СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ МУТАЦИЙ У РАСТЕНИЙ РОДА ЛУКОВ Российский патент 2010 года по МПК A01H1/06 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений, и может быть использовано в мутационной генетике для создания новых сортов растений.

Известно применение модификаторов частоты индуцирования мутаций у растений, цитологических красителей - фуксина основного, азурамина и кармина - методом вакуум-фильтрации с последующей обработкой семян мутагеном - ионизирующим излучением радиоактивного изотопа ¹³⁷С, в дозах 50-100 Гр. (SU №1316602, МПК⁷ А01Н 1/04, 15.06.87 г.).

Недостатком применения известных модификаторов является ковалентная модификация ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) семян растений токсичными химическими соединениями, что может приводить к угнетению жизненных функций.

Известен способ обработки семян растений раствором сульфата железа (II) с концентрацией 4-5 ммоль в течение 5-10 ч с последующей промывкой в проточной воде и облучением их потоком отрицательных аэроионов на расстоянии 23-25 см в течение 40-80 мин (RU №2269258, МПК⁸ А01Н 1/06, 10.02.2006 г.).

Недостатком известного способа является то, что обработка семян раствором сульфата железа (II) приводит к отсутствию достаточной предварительной стимуляции мутагенной активности семян растений для частоты мутаций в искусственном мутагенезе.

Технический результат заключается в повышении частоты мутаций в искусственном мутагенезе и увеличении выхода хромосомных аберраций за счет использования природной способности активных форм кислорода к окислительной модификации биомолекул, в том числе ДНК клеток с активированным фосфоинозитидным циклом.

Технический результат достигается тем, что в способе индуцирования мутаций у растений рода луков, включающем обработку его семян мутагеном, промывку в проточной воде и высушивание с последующим облучением потоком отрицательных аэроионов, семена растений рода луков предварительно обрабатывают фторидом алюминия в течение 8-10 часов, а в качестве мутагена используют раствор перекиси водорода и маннитола в соотношении 1:1 в течение 7-10 часов. Концентрация перекиси водорода составляет 2-10 ммоль, а концентрация маннитола 4-5 ммоль.

Перекись водорода с концентрацией менее 2 ммоль не обладает выраженной мутагенной активностью.

Концентрация маннитола более 5 ммоль может привести к ингибированию мутагенного действия перекиси водорода и ионизированного воздуха.

Время обработки семян растений рода луков раствором перекиси водорода и маннитола не должно превышать 10 часов, так как более длительная обработка негативно влияет на процесс прорастания семян, менее 7 часов недостаточно для образования мутаций.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1

В качестве тест-объекта из растений рода луков взят лук батун (Allium fistulosum L).

Для повышения эффективности воздействия перекиси водорода воздушно-сухие семена лука батун предварительно обрабатывают активатором фосфоинозитидного цикла раствором фторида алюминия (общепринятой концентрацией 50 ммоль AlCl₃, 10 ммоль NaF) в течение 8-10 часов. Затем семена лука батун обрабатывают раствором перекиси водорода с концентрацией 2-10 ммоль и маннитола с концентрацией 4-5 ммоль в соотношении 1:1. Время экспозиции 7-10 часов с последующей промывкой в проточной воде и просушиванием. Следующим этапом является воздействие на семена лука батун потоком отрицательных аэроионов кислорода, для этого их помещают под электроэффлювиальный ионизатор воздуха, который образует отрицательно заряженный кислород супероксид в процессе тихого разряда без примесей озона и положительных аэроионов. В качестве источника использован электроэффлювиальный ионизатор воздуха (аэроионизатор "Сетеон", произведенный НПЦ "Альфа-Ритм"). Семена лука батун помещают на расстоянии 23-25 см от кончиков игл и воздействуют в течение 40, 60, 80 минут. Содержание отрицательных аэроионов кислорода, определенное в месте обработки, составляло при 40 мин стимуляции 1,3×10⁶, при 60 мин - 2×10⁶, при 80 мин - 2,7×10⁶ в 1 см³.

Семена лука батун высевают для выращивания первого поколения (Mi) после обработки, во втором поколении (М₂) получают измененные растения лука батун, в третьем поколении проверяют мутационную (наследственную) природу, отбирают мутации и рассчитывают их частоту по известным методикам экспериментального мутагенеза, например, на 100 семей М₂. В таблице показано увеличение выхода хроматидных аберрации, что характеризует данный подход как эффективный в получении исходного, обладающего высокой жизнеспособностью, материала при селекции.

В основе реализации мутагенного эффекта лежит имитация природного процесса ограниченной свободнорадикальной модификации ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) активными формами кислорода. При этом применение антиоксиданта позволяет сводить к минимуму появление в ходе реакции Фентона гидроксильного радикала, модулируя тем самым мутагенный эффект активных форм кислорода. Высокая эффективность действующих стимулов, к тому же направленная на повышение жизнеспособности и всхожести семян лука батун, обеспечивается обработкой фторидом алюминия.

Посредством воздействия ионизированным воздухом и перекисью водорода с концентрацией 2-10 ммоль моделируют мягкий окислительный стресс, развитие которого ограничивают антиоксидантом (маннитолом). В качестве мутагенов используют супероксид - радикал кислорода (основной ион ионизированного воздуха) и перекись водорода с концентрацией 4-5 ммоль - начальные наименее реакционноспособные продукты восстановления кислорода.

При проведении цитогенетического анализа показано, что ионизированный воздух усиливает выход хроматидных аберраций при стимуляции в течение 40-60 мин, при действии перекиси водорода, стимулирующей процессы пероксидации, выход аберрантных клеток повышается в среднем на 30% по сравнению с контролем. Совместное действие ионизированного воздуха и перекиси водорода приводит к усилению мутагенного эффекта.

Установлено, что ионизированный воздух может способствовать образованию в семенах лука батун перекиси водорода и нарушать динамическое равновесие в системе прооксиданты/антиоксиданты, активировать свободнорадикальные реакции, что в свою очередь усиливает выход хроматидных аберраций, имеющих для клеток растения адаптационно-приспособительное значение и поддерживающих высокую жизнеспособность семян лука батун.

Перекись водорода играет важную роль в процессах окисления, так как является источником образования мощного окислителя - гидроксильного радикала ОН*, образующегося в ходе реакций Фентона (H₂O₂+Fe²⁺→Fe³⁺+ОН*+ОН″) и Хабера-Вайса (H₂O₂+O₂″→О₂+ОН*+H₂O). Собственно выраженное мутагенное действие ионизированного воздуха и перекиси водорода происходит через образование гидроксильного радикала.

В концентрациях 2-10 ммоль, стимулирующих пролиферативные процессы, перекись водорода действует через фосфоинозитидный (ФИ) цикл. Именно ФИ-циклу принадлежит важная роль в быстром ответе клеток на действие различных агентов (CoccoL. et al., 2004). При участии ФИ-цикла активируются МАР-киназы и гены, ответственные за деление и пролиферацию клетки. Нами показано, что активация ФИ-цикла является одной из причин, усиливающих пролиферативные процессы в семенах лука батун.

Фторид алюминия активирует G-белки, в число эффекторов которых входит фосфоинозитидспецифичная фосфолипаза С, запускающая ФИ-цикл.

Поэтому совместное действие ионизированного воздуха, перекиси водорода и фторида алюминия является в плане активации пролиферативных процессов и увеличения выхода хроматидных аберраций наиболее эффективным.

Поскольку ФИ-цикл является универсальным молекулярным механизмом трансдукции внешнего сигнала и запуска программ клеточного поведения, широко распространенным в живой природе, то очевидно, что реализация митогенного и мутагенного эффектов активных форм кислорода в клетках с активированным ФИ-циклом может воспроизводиться на растениях рода луков и на других видах растений.

Таблица 1. семена лука батун Время облучения, мин Клетки с хроматидными аберрациями, % Всхожесть, % Замоченные в воде (контроль) 0 0,50±0,01 40,3±0,33 40 0,66±0,01 87,6±1,20 60 0,43±0,01 77,6±1,20 80 0,14±0,01 68,1±1,00 Обработанные раствором перекиси водорода 0 0,50±0,04 34,3±0,33 40 0,66±0,02 85,1±1,00 60 0,33±0,03 79,1±0,58 80 0,50±0,04 67,1±0,58 Обработанные раствором фторида алюминия, ионизированным воздухом, перекисью водорода 0 0,16±0,01 36,5±0,58 40 0,36±0,01 90,5±0,33 60 0,43±0,01 80,1+0,33 80 0,33±0,01 70,3±1,20 р<0,001 - достоверность по отношению к исходным данным

Семена растений рода луков обрабатывают фторидом алюминия в течение 8-10 часов, а затем мутагеном в течение 7-10 часов. В качестве мутагена используют раствор перекиси водорода и маннитола в соотношении 1:1. Концентрация перекиси водорода составляет 2-10 ммоль, концентрация маннитола 4-5 ммоль. Обработанные семена промывают в проточной воде, высушивают и облучают потоком отрицательных аэроионов кислорода. Обработка обеспечивает увеличение выхода хромосомных аббераций за счет использования природной способности активных форм кислорода к окислительной модификации биомолекул, в том числе ДНК, в клетках с активированным ФИ-циклом. 1 табл.

Способ индуцирования мутаций у растений рода луков, включающий обработку его семян мутагеном, промывку в проточной воде и высушивание с последующим облучением потоком отрицательных аэроионов кислорода, отличающийся тем, что семена растений рода луков предварительно обрабатывают фторидом алюминия в течение 8-10 ч, а в качестве мутагена используют раствор перекиси водорода и маннитола в соотношении 1:1 в течение 7-10 ч, при этом концентрация перекиси водорода составляет 2-10 ммоль, а концентрация маннитола - 4-5 ммоль.