СПОСОБ ЭНУКЛЕАЦИИ ЯЙЦЕКЛЕТОК И ЭМБРИОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2004 года по МПК A61D19/04 

Изобретение относится к области биологии, в частности к биотехнологии клонирования млекопитающих, и может быть использовано для повышения эффективности реконструирования эмбрионов при трансплантации кариопластов в цитопласты.

Важность разработки эффективных способов энуклеации зародышей млекопитающих определяется тем, что энуклеация является одним из самых трудоемких этапов при реконструировании клеток. Энуклеация по существу представляет собой процесс искусственного деления клетки на два изолированных фрагмента - цитопласт и кариопласт. Основным условием успешной энуклеации клетки является целостность цитоплазматической мембраны, окружающей как цитопласт, так и кариопласт. Только со времени разработки нетравматического способа энуклеации яйцеклеток и зигот (Мс Grath, Solter, 1983) стало возможным развитие работ по клонированию млекопитающих.

Известен способ энуклеации и реконструирования эмбрионов (McGrath, Solter - Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery and cell fusion // Science, 1983, V.220, 4603, р.1300-1302). Сущность этого способа заключается в том, что из зиготы удаляют пронуклеусы без прокалывания плазматической мембраны, медленным всасыванием в микропипетку пронуклеусов с частью цитоплазмы, окруженной плазматической мембраной. Удаление ядерного материала из реципиентной клетки производится с помощью микропипетки со скошенным острым кончиком, имеющим внутренний диаметр 15-20 микрон (энуклеационная микропипетка). При данном способе энуклеации яйцеклеток необходимо, чтобы кончик энуклеационной микропипетки прогибал прозрачную оболочку на незначительную глубину и легко входил под оболочку не только острием, но и своей широкой скошенной частью. Однако очень часто прокалывание прозрачной оболочки происходит только острием кончика микропипетки, и расширенная его часть с трудом проходит внутрь образовавшегося прокола в прозрачной оболочке. Прозрачная оболочка при этом прогибается на значительную глубину, острие микроинструмента достигает противоположной стороны оболочки изнутри клетки, в результате чего происходит прокол плазматической мембраны острым кончиком энуклеационной микропипетки, что в свою очередь приводит к быстрой гибели клетки. Поэтому вскоре после разработки этого способа стали предприниматься попытки, направленные на его совершенствование.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту (прототип) является способ, предложенный Tsunoda Y., Yasui Т., Nakamura К., Uchida Т., Sugie Т. - Effect of cutting the zona pellucida on the pronuclear transplantation in the mouse // J. of Experimental Zoology, 1986, 240, 119-125. Сущность данного способа заключается в том, что прозрачную оболочку яйцеклетки предварительно разрезают на 10-20% острой стеклянной иглой, диаметром 5-7 микрон. Яйцеклетку удерживают с помощью присасывающей пипетки и по касательной в перивителлиновое пространство (со стороны полярного тельца) вводят стеклянную иглу, сделав при этом два прокола в прозрачной оболочке при входе и выходе из перивителлинового пространства яйцеклетки. Затем иглу вместе с закрепленной на ней яйцеклеткой перемещают вплотную к боковой стенке присасывающей пипетки. В результате нескольких движений иглы о присасывающую пипетку в прозрачной оболочке образуется разрез и игла освобождается. При энуклеации реципиентные яйцеклетки вначале захватывают присасывающей пипеткой со стороны, противоположной разрезу в прозрачной оболочке, затем через этот разрез вводят энуклеационную микропипетку и всасывают ядерный материал.

Трансплантацию кариопластов в энуклеированную яйцеклетку (цитопласт) осуществляют этой же пипеткой через разрез в прозрачной оболочке.

Главным недостатком этого способа энуклеации яйцеклеток (Tsunoda et al., 1986) является использование двух инструментов, вначале стеклянной иглы для получения разреза в прозрачной оболочке яйцеклеток, а затем энуклеационной микропипетки для энуклеации яйцеклеток и трансплантации кариопластов, с необходимостью замены одного инструмента другим в ходе эксперимента, что создает очень большие неудобства при проведении таких тонких работ, как энуклеация и реконструирование клеток. Кроме того, разрез в прозрачной оболочке яйцеклеток нельзя сделать сразу за один прием, необходимо провести дополнительные операции, такие как введение стеклянной иглы в перивителлиновое пространство, и перемещение иглы с закрепленной на ней яйцеклеткой вплотную к стенке присасывающей пипетки и осуществление нескольких движений иглы о присасывающую пипетку для получения разреза в прозрачной оболочке. К существенным недостаткам этого способа следует также отнести использование двух рабочих камер, одна из которых необходима для получения разрезов в прозрачной оболочке яйцеклеток, вторая для энуклеации яйцеклеток и трансплантации кариопластов. Перемещение яйцеклеток с разрезами из одной камеры в другую, с промежуточной обработкой яйцеклеток цитохалазином Б в манипуляционной среде, увеличивает общую длительность манипуляций и затрудняет поиск местоположения разреза в прозрачной оболочке яйцеклеток. Все перечисленные выше недостатки известного способа усложняют и замедляют процесс микроманипулирования.

Целью настоящего изобретения является разработка эффективного способа энуклеации яйцеклеток, который позволит упростить и ускорить процессы энуклеации и реконструирования клеток и обеспечит высокую сохранность цитоплазматической мембраны оперируемых клеток.

Сущность изобретения - способ предусматривает использование одной энуклеационной микропипетки как для получения разреза в прозрачной оболочке яйцеклеток, так и для энуклеации и реконструирования клеток. Разрез в прозрачной оболочке яйцеклетки производится в один прием, при этом энуклеационная микропипетка не внедряется в перивителлиновое пространство клетки, а затрагивает только поверхность прозрачной оболочки, подтягивая ее до соприкосновения с наружной поверхностью присасывающей пипетки, и разрезает образовавшуюся складку в прозрачной оболочке.

В предлагаемом способе энуклеацию и реконструирование яйцеклеток (в частности, ооцитов) осуществляют в следующей последовательности: с помощью энуклеационной микропипетки делают разрез в прозрачной оболочке яйцеклетки (со стороны полярного тельца). Для этого яйцеклетку фиксируют с помощью присасывающей пипетки, а энуклеационную микропипетку располагают по отношению к клетке таким образом, чтобы ее скошенная режущая часть контактировала с прозрачной оболочкой яйцеклетки и наружной поверхностью присасывающей пипетки одновременно. Затем легким надавливанием энуклеационной микропипеткой на прозрачную оболочку подтягивают ее до соприкосновения с наружной поверхностью присасывающей пипетки с образованием складки (петельки), которую и вырезают одним или двумя поступательными движениями скошенной частью энуклеационной микропипетки (Приложение 1).

После этого с помощью присасывающей пипетки яйцеклетку фиксируют со стороны, противоположной разрезу в прозрачной оболочке, а затем с помощью той же энуклеационной микропипетки проводят энуклеацию яйцеклетки или зиготы и трансплантируют кариопласт в перивителлиновое пространство энуклеированной клетки через разрез в прозрачной оболочке.

Размеры разреза в прозрачной оболочке напрямую зависят от размера кончика энуклеационной микропипетки и формы ее изготовления. В каждом конкретном случае размерами энуклеационной микропипетки можно варьировать в зависимости от величины кариопластов (чем больше кариопласт, тем больше размеры энуклеационной микропипетки).

В наших условиях для микрохирургических манипуляций с кариопластами, полученными из бластомеров 2-клеточных эмбрионов, использовали скошенную микропипетку с внешним диаметром 25-30 микрон, изготовленную на установке для вытяжки микропипеток и заостренную на шлифовальном устройстве под углом 40^o.

Преимущества предлагаемого способа (над прототипом) заключаются в использовании одной энуклеационной микропипетки как для разрезания прозрачной оболочки, так и для энуклеации и трансплантации кариопластов, что позволяет избежать разгерметизации энуклеационной системы и новой ее настройки. Все это значительно упрощает процесс микроманипулирования и сокращает его длительность. При этом отпадает необходимость:
- в приготовлении дополнительного инструмента - стеклянной иглы и дополнительной рабочей камеры для разрезания прозрачной оболочки яйцеклеток;
- в замене стеклянной иглы в держателе микроманипулятора на энуклеационную микропипетку, в процессе эксперимента;
- в перемещении яйцеклеток с разрезами в прозрачной оболочке из одной камеры в другую с промежуточной инкубацией в манипуляционной среде.

Использование энуклеационной микропипетки для разрезания прозрачной оболочки предпочтительней, чем стеклянной иглы, так как процесс разрезания проходит быстрее, в один прием, при этом энуклеационная микропипетка не проникает в перивителлиновое пространство клетки, а затрагивает лишь поверхность прозрачной оболочки, что делает процедуру совершенно безопасной для клетки. Использование одной рабочей камеры для приготовления разрезов в прозрачной оболочке яйцеклеток и для микроманипулирования позволяет легко находить разрезы в оперируемых клетках.

Хотя наличие разреза и облегчает проникновение любой энуклеационной микропипетки под прозрачную оболочку с целью энуклеации или трансплантации кариопластов, предпочтительнее использовать скошенную энуклеационную микропипетку, чем энуклеационную микропипетку с ровным краем.

Предлагаемый способ позволяет упростить и ускорить процесс микроманипулирования и обеспечивает высокую сохранность оперируемых яйцеклеток.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Испытание предлагаемого способа энуклеации и реконструирования проведено на яйцеклетках мышей с использованием в качестве кариопластов - ядер из бластомеров 2-клеточных эмбрионов. Исследования проводились на гибридных мышах F1 (СВА*С57 BL). В качестве реципиентных клеток были использованы яйцеклетки на стадии метафазы II.

В качестве клеток доноров кариопластов были использованы бластомеры ранних 2-клеточных эмбрионов (через 0,5-1 час после первого деления дробления, стадия G1). Для получения отдельных бластомеров - доноров ядер - у 2-клеточных эмбрионов предварительно была удалена прозрачная оболочка с помощью 0,5% раствора проназы (приготовлен на фосфатно-солевом буфере Дюльбекко без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺ (ФСБ) в течение 2-3 минут. Свободные от прозрачной оболочки эмбрионы были перенесены в раствор ФСБ (без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺) и пипетированы для получения отдельных бластомеров. Для манипулирования использовали среду М2.

Перед микрохирургией яйцеклетки вместе с бластомерами инкубировали в манипуляционной среде, содержащей цитоскелетный ингибитор цитохалазин Б в концентрации 5 мкг/мл. Все микрохирургические манипуляции проводились в камере типа Фонбрюна. Для микрохирургии (предлагаемым способом) использовали следующие инструменты:
1. Присасывающая пипетка (внешний диаметр кончика 100-120 микрон, внутренний диаметр 25-30 микрон).

2. Одна энуклеационная микропипетка, скошенная под углом 40^o (внешний диаметр 25-30 микрон), использовалась как для разрезания прозрачной оболочки, так и для энуклеации и трансплантации кариопласта.

Энуклеацию и реконструирование яйцеклеток проводили на установке, включающей в себя комплект манипуляторов и инвертированный микроскоп, оснащенный оптикой Номарского.

Вначале с помощью энуклеационной микропипетки делали разрез в прозрачной оболочке яйцеклеток (со стороны расположения полярного тельца), затем проводили энуклеацию, удаляя полярное тельце и прилегающую к нему область цитоплазмы, содержащую метафазную пластинку. При реконструировании кариопласты 2-клеточных эмбрионов вводили в перивителлиновое пространство энуклеированных яйцеклеток через разрез в прозрачной оболочке. В результате проведенных манипуляций реконструированная клетка состояла из двух частей: цитопласта - энуклеированной яйцеклетки и кариопласта из бластомера 2-клеточного эмбриона, разделенных цитоплазматическими мембранами.

Электрослияние кариопласта с цитопластом проводили в камере с параллельными электродами при напряжении импульса 1,5-2,5 kv/см-1 и продолжительности его действия 10 мкс в растворе 0,5 М маннитола, 0,1 мМ MgSО₄, 0,05 мМ лактата Са и SA - 0,5 мг/мл. Электростимуляция состояла из двух фаз: с помощью переменного тока (500 КГц, 7 сек) ориентировали реконструированные клетки в электрическом поле, после чего следовал прямоугольный импульс (50 V, 10 мкс). Слияние выполняли с помощью трех последовательных электрических импульсов с интервалом 30 минут, которые одновременно играли и роль фактора активации реконструированных клеток. Все слившиеся реконструированные клетки культивировали в микрокаплях среды M l6 под слоем минерального масла в увлажненной атмосфере с 5% СО₃ в течение 96 часов. Через каждые 24 часа регистрировали процесс развития реконструированных клеток.

В результате микроманипулирования - энуклеации реципиентных клеток и трансплантации в них кариопластов 2-клеточных эмбрионов в 9 опытах из 113 яйцеклеток (имеющих полярное тельце) энуклеировано 111 (98,2%) и реконструировано 108 (97,2%) (Таблица 1). Эффективность слияния кариопласта с цитопластом составляла 76,8% (83/108)
В результате культивирования клеток, реконструированных с использованием кариопластов, полученных из бластомеров 2-клеточных эмбрионов, отмечена следующая эффективность развития: до 2-клеток 98,7% (82/83), до 4-клеток 90,3% (75/83), до 8-клеток 81,9% (68/83), до морулы 78,3% (65/83), до бластоцисты 71,0% (59/83) (Таблица 2).

Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой эффективностью для энуклеации и реконструирования реципиентных клеток, а также не оказывает отрицательного влияния на последующие этапы технологии клонирования - слияние кариопласта с цитопластом и развитие реконструированных клеток. Предлагаемый способ отличается простотой исполнения и позволяет ускорить процессы микроманипулирования, обеспечивает высокую сохранность оперируемых клеток, практически не травматичен.

Эффективность энуклеации и реконструирования приближается к 100% и составляет 98,2% и 97,2% соответственно, лишь в единичных случаях отмечено разрушение яйцеклеток при энуклеации (2/113) и при реконструировании (3/111).

Изобретение относится к биотехнологии клонирования млекопитающих. Способ предусматривает разрезание прозрачной оболочки, удаление ядерного материала одной и той же энуклеационной микропипеткой, направленной по касательной к клетке, с подтягиванием прозрачной оболочки до соприкосновения с наружной поверхностью присасывающей пипетки и образованием складки, которую разрезают поступательным движением скошенной части кончика энуклеационной микропипетки. Способ отличается простотой исполнения и позволяет ускорить процесс микроманипулирования, обеспечивает высокую сохранность оперируемых клеток, практически не травматичен, позволяет проводить энуклеацию и реконструирование реципиентных клеток с высокой эффективностью. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ энуклеации яйцеклеток и эмбрионов млекопитающих, включающий разрезание прозрачной оболочки и удаление ядерного материала из яйцеклетки, отличающийся тем, что разрез в прозрачной оболочке яйцеклетки производят энуклеационной микропипеткой, направленной по касательной к клетке с подтягиванием прозрачной оболочки до соприкосновения с наружной поверхностью присасывающей пипетки и образованием складки, которую разрезают поступательным движением скошенной части кончика энуклеационной микропипетки.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что разрез в прозрачной оболочке и извлечение ядерного материала из яйцеклетки производят одной и той же энуклеационной микропипеткой.