 до 10% с последующим смешиванием и гомогенизацией этого раствора с пищевым маслом или водным раствором поверхностно-активного вещества в рабочем органе коллоидной мельницы при интенсивном перемешивании и дальнейшем удалении растворителя при его кипении. В качестве масел используются пищевые масла: растительное (подсолнечное, кукурузное, оливковое, арахисовое, льняное, хлопковое, рапсовое, соевое, кунжутное конопляное, оливковое, тыквенное, масло виноградных косточек и другие) или рыбий жир, минеральное масло (Е905а), полидиметилсилоксановое масло (Е900) и смеси из них.

Применение пищевого масла (растительное, минеральное, силиконовое) способствует лучшему распределению порошкообразного бетулина или его производных и получению однородной наносуспензии. Кроме того, наличие пищевого масла способствует лучшей усвояемости бетулина.

Для этого масло или водный раствор поверхностно-активного вещества с температурой 40-95°С в зависимости от температуры кипения выбранного растворителя и органический раствор бетулина или его производного пропускаются в циклическом режиме через рабочий орган коллоидной мельницы при скорости вращения ротора от 1,5 до 28 тысяч оборотов в минуту. Образующиеся при этом капли и пузырьки вскипевшего растворителя разбиваются роторами коллоидной мельницы до микроразмеров. Вскипевший растворитель удаляется, а твердые частицы растворенного вещества выпадают в виде микросуспензии с размером частиц менее 1 микрона, т.е. наноразмеров. Поверхностно-активные вещества в количестве от 0,1 до 40 мас.% вводятся для предотвращения коагуляции образующихся наночастиц при длительном хранении.

Получаемые наносуспензии бетулина или его производных могут быть использованы как основа для приготовления гелей для душа, кондиционеров и шампуней для волос, а также в производстве жидкого мыла.

Размер наночастиц оценивался с помощью лазерного спектрофотометра марки ЛКС-03. Результаты испытаний по приведенным примерам представлены ниже. См. фиг.1-12.

Отличительной особенностью предлагаемой заявки является получение стабильных суспензий наноматериалов на основе бетулина или его производных. Техническим решением заявляемого изобретения является легкое масштабирование технологического процесса от лабораторного до промышленного.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Раствор бетулина 2,5 г в 50 г этилового спирта совмещают при перемешивании с 0,5 л горячей воды в присутствии 5 г ТВИН20 (Е432) (ПАВ 1%), которая циркулирует через коллоидную мельницу с температурой 80-95°С при скорости вращения ротора 25000 об/мин. Раствор бетулина разбивается на мелкие капли, спирт вскипает и его основная масса отгоняется при перемешивании. Оставшийся спирт отгоняется из наносуспензии под вакуумом. Получается 0,5% наносуспензия бетулина в воде с размером частиц от 750 до 1100 нм.

Пример 2

Раствор бетулина 2,5 г в 50 г этилового спирта совмещают при перемешивании с 0,25 л минерального масла, которое циркулирует через коллоидную мельницу с температурой 80-95°С при скорости вращения ротора 25000 об/мин. Раствор бетулина разбивается на мелкие капли, спирт вскипает и его основная масса отгоняется при перемешивании. Оставшийся спирт отгоняется из наносуспензии под вакуумом. Получается 1,0% наносуспензия бетулина в масле с размером частиц от 100 до 300 и от 750 до 1100 нм.

Пример 3

Раствор бетулиновой кислоты 1 г в 75 г этилового спирта совмещают при перемешивании с 0,25 л горячей воды в присутствии 2 г ТВИН80 (Е433) (ПАВ 0,8%), которая циркулирует через коллоидную мельницу с температурой 80-95°С при скорости вращения ротора 20000 об/мин, с температурой 70-95°С. Раствор бетулиновой кислоты разбивается на мелкие капли, спирт вскипает и его основная масса отгоняется при перемешивании. Оставшийся спирт отгоняется из наносуспензии под вакуумом. Получается 0,4% наносуспензия бетулиновой кислоты с размером частиц от 900 до 1100 нм.

Пример 4

Раствор дистеарата бетулина 5 г в 100 г метиленхлорида совмещают при перемешивании с 0,1 л воды в присутствии 0,1 г сорбитана тристеарата (Е492) (ПАВ 0,1%), которая циркулирует через коллоидную мельницу с температурой 40-55°С при скорости вращения ротора 21000 об/мин. Раствор дистеарата бетулина разбивается на мелкие капли, метиленхлорид вскипает и его основная масса отгоняется при перемешивании. Оставшийся метиленхлорид отгоняется из наносуспензии под вакуумом. Получается 5% наносуспензия дистеарата бетулина с размером частиц от 100 до 300 нм.

Пример 5

Раствор дистеарата бетулина 10 г в 200 г метиленхлорида совмещают при перемешивании с 0,25 л полидиметилсилоксанового масла, которое циркулирует через коллоидную мельницу с температурой 40-55°С при скорости вращения ротора 28000 об/мин. Раствор дистеарата бетулина разбивается на мелкие капли, метиленхлорид вскипает и его основная масса отгоняется при перемешивании. Оставшийся метиленхлорид отгоняется из наносуспензии под вакуумом. Получается 4,0% наносуспензия дистеарата бетулина с размером частиц от 400 до 700 нм.

Пример 6

Раствор дибутирата бетулина 1,5 г в 50 г этилацетата совмещают при перемешивании с 0,5 л горячей воды в присутствии 6 г полиоксиэтилен-40 стеарата (Е431) (ПАВ 1,2%), которая циркулирует через коллоидную мельницу с температурой 80-95°С при скорости вращения ротора 18000 об/мин, с температурой 70-75°С. Раствор дибутирата бетулина разбивается на мелкие капли, этилацетат вскипает и его основная масса отгоняется при перемешивании. Оставшийся этилацетат отгоняется из наносуспензии под вакуумом. Получается 0,3% наносуспензия дибутирата бетулина с размером частиц от 400 до 730 нм.

Пример 7

Раствор дибутирата бетулина 5 г в 50 г этилацетата совмещают при перемешивании с 0,5 л горячего растительного масла (подсолнечного), которое циркулирует через коллоидную мельницу с температурой 80-95°С при скорости вращения ротора 16000 об/мин, с температурой 70-75°С. Раствор дибутирата бетулина разбивается на мелкие капли, этилацетат вскипает и его основная масса отгоняется при перемешивании. Оставшийся этилацетат отгоняется из наносуспензии под вакуумом. Получается 1,0% наносуспензия дибутирата бетулина с размером частиц от 400 до 550 нм.

Пример 8

Раствор диацетата бетулина 0,001 г в 10 г изопропилового спирта совмещают при перемешивании с 0,09 л горячей воды в присутствии 0,5 г ТВИН60 (Е435) 8 (ПАВ 0,55%), которая циркулирует через коллоидную мельницу с температурой 80-95°С при скорости вращения ротора 15000 об/мин, с температурой 70-75°С. Раствор диацетата бетулина разбивается на мелкие капли, изопропиловый спирт вскипает и его основная масса отгоняется при перемешивании. Оставшийся изопропиловый спирт отгоняется из наносуспензии под вакуумом. Получается 0,001% наносуспензия диацетата бетулина с размером частиц от 750 до 1050 нм.

Пример 9

Раствор бисфталата бетулина 5 г в смеси 50 г этилового спирта и 25 г этилацетата совмещают при перемешивании с 0,25 л горячей воды в присутствии смеси ПАВ (лаурет сульфат натрия - 30 мас.%, диэтаноламид кокосового масла - 10 мас.%), которая циркулирует через коллоидную мельницу с температурой 80-95°С при скорости вращения ротора 12000 об/мин, с температурой 70-75°С. Раствор бисфталата бетулина разбивается на мелкие капли, смесь растворителей вскипает и их основная масса отгоняется при перемешивании. Оставшийся растворитель отгоняется из наносуспензии под вакуумом. Получается 2,0% наносуспензия бисфталата бетулина с размером частиц от 200 до 900 нм.

Пример 10

Раствор бисмалеината бетулина 5 г в 50 г этилацетата совмещают при перемешивании с 0,3 л горячей смеси масел кукурузного и диметилсилоксанового в соотношении 10:1, которая циркулирует через коллоидную мельницу с температурой 80-95°С при скорости вращения ротора 10000 об/мин, с температурой 70-75°С. Раствор бисмалеината бетулина разбивается на мелкие капли, этилацетат вскипает и его основная масса отгоняется при перемешивании. Оставшийся этилацетат отгоняется из наносуспензии под вакуумом. Получается 1,7% наносуспензия бисмалеината бетулина с размером частиц от 300 до 700 нм.

Пример 11

Раствор ацетилсалицилата бетулина 10 г в 150 г этилового спирта совмещают при перемешивании с 0,5 л горячей воды в присутствии 6 г СПАН80 (Е494) (ПАВ 1,2%), которая циркулирует через коллоидную мельницу с температурой 80-95°С 9 при скорости вращения ротора 8000 об/мин, с температурой 70-75°С. Раствор ацетилсалицилата бетулина разбивается на мелкие капли, спирт вскипает и его основная масса отгоняется при перемешивании. Оставшийся спирт отгоняется из наносуспензии под вакуумом. Получается 2,0% наносуспензия ацетилсалицилата бетулина с размером частиц от 500 до 1000 нм.

Пример 12

Раствор бутирата бетулина 10 г в 200 г этилового спирта совмещают при перемешивании с 1,0 л горячей смеси оливкового масла и рыбьего жира в соотношении 10:1 в присутствии 10 г моноглицеринстеарата (Е472), которая циркулирует через коллоидную мельницу с температурой 80-95°С при скорости вращения ротора 1500 об/мин, с температурой 80-95°С. Раствор бутирата бетулина разбивается на мелкие капли, спирт вскипает и его основная масса отгоняется при перемешивании. Оставшийся спирт отгоняется из наносуспензии под вакуумом. Получается 1,0% наносуспензия бутирата бетулина с размером частиц от 200 до 350 нм.

Изобретение относится к прикладной биотехнологии, в частности к способу получения наносуспензии бетулина и/или его производных. Способ получения наносуспензии бетулина и/или его производных путем совмещения раствора бетулина и/или его производных в органическом растворителе с пищевым маслом или водным раствором поверхностно-активного вещества в рабочем органе коллоидной мельницы при интенсивном перемешивании и гомогенизации в процессе циркуляции, при определенных условиях, с последующим удалением оставшегося растворителя под вакуумом. Вышеописанный способ позволяет получить стабильную наносуспензию бетулина и/или его производных с улучшенной проникающей способностью через стенки капилляров и клеточные мембраны и большей выраженностью биологических действий по сравнению с известными аналогами. 4 з.п. ф-лы, 12 ил.

1. Способ получения наносуспензии бетулина и/или его производных, отличающийся тем, что суспензию готовят путем совмещения раствора бетулина и/или его производных в органических растворителях с пищевым маслом или водным раствором поверхостно-активного вещества, при температуре 40-95°С (в зависимости от температуры кипения выбранного растворителя) в рабочем органе коллоидной мельницы при интенсивном перемешивании и гомогенизации в процессе циркуляции, с последующим удалением оставшегося растворителя под вакуумом при следующем соотношении компонентов, мас.ч.:
Бетулин и/или его производные 0,001-10 Органический растворитель 50-200 Пищевое масло или водный раствор поверхостно-активного вещества 90-1000

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве масла используются следующие пищевые масла: растительные масла (подсолнечное, кукурузное, арахисовое, льняное, хлопковое, рапсовое, соевое, кунжутное, конопляное, оливковое, тыквенное, масло виноградных косточек и другие) или рыбий жир, или минеральное масло типа Е905а, или полидиметилсилоксановое масло типа Е900, или смеси из них, в тех же количествах.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют следующие: этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилацетат или метиленхлорид.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что содержание поверхностно-активного вещества в водном растворе находится в пределах 0,1-10 мас.%.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что скорость вращения ротора коллоидной мельницы составляет от 1,5 до 28 тысяч оборотов в минуту.