УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЭЛЕКТРОСТИМУЛИРУЕМОГО СЛИЯНИЯ КАРИОПЛАСТОВ С ЦИТОПЛАСТАМИ Российский патент 2010 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к биотехнологии, сельскому хозяйству и медицине и может быть использовано при реконструировании клеток с целью клонирования животных и получения истинных эмбриональных стволовых клеток животных и человека.

Существует несколько способов слияния клеток и их органелл. На ранних этапах развития исследований по реконструированию клеток (60-70-е годы) наиболее широко использовались два способа слияния животных клеток - с помощью полиэтиленгликоля и инактивированного вируса Сендай. Но эти способы имели существенные недостатки, поэтому велись поиски новых более приемлемых способов слияния клеток.

Позднее для слияния растительных и животных клеток был разработан способ, основанный на использовании электрического тока. Способ электростимулируемого слияния клеток оказался более технологичным и лишенным большинства недостатков, свойственных ранее используемым химическим способам.

Принцип способа электростимулируемого слияния клеток основан на создании электрического пробоя, т.е. резкого увеличения проводимости и проницаемости клеточных мембран в электрическом поле постоянного тока с образованием в них сквозных пор. Исследования показали, что для электростимулируемого слияния отдельных клеток необходим плотный контакт между ними и точная ориентация места контакта между клетками относительно силовых линий электрического поля. Для создания контакта между клетками и их ориентации между электродами при электростимулируемом слиянии было предложено использование принципа диэлектрофореза. Известно, что в неоднородном переменном электрическом поле в растворе диэлектрика, клетки перемещаются в направлении увеличения напряженности поля и притягиваются друг к другу, образуя цепочки вдоль силовых линий неоднородного электрического поля. Но диэлектрофорез можно проводить только лишь в растворе диэлектрика с достаточно высоким сопротивлением, следовательно, для пробоя мембран необходимо прилагать импульсы постоянного тока более высокого напряжения.

Для работы с небольшим количеством животных клеток наибольшее распространение получила камера с двумя параллельными цилиндрическими электродами. В современных системах для электростимулируемого слияния отдельных клеток используют камеры с расстоянием между электродами от 250 до 3200 мкм. Пространство между электродами заполняют раствором диэлектрика, например маннитола, и между электродами помещают отдельные клетки, которые необходимо слить между собой. Затем эти клетки подвергают воздействию высокочастотного переменного электрического поля, чтобы путем диэлектрофореза сориентировать их местами контактов перпендикулярно силовым линиям электрического поля. После того как клетки будут ориентированы в пространстве необходимым образом, на электроды подают прямоугольные импульсы постоянного тока, которые вызывают пробой мембран в местах контакта клеток и происходит слияние клеток между собой.

Известно, что для эффективного слияния клеток необходима их строгая ориентация между электродами, т.к. для пробоя мембран в области контакта между клетками, расположенных перпендикулярно направлению линий электрического поля, требуется наименьшее напряжение, по сравнению с мембранами, имеющими отклонения от перпендикулярной оси.

Также известно, что при электростимулируемом слиянии клеток, значительно различающихся по размеру, внутримембранное напряжение, возникающее на клеточных мембранах при электростимуляции клеток внешним полем, существенно зависит от размера клетки. Чем больше клетка, тем выше напряжение на ее мембране. В результате электростимуляции контактирующих клеток разных размеров заданное напряжение поля может быть слишком слабым для клетки меньшего размера и в то же время очень высокой для клетки большего размера и вызвать в ней необратимые повреждения.

С развитием работ по клонированию животных возникла необходимость сливать между собой не отдельные клетки, а цитопласт с кариопластом.

Цитопласт - цитоплазма, окруженная неповрежденной цитоплазматической мембраной, образовавшаяся после удаления (энуклеации) из яйцеклетки или зиготы собственного ядра.

Кариопласт - изолированное клеточное ядро, окруженное плазматической мембраной.

Комплекс цитопласт-кариопласт - комплекс, образованный в результате трансплантации кариопласта в перивителлиновое пространство цитопласта, в котором цитопласт и кариопласт разделены цитоплазматическими мембранами.

Реконструированная клетка (эмбрион) - клетка, образованная в результате трансплантации чужеродного ядра (кариопласта) в энуклеированную яйцеклетку (цитопласт) и их слияния.

При клонировании млекопитающих путем трансплантации ядер в перивителлиновое пространство энуклеированной яйцеклетки (цитопласт) вводят ядро другой клетки (кариопласт) и под блестящей оболочкой яйцеклетки образуется комплекс цитопласт-кариопласт. В этом комплексе цитопласт и кариопласт разделены между собой двумя цитоплазматическими мембранами, которые необходимо слить, чтобы кариопласт перешел внутрь цитопласта и образовалась реконструированная клетка (эмбрион).

Для слияния кариопластов с цитопластами при реконструировании клеток был использован способ электростимулируемого слияния в камере с двумя параллельными цилиндрическими электродами. Однако при этом способе слияния кариопластов с цитопластами эффективность слияния резко снизилась, по сравнению со слиянием отдельных клеток между собой.

При использовании камер с параллельными электродами достигается невысокая эффективность (40-50%) слияния цитопластов с кариопластами при реконструировании клеток (эмбрионов). Основными причинами низкой эффективности слияния при использовании этого способа являются:

- плохая ориентация между электродами места контакта цитопласта с кариопластом;

- применение принципа диэлектрофореза для ориентации клеток относительно электродов, для которого необходимо использование раствора сильного диэлектрика, что требует для осуществления пробоя мембран клеток более высокого напряжения импульса постоянного тока;

- большое расстояние между электродами;

- разрыв во времени между действием переменного поля и прохождением импульса постоянного тока, в результате которого происходит нарушение ориентации клеток относительно электродов, ранее созданное переменным электрическим полем.

В результате всего этого для пробоя мембраны необходимо повышать напряжение импульса постоянного тока, что ведет к разрушению цитопласта.

Исходя из этого, для повышения эффективности слияния кариопласта с цитопластом, был предложен способ, основанный на использовании микроэлектродов игольчатого типа, закрепленных на микроманипуляторах. Принцип этого метода заключается в том, что электроды с помощью микроманипуляторов подводятся своими кончиками непосредственно к комплексу кариопласт-цитопласт и ориентируют его таким образом, чтобы место контакта кариопласта с цитопластом находилось на одной линии с кончиками электродов.

Впервые этот способ был применен для слияния бластомеров внутри 2-4-клеточных эмбрионов. Позднее способ электрослияния с использованием игольчатых электродов был применен для слияния мышиных энуклеированных зигот (цитопластов) с пронуклеусами, выделенными из зигот (Свиридова и др., 1986), и при реконструировании кроличьих эмбрионов с использованием в качестве кариопластов бластомеров, выделенных из 4-8-клеточных эмбрионов, а в качестве цитопластов - энуклеированных зигот (Лисицына, Рябых, 1993). Способ, основанный на использовании игольчатых микроэлектродов, имеет следующие преимущества, по сравнению с использованием параллельных электродов:

- микроэлектроды вплотную подводят к комплексу цитопласт-кариопласт и путем механического перемещения клетки производят ориентацию места контакта кариопласта с цитопластом в сторону одного из электродов;

- для ориентации не используют высокочастотное переменное поле;

- происходит более точная ориентация клеток между электродами;

- уменьшение расстояния между электродами позволяет уменьшить напряжение прямоугольного импульса, прилагаемое для осуществления пробоя мембран.

На ранних этапах исследований по клонированию животных, когда в качестве источника кариопластов использовали бластомеры, полученные из 2-8-клеточных эмбрионов, результаты слияния были приемлемыми. Бластомеры из этих эмбрионов имели достаточно большой размер, и площадь контакта между цитопластом и бластомером была значительной, что позволяло с удовлетворительной точностью ориентировать место контакта относительно электродов (Лисицына, Рябых, 1993).

Начиная с 1997 года, после получения овечки Долли (Wilmut I. et al., 1997), при реконструировании эмбрионов в качестве кариопластов начали использовать соматические клетки взрослых животных, которые имеют значительно меньший размер, по сравнению с бластомерами 4-8-клеточных эмбрионов. В связи с этим эффективность электростимулируемого слияния кариопласта с цитопластом резко снизилась. Это обусловлено тем, что снизилась точность ориентации места контакта кариопласта с цитопластом относительно силовых линий электрического поля, из-за уменьшения площади контакта между ними.

Наиболее близким к заявленному устройству является устройство с электродами игольчатого типа, использованное для электростимулируемого слияния кариопласта с цитопластом при реконструировании клеток (эмбрионов) путем трансплантации в перивителлиновое пространство энуклеированного ооцита крупного рогатого скота (цитопласт), соматической клетки взрослого животного (кариопласт).

(Goto Y., Kaneyama К., Kobayashi S. et al. Birth of cloned calves derived from cultured oviductal epithelial cells of dairy cow. // Animal Science. J., 1999, 70 (4),: 243-245).

Arat S., Gibbons J., Rzucidlo J. et al. In vitro development of bovine nuclear transfer embryos from transgenic clonal lines of adult and fetal fibroblast cells of the same genotype. //Biology of reproduction, 2002, 66,: 1768-1774).

В этих исследованиях, так же как и в наших исследованиях, в качестве источника кариопластов использовали соматические клетки взрослых животных (эпителиальные клетки яйцевода или фибробласты), а в качестве источника цитопластов - ооциты крупного рогатого скота, дозревавшие in vitro. Также как и в наших исследованиях для электростимулируемого слияния кариопласта с цитопластом использовали электроды игольчатого типа.

Однако использованный авторами принцип электростимулируемого слияния кариопласта с цитопластом с помощью игольчатых электродов имеет определенные недостатки. Перемещение комплексов цитопласт-кариопласт и ориентацию места контакта кариопласта с цитопластом относительно электродов, авторы осуществляли только с помощью микроэлектродов, закрепленных в микроманипуляторах. Это довольно сложный процесс, который требует для своего осуществления значительных навыков, затрат большого количества времени и существенного напряжения организма исследователя, что значительно снижает эффективность работы. Кроме того, при ориентации комплекса кариопласт-цитопласт только с помощью одних микроэлектродов клетка постоянно находится в свободном (незафиксированном состоянии) и поэтому первоначальная ориентация места контакта кариопласта с цитопластом к одному из электродов может в любой момент изменяться, что приводит к снижению эффективности электрослияния. В связи с этим, эффективность электрослияния кариопласта с цитопластом была невысокой и составляла только 55-60%.

Целью изобретения является повышение эффективности электростимулируемого слияния кариопласта с цитопластом при реконструировании клеток (эмбрионов) и значительного снижения затрат сил и времени на осуществление этого процесса за счет более точной ориентации комплекса кариопласт-цитопласт относительно электродов игольчатого типа, фиксации клеток вплотную к электродам и уменьшения расстояния между электродами.

Указанная цель достигается тем, что в известном устройстве для электростимулируемого слияния кариопласта с цитопластом, включающем микроэлектроды игольчатого типа, закрепленные на микроманипуляторах, каждый металлический электрод помещают внутрь стеклянной присасывающей микропипетки, соединенной с устройством, изменяющим давление, например со шприцом.

Объединение электродов с присасывающими микропипетками в единый комплекс позволяет перемещать клетки внутри камеры, как путем прямого воздействия на них кончиками микропипеток, так и путем действия положительного или отрицательного давления, создаваемого в микропипетках. Это позволяет проводить точную ориентацию комплекса кариопласт-цитопласт между электродами, создает значительные удобства для их ориентации и существенно сокращает время на осуществление этого процесса. Комплекс кариопласт-цитопласт, ориентированный необходимым образом относительно электродов, плотно фиксируют на одной из присасывающих пипеток путем создания отрицательного давления, что обеспечивает высокую точность ориентации места контакта кариопласта с цитопластом между электродами, и за счет этого повышается эффективность их электрослияния.

На чертеже изображено предложенное устройство.

Устройство состоит из металлических микроэлектродов игольчатого типа 2 с заточенными на конус кончиками. Микроэлектроды подсоединены к источнику импульсного тока. Электроды помещены внутрь стеклянных микропипеток 1, которые своим широким концом подсоединены с помощью гибкой трубки, например полиэтиленовой, к источнику изменения давления, например шприцу, а на другом конце имеют узкое выходное отверстие 8, в которое входит кончик микроэлектрода. Микропипетка заполнена средой, используемой для электрослияния клеток. Между электродом и внутренней стенкой микропипетки имеется пространство 6, в котором перемещается среда для электрослияния. Между заточенным на конус кончиком электрода и внутренней стенкой выходного отверстия микропипетки 8 имеется зазор 7, через который свободно проходит жидкость.

Работает устройство следующим образом. Микропипетки 1 заполняют специальной средой, которую будут использовать для электрослияния клеток. После этого с помощью микроманипуляторов микропипетки с двух противоположных сторон вводят в камеру для электрослияния, заполненную средой для электрослияния, в которой находятся комплексы кариопласт-цитопласт 3, предназначенные для слияния. Из этих комплексов 3 выбирают один и путем прямого воздействия на него кончиками микропипеток, и путем действия положительного или отрицательного давления, создаваемого в микропипетках, перемещают этот комплекс в пространстве и ориентируют его кариопластом 4 к одному из электродов и после этого фиксируют клетку на одной из присасывающих микропипеток путем создания отрицательного давления. После этого, с противоположной стороны к зафиксированной клетке вплотную подводят второй электрод 2, и клетка оказывается плотно зафиксированной и точно ориентированной между электродами. После этого на электроды подается электрический импульс необходимого напряжения и продолжительности, в результате чего происходит электрический пробой мембраны в области контакта кариопласта 4 с цитопластом 5 и их слияние в одну реконструированную клетку. Затем с помощью положительного давления, создаваемого в одной из микропипеток, реконструированная клетка перемещается в свободную часть камеры, а на ее место фиксируется новый комплекс кариопласт-цитопласт.

Изобретение относится к биотехнологии и предназначается для реконструирования клеток, с целью клонирования животных, получения трансгенных животных и истинных эмбриональных стволовых клеток животных и человека. Устройство содержит микроэлектроды игольчатого типа, закрепленные на микроманипуляторах. Каждый микроэлектрод помещают внутрь присасывающей микропипетки, соединенной с устройством, изменяющим давление. Это позволяет перемещать и ориентировать комплекс цитопласт-кариопласт в пространстве, за счет действия положительного или отрицательного давления, создаваемого в микропипетках. Ориентированный относительно силовых линий электрического поля комплекс цитопласт-кариопласт фиксируют на присасывающих микропипетках. Изобретение позволяет повысить эффективность процесса электрослияния кариопластов с цитопластами. 3 з.п.ф-лы, 1 ил.

1. Устройство для электростимулируемого слияния кариопластов с цитопластами при реконструировании клеток, содержащее микроэлектроды игольчатого типа, закрепленные на микроманипуляторах, отличающееся тем, что каждый игольчатый микроэлектрод помещен внутрь присасывающей микропипетки, соединенной с устройством, изменяющим давление.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что перемещение и ориентацию комплекса цитопласт-кариопласт в пространстве осуществляют путем действия положительного или отрицательного давления, создаваемого в микропипетках, а ориентированный комплекс фиксируют на присасывающих микропипетках.

3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что кончик микроэлектрода находится на одном уровне с выходным отверстием присасывающей микропипетки, и между ними имеется зазор для прохождения жидкости.

4. Устройство по п.1, отличающееся тем, что присасывающую микропипетку заполняют средой, используемой для электростимулируемого слияния.