Способ получения перманентно растущих животных и человеческих клеток Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

114

Изобретение относится к способу приготовления перманентно выращиваемых животных и человеческих клеток и к применению полученных линий клеток для получения клеточных продуктов

Цель изобретения - упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Слияние осуществляют известными методами в присутствии oбъeдиняющ rx веществ - предпочтительно в присутствии поллэтиленгликоля или вируса (Sendai). Получают фрагменты транс- формированных клеток.

Прорывают стенку клетки путем лизиса или механически. Затем путем центрифугирования отделяют фракции ядер от фракций цитоплазмы и исполь- зуют все фракции. Осуществляют лизис путем набухания клеток в глицерине и последующего внесения в несодержащий глицерин буферный раствор. Это приводит к тойу, что лопаются клеточ- ные мембраны. Приготавливают карио- пласты и цитопласты путем обработки клеток цитохалазином. Полученные окруженные клеточными мембранами клеточные ядра (кариопласты) и окруженная мембраной, лишенная ядра цитоплазма (цитопласты) пригодны для слияния.

Фрагменты клеток в свежем состоянии используют непосредственно после 1к приготовления или позднее для осу

нем случае обеспечивают сохранение в лиофилизированном состоянии.

Применяют фракции клеток, которые могут быть неполностью чистыми, однако не должны содержать никаких ин- тактных, способных размножаться клеток.

Для образования гибрида не используют в качестве вырожденной клетки НАТ-чувствительную клетку, Перманентно линии клеток, которые не обладают НАТ-чувствительностью используют для приготовления фрагментов для слияния.

При описании конкретных примеров используются следующие сокращения и товарные названия:

антитело; иммуноглобулин;

тяжелая или легкая протеиновая цепь Igмолекул;

Q

|5

0 5 0

5

0

5

0

5

пристан НАТ-се-лекционная среда 2,6,10,14-тетраметил- пентадекан;

ТК HGPRT

EBV MuLV

CD

ДМСО ДМЕМ

FKS .Ficoll

ПЭГ PBS

POD ABTS

EBSS

RPM1-1640

Трис

PDL

MNC

hTSH

|5-hTSH FA

CFA IFA

Мето- цель- 1500

питательная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимиднн;

тимидин-киназа; гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза;

Эпштейн-Барр-вирус; лейкемийный ышиный вирус Abelson; цитоплазмин В, антибиотик (ALDRICH BIOCHEMICALS, Milwan- kee, США); диметилсульфоксид; эссенциальная минимальная среда Dulbecco; эмбриональная телячья сыворотка;

полимерный тростниковый сахар (сахароза), РНАРчМАС1А; полиэтиленгликоль; буферированный фосфатом рассол; пероксидаза; аммониевая соль 2,2- -азино-ди-(3-зтилбензо- тиазолин-6-сульфокис- лоты);

равновесный солевой раствор Earle; Rosewell Park Memory Institut (среда); трис(оксиметил)-амино- метан;

периферические лимфоциты крови;

мононуклеиновые клетки (лимфоциты, моноциты); человеческий, стимулирующий Thyreoidea гормон; -цепь;

вспомогательное средство Freund; полное вспомогательное средство Freund; неполное вспомогательное средство Freund;

метилцеллюлоза (FL и КА);

пузырек f.)€ M5priHHort цитоплазмы (цитоплазма - мембрана - пузырек) ;

FITC-Covaspheres

- флуоресцинизотиоцианат в 1аарог1идпой форме (COVAIENT TECHNICAL Ann Arbor, Мич. ClUA); EAZ- асцитные клетки Эрлиха

(АТСС; CCL, 77). П р- и м е р 1 .

А. Получение кариопластов и цито- пластов из мьшгиньгх миеломных клеток линии РЗ X 63 Ag 8.653 АТС No-CR L 1580.

А.1. Цитохалазин В (СВ, Aldrick Biochemicals, Milwaakee, США) раство ряют в диметилсульфоксиде (ДМСО,, Merek; 2 мг/мл) и хранят в качестве основного раствора при U°C.

Ficoll-400 (Pharmacia; полимери- зованная сахароза) растворяют в бидистиллированной воде (1 г/мл), автоклавируют и хранят в виде основного раствора при -20°С.

Однократной и двойной концентраци эссенциальную минимальную среду Dulbecco (ДНЕМ), эмбриональную телячью сыворотку (FKS), L-глютамин (200 ммоль/л), стрептомицин-пенициллин Boehringer Mannheim целлюлозо- питратных трубочек стерилизуют путем УФ-облучения.

Линия миеломной клетки Ag 8.653 АТСС CPv L - 1580 : 123, 1548-1550 (1979). Она азагвинин-резистентна, НАТ-чувствительна и не синтезирует ни Н-, ни L- Ig-цепей. Она хранится в ДМЕ11 + 15Z FKS + глютамин + пени- циллин-стрептоми11лн + пируват (-ДМЕМ полная среда) при 37 С в атмосфере с 7% СОг.

А. 2. Методы энуклеации: 8х.10 Ag 8.653 клеток центрифугируют в течени 5 мин при 10 об/мин и повторно суспендируют и 12 мл 1,5%-ного Ficoll- ДПЕМ-СВ-ДМСО-раствора до тех пор, пока не будет получена лишенная комков клеток суспензия. По 3 мл суспензии . клеток няносят на предварительно (за 4 и 12ч) препарированные Ficol -градиенты и покрывают 2 мл не содержащего Ficoll ДМЕМ-СВ-ДМСО-раст вора. Пробирки с градиентами центрифугируют в ультраиентрифуге п течени 60 мин при 25 000 об/мин (31°С).

10

15

рп

о

24744

1о окончании цситр .ц угироняиия CHi j xy раздольно собирают с помощью И1пи ч ци- oiiHi.iro шприца с длинно;; каню.пой макроскопически вилимь1С фракции (полосы) , кажду:о разбалляют питательной средой (ДНЕМ без Д1)бапок) , седимен- тируют путем центрифугирования и снова суспендируют ц свежем ДМЕМ.

Получают следующие А фракции: а) клетки Debnis (на границе межд.у О и 12,5% Ficoll); б) лип1енные ядра цитопласты в области 15-16% Ficoll;

в) ядра без различимого ободка из плазмы и примерно 2% лишенных ядра клеток на границе между 17 и 25% Ficoll; г) содержащие ядра, интакт- ные по морфологическим критериям клетки с хороню различимым ободком из плазмы и немного ндер без ободка из плазмы в качестве седимента на дне пробирок.

Подсчет клеток показывает, что 8x10 Ag 8.653 - клеток в б содержит 1,25x10 цитопластов, в в. - 4x10 кариопластов и Р г)- 1,1x10 предположитель ю интактньгх Клеток.

Б. Слияние клеток селезенки мыши с изолированными кариопластами миело0 мы, цитопластами миеломы и седимент- ными клетками миеломы из опыта А.

Б.1. Сп особствующее слиянию средство i 20 г полиэтиленгликоля (ПЭГ- 4000) расплавляют в автоклаве, охлаждают до 56 С и при этой температуре смешивают с 20 мл ДМКМ;

HAT - селекционная среда: ко всей среде ДНЕМ добавляют аминоптерин

5

-4

0

5

0

5

(4x10 и), тимидин (1x10 М) и гипо- ксантин (3,1x10 и).

Сосуды для культивирования: кластер 24-тканевой культуры и кластер 96-тканевой культуры фирмы Cos tar, Камбридж, Масс., США.

Б. 2. Слияния. Препарированные в опыте А фракции б, в и г раздельно смешивают с клетками селезенки в соотношении 10:1 и седиментируют путем центрифугирования. Падосадочную жидкость тщательно удаляют. К седименту добавляют 0,8 мл 50%-ного раствора ПЭГ (при 37 С в течение 1 мин при постоянном мягком встряхивании) и затем 5 мл ДМЕМ (при комнатной температуре в течение 5 мин). Погле добавки следующих 20 мл ДМЕМ клетки седиментируют, повторно суспещгируют в свежей ДМЕМ -полной (полноценной) среде (5 мл) и размешают на ка) 10,

покрытые питающими клетками 24-ые Costar Tupfcl/Costar пятна, . Отдельные культуры кормят на каждый 1, 2, 3, 7, 10 и 13-й день с помощью ДИЕН-ПОЛНОЙ среды.

Клетки питающего организма (макрофаги брюшной полости), За день до слияния умерщвляют инцухтныи мышей (Balb/c) путем вытяжки. В стерильных условиях в брющную полость шприцом вводят 4-5 мл PBS и спустя 1 мин снова отсасывают. Вымытые клетки промывают ДМЕМ, суспендируют в полной среде до плотности клеток 2x10 в 1 мл и порциями по 0,5 мл размещают на 24-ьпс Costar Tupfel/CoБtar- пят- нах. .

Клетки селезенки. У одной Balb/c- мьши непосредственно перед слиянием в асептических условиях удаляют полностью селезенку и ее клетки суспендируют в ДНЕМ. Клеточные агрегаты и кусочки ткани отфильтровывают через марлю,

EL ISA на иммуноглобулине мьш1и. Пластинки для микротитра покрывают овечьими антителами на мышиный Ig(IgG- фракция; 10 мкг/мл, 0,9%-ного раствора NaCl; 150 мкл раствора антител на Tupfel (пора, пятно). По 100 мкл культуральной надосадочной жидкости пипеткой вносят в покрытые пятна (Tupfel) и инкубируют 1 ч при KOMHat- ной температуре. После отсасывания надосадочной жидкости и 2-кратной промывки Tupfel (пор., пятен) по- крьшают 100 мкл раствора конъюгата РОД с антимьш иным Ig (такое же антитело, как вьш1еуказанное, ковалентно связанное с пероксидазой хрена) и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. После 3-х кратной промывки на Tupfel пипеткой наносят 100 мкл раствора субстрата (ABTS) и фотометрически определяют появление ок- . раски.

Б.З. Препарированные согласно опыту А цитопластные, кариопластные и седиментные фракции параллельно подвергают слиянию с клетками селезенки Balb/c-мыши и размещают на каждые 10 по 1 мл культуры. По 5 частичных культур кормят без (пластина I) и по 5 с добавкий HAT (пластина II).

Вплоть до 21-го дня после слияния ни в одной из пятнообразных пластин не обнаруживают макроскопически или микроскопически рост лимфоидных кле

ток, за исключением пятен 4А, 4В, 4С, ЗС и ЗД на пластине I, которые содержали продукт слияния (-Fusionat) седиментной фракции без НАТ-среды. В этих пятнах уже спустя 5 дн после слияния распознают колонии, которые быстро увеличиваются. На 8-й день после слияния в зти пятна (Tupfel) добавляют НАТ-среду: в течение 4 дн вследствие этого погибают все видимые колонии. Па 27-й день после слияния прежде всего разъединяются, затем примерно на всех пятнах становятся видимыми колонии, которые состоят из крупных шарообразных, прозрачных, растущих не сросшихся клеток. На 65-й день после слияния, за исключением I-3B, II-1A, I1-4A, все пятна заняты множественными колониями лимфоидных клеток. Исследование надосадочиой культуральной жидкости на содержание мьппиного Ig на этот день дает (см. табл. 1) от 5 положительньсх до сильно положительных значений в EL ISA во всех частичных культурах, за исключением вьшгеуказан- ных. не

5

0

содержащих колоний пятен,

Таблица 1

EL ISA дпя доказательства мышиного иммуноглобулина в надосадочной жидкости кулЪтуры опыта Б (65-й день после слияния) : (Tupfel) Пятнообразная пластина для культивирования I : без ПАТ (исключения: 4А, 4В, 4С, ЗС, ЗД: + ПАТ,8-18 дни; 1 - продукт слияния цитоплас- тов; 2 - продукт слияния карио- пластов; 3 - продукт слияния седиментных клеток

55

f 2f

if

Пятнообразная пластина для культивирования II: с ПАТ (1-14 дни отрицательная культура 1 (ДМЕМ-полная

7142А

среда): 010; отрицательная культура 2 (Д1КМ, без FKS): 040; положительная культура 1 (мьпиипая сыворотка ): : 723; положительная культура 2 (мышиная сыворотка 1x10 ): ISOO

Г

8

8x10 liS Sultan-KJieroK n ШО мл R PMl 1640 - пслиой среды, которая содержит 20 (Ц М 8-Ag, культивируют 48 ч. Перехчившие клетки помещают в 10 мл PI1I 1640-полиой среды без 8Ag и выращивают 10 ди. Клетки затем высевают на пластины из мягкого агара, которые бьиж приготовлены

с помощью R PMI 1640-полной среды + 20 л М 8-Ag (примерно 500 клеток на чашку Петри), и помещают в .кубатор. Спустя 9 дн стерильно отделяют изолированно выросшие колоНИИ от поверхности агара и размножают в -R PMI 1640-полной среде + 8-Ag. Клон (обозначается в виде HS- SULTAM-8 Ag-Rl), который вырос при удвоенном времени (примерно 20 ч)

применяется для следующего опыта. HS-R1 клетки НАТ-чувствительны:

Изобретение касается способов приготовления перманентно выращиваемых животных и человеческих.клеток и применения полученных клеток для производства клеточных продуктов. Цель изобретения - упрощение способа, Для этого осуществляют слияние нормальных животных или человеческих клеток в присутствии объединяющих веществ (полиэтиленгликоля или вируса Sendai). Получают фрагмент трансформированных клеток. Прорывают стенку клетки (разрушают) путем лизиса в глицерине с внесением в несодержащий глицерин буферный раствор (при этом лопаются клеточные мембраны) или механически. Центрифугированием отделяют фракции ядер от фракций цитоплазмы и используют все фракции. Фракции цитоплазмы обогащают митохондриями лимфатических или этитоли- альных опухолевых клеток. Приготавливают кариопласты и цитопласты, обрабатывая клетки цитохалазином. Полученные окруженные клеточными мембранами клеточные ядра (кариопласты) и окруженная мембраной, лишенная ядра цитоплазма (ц 1топласты) пригодны для слияния. Фрагменты клеток в свежем состоянии используют непосредственно после их приготовления или позднее, обеспечивая их сохранение в лиофили- зированном состоянии. 2 з.п. ф-лы, 5. табл. О)

1 2 Как видно из

3

табл. 1, слияние кариопластов с клетками мьпчиной селезенки приводит к in vitro размножающимся, выделяюпщм иммуноглобулин клеткам. Хотя только малая часть цитоплазмы злокачественного партнера вводится в гибрид, он не приводит к возможной экстинкиии признака пер- мaнe тнoгo роста. При этом полученные с кариопластами гибридные клетк синтезируются и выделяют мышиньц иммуноглобулин в гибридомных количествах. Отсутствие доли цитоплазмы Ag 8.653 не нарушает соответственно этой продукционной и секреционной способности гибридов кариопласта с клеткой селезенки. Кроме того, из слияния цитопластов с клетками селезенки также следуют клоны клеток, которые in vitro пролиферируют и выделяют антитела.

Пример 2. Фрагментация клеток посредством лизиса глицерином и слияние с человеческими лимфоцитами крови.

Балансирующий солевой раствор Earle (EBSS), питательная среда RPMI 1640, эмбриональная телячья сыворотка (FKS) Boehringer Mannheim 8-азагуанин (8-Ag) Serva (Гейдельберг), Агар (бакто-агар 1614 Difco - фирма Гедингер КГ, Штутгарт)

Человеческая плазмоцитомная линия HS SULTAN АТСС СР. L-1484 в виде кри- огфедохраненного клеточного материала оттаивается по предписанию АТСС и культивируется.

5

я

НАТ-среде с плотностью (1-5)х10 на 1 мл (R PMI-1640-полная среда с

5 0,1 ммоль гипоксантина, 400 И ами- ноптерина, 31 .иМ тимидина), не размножаются и в течение 7 дн полностью погибают.

Человеческие лимфоциты (из пери0 ферической крови: PBL): 300 мл

венозной крови стерильно собирают в гепариновый раствор (2 ед/мл крови) и стандартными методами выделяют фракцию моноядерных клеток (ШС: лимфоциты, моноциты), 3x10 МКС суспендируют в 100 мл R PMI 1640х х10% FKS и для отделения моноцитов инкубируют 24 ч в сосуде для культивирования при 37 С в атмосфере, со0 держащей 5% СО.

Фрагментация клетки нагружаются гл;1церином и подвергаются лизису путем инкубации в 10 /liM трис-НС1-буфере. Ядра отделяют от мембранных пузырьков путем центрифугирования при ускорении 200 g (10 мин, 4 С), эти пузырьки, со своей стороны, седиментируются путем центрифугирования при 5000 g (40 мин, ° 4°С).

Слияние. Примерно 1x10 729 liS-R I ядер с человеческими лимфоцитами суспендируют в R PMI 1640 в соотношении 1:1 и подвергают слиянию посредством ПЭГ, как в примере 1, п. Б 2.

Седимент мембранных пузырьков

О

примерно из 1x10 HS-R I клеток покрывают суспензией 1x10 человеческих

5

5

лимфоцитов и подвергают слиянию посредством ПЭГ.

В контрольной смеси примерно 2x10 HS-RI ядер поглощаются (растворяются) в R PMI 1640-полной среде (без HAT) и культивируются в А-х, 2А-Х Costar-Tupfeln (Costar- пятен) в СО -инкубаторе.

Все слившиеся клетки (Fusionate) и контрольные культуры культивируютс на макрофагах брюшной полости мыши, как в примере 1, в качестве клеток питающего организма.

Доказательство человеческого Ig в надосадочной жидкости культуры: микротитр-Elisa, как в примере 1, п. Б.2. Для покрытия применяют имму- ноадсорбционно очищенное овечье антитело на человеческий Ig. Такая же АК-препарация используется для приготовления конъюгата POD с человечески анти-Ig. Овечья АК реагирует со всем классами человеческих Ig и не проявляет никакой перекрестной реакцион- носпособности с бычьим или мышиным Ig.

Фрагментация благодаря лизису с помощью глицерин-трис-НС1. Обработка разлагает HS-RI-клетки на содержащую ядра фракцию, которая седименти- руется при 200 g, и на лишенную ядер цитоплазмамембранную пузырькову фракцию, которая седиментируется при 5000 g. Под микроскопом не видны ни в одной из обеих фракций интактные nS-Rl-клетки. Ядра окружены более или менее нерегулярно ограниченными обрывками цитоплазмы. Подсчет дает выход ядер 85%. Пузырьковая фракция содержит наряду с небольшим количеством осколков (остатков) в большом количестве пузырьки величиной 0,5- -2 1цМ без распознавае лк составньсх частей ядер.

Культивирование 2x10 ядер в R РМ1-ПОЛНОЙ среде (без ПАТ) не приводит на протяжении 12 дед ни к какому росту HS-RI-клеток.

Культивирование слившихся клеток. Слившиеся клетки (Fusionate) ядра- пимфоциты и цитоплазма - пузырьки- лимфоциты размешиваются на 96, соответственно 102А-Х Costar Tupfeln (Costar- пятен) и культивируются каждый наполовину с или без добавки HAT и R PMI-полной среде на макрофагах мышей. С 2-й недели после слияния появляются колонии лимфоидных

клеток, которые непрерывно увеличиваются по размеру.

Продуцирование человеческого им- i муноглобулина. Па 21-й день после слияния надосадочную жидкость культуры (на 19-й день произведена полная замена среды) исследовали на содержание человеческого иммуноглобулина. Результаты представлены в табл. 2а и б.

Таблица 2а.

EL ISA для доказательства человеческого иммуноглобулина в надосадочной жидкости культуры (слияние кариопластов, 21-й день после слияния)

I + HAT

II142- 744

Таблица 2б

Слияние цитопластов , 21 -и день после слияния,где 1 - ядерная контрольная культура; 2-с HAT; 3 - без ПАТ.

экс риц зна

Таким образом, слившиеся клетки (Fusionate) , которые пригото влены с помощью лизисных фракций, могут культивироваться без НАТ-селекции. Способ намного менее требует затрат на работу, чем экструзия цитохалази- ном В, и дает способный к слиянию материал с высоким выходом. Четкое разделение ядерных и цитоплазма- мембранных фракций не достигается ни одним из обоих способов. Как содержащая преобладающе ядерный материал, так и также содержащая преобладающе цитоплазма-мембранные пузырьки фракция после слияния с человеческими лимфоцитами из крови дает in vitro способные размножаться, АК - продуцирующие клеточные клоны.

Параллельная смесь ядра - лимфоциты - гибриды с и без добавки HAT показывает отрицательные воздействия селекционной среды: с HAT 23% первичных культур Ig - отрицательно и

44

1 2

Если устанавливают величины экстинкцин 0-99 как от от - рицательных до сомнительных , значения 100 - 200- как поло жи тельные

значения более 200

положительные

то

как сильно для полбенных путем слияния ядер культур получается рас - пределение , которое представлено в табл. 3.

Таблица 3

0

только 40% сильно положительно; без HAT свыше 70% сильно положительно и только 4% Ig - отрицательно.

Пример 3. Слияние клеток селезенки иммунизированной мыши с нативными и фрагментированньши клетками миеломы Ag8.653.

Человеческий стимулирующий Thyrcoi- еа гормон .(hlSll) и его изолированная р-цепь (p-hTSH) происходит из Boehringer Mannheim, комплек гной и некомплектной добавки Freund (CFA, IFA) Difco, метоцелий 1500 FI и КА- и FITC - covaspheres von covalent Techn. CO. Ann. Arbor. Мичиган, США.

0

Иммунизация: Balb/c-мыши первично иммунизировались с помощью/5-hTSH gg (40 мкг в CFA, интраперитонеально, 1-й день) и реиммунизировались на 196-й день с помощью hTSH (50 мкг в IFA, интраперитонеально) , на 266-й день с помощью hTSH без добавок интраперито131

иеально, а также на 294-й день с по- моцью hTSH внутривенно.

Клетки селезенки (примерно 1X10 ) получают из одной из иммунизированны мьппей спустя 3 дн после последней реиммулиза1и1и, как в примере 1, п. Б.2, и используют по половине для двух слияний.

Слияние 1. 5x10 клеток Ag 8.653 смешивают, подвергают слиянию, как примере 1, п. Б.2, и культивируют в 48 2А-Х Tupfel (пятен) с помощью клеток макрофагов мьшей в содержащей ПАТ ДНЕМ-ПОЛНОЙ среде.

Слияние 2. 1х10 клеток Ag 8.653 подвергают лизису, как в примере 2, благодаря постепенной обработке с помощью глицерина и 10 juM трис-НС1- буфера. Цитоплазма - мембрано-пу- зырьковая (CIIV) фрак1а1я гранулируется (5.000 g, АО мин, 4°С). Ядерная фракция смешивается с 7x10 клеток селезенки, путем центрифугирования наслаивается на CHV-седимент и по способу, как в примере 1, п. Б.2, посредством ПЭГ подвергают слиянию. Продукт слияния распределяют в ДМЕМ- полной среде на 24-х 24-ьгх Costar- (Costar- nHTeH)-с макрофагами и культивируют без добавки HAT

Специфическое для антигенов маркировки гибридных клеток клонирование : (F1TC) Covaspheres ковалентно наносят с помощью hTSH (TSH-CS) и хранят в 5%-ном растворе азида натрия. Клетки маркируют нанесенными Covaspheres и раскладывают с помощью цитофлю- орографа крупные, обладающие положительной флуоресценцией, клетки отдельно B-Tupfel (пятно) и 96-ые Costar пластины. Пятна (Tupfel) i раньше (на 24 ч) покрываются мьшины- ми макрофагами в ДМЕМ-полной среде.

EL ISA для TSH - специфических антител. Покрытие, инкубация культу- ральной надосадочной жидкости, реакция субстрата и отделение,как в примере 1, п. Б.2. Вместо конъюгата мышиного анти-Ig-POD применяют TSH- -POD-конъюгат. В качестве положительного контроля используют сыворотку hTSH - гипериммунизированной мыши, разбавленную в : в качестве отрицательного контроля служит клон, антитело которого образовано против неприменениого антигена (антидигок- син мыши).

4414

Таким образом, как з культурах из слияния 1 (с интактными Ag8.653- клетками), так и также таковые из слияния 5 (с фрагментами Ag 8.653- лиэиса), на 14-й день во всех пятнах появляются колонии больших лимфоидных клеток.

Результаты осуществленного на

14-й день с культуральной надосадочной жидкостью ELISA для доказательства TSH - специфических антител эксперимента представлены в табл. 4 (во всех частичных культурах проявляется анти-TSH).

Таблица 4

ELISA для доказательства анти- TSH в культуральной надосаточной жидкости на 14-й день после слияния (синтеза): а) слияние 1 (интактный Ag 8.653); б) слияние (синтез) 2(фрагменты Ag 8.653); отрицательный контроль

(даШМ-полная среда):000; положительный контроль (анти-TSH - мьшинная сыворотка) : 362

30

а)

IIIIIIIIl22I 3 4lIIIIlIIIl

А 235 236 212 149 119 212

В109221 119 104176068

С116108 135 139093135

D171128 120 228137145

45 А 271 268 267 286 191 .291 В 288 278 362 317 280 305

С 207 292 252 226 292 271

D 295 376 370 338 310 333

На 15-й день неслившиеся клетки 55 из отдельных пятен слияния 1 и 2 вымывают и раздельных основаниях маркируют специфически TSH-антигеном (основание: гибридомы как правило в качестве В-лимфоцитов несут скрепленно часть синтезированных ими молекул антител н клеточных мембранах, вместе с направленными наружу местами связывания антигенов) и клонируют с помощью клеточного классификатора.

Пример 4. Слияние человеческого PBL с интактными и фрагменти рованными Ag 8.653 клетками.

Инактивированный на поверхности Hepatisis-В-антиген (НВ,; биотест) очищается путем иммуноадсорбции, протеинов сыворотки. EL ISA для доказательства человеческих EBg -антител пластины для микротитра покрывают очищенным ЕВ 5; (20 ед./мл, 0,9%-ный раствор NaCl) Инкубация культураль- ной надосадочной жидкости, реакции конъюгата и субстрата, а также отторжение, как в примере 1, п. Б.2. Вместо антимышиного Ig-POD используют овечий-античеловеческш Ig-POD.

HPBL донора с высоким анти-НВ - титром вьщеляют из 200 мл венозной крови пу тем центрифугирования по градиентам Ficoll. Для увеличения (количества) В-лимфоцитов Т-клеткам придают форму с помощью овечьих эритроцитов и отделяют розетки с помощью второго центрифугирования с градиентами по Ficoll. Фракцию необразующих розетки клеток (HPBL(B)) культивируют при плотност 5x10 клеток в R PHI 1640 + 10% аутологичной плазмы (активируется в течение 30 мин при нагревании до 56°С) примерно с 10 мкг в инкубаторе (смена среды каждые 12ч).

Слияние 1:1x10 предварительно обработанного HPBL(B) смешивают с 1x10 Ag 8.653 и, как в примере 1, п. В.2, подвергают слиянию посредством ПЭГ. Продукт слияния культивируют в R PMI 1640 10% человеческой плазмы + HAT в 4-х 24-ых Costar-Tu pfeln (Costaг- пятeн) .

Слияние 2x1,1x10 Ag 8.653 клеток фрагментируют с помощью глицеринового лизиса. 1x10 Ag 8.653 ядер смешивают с 1x10 HPBL(B) и наносят на седимент пузырьков мем- бранной цитоплазмы (из 1x10 Ag 8.653 клеток). После слияния с ПЭГ продукт слияния культивируют в 4-х 24-ых Costar-Tu pf eln в R PMI 1640 + + lOZ человеческой плазмы (без добавки ПАТ) .

Во всех пятнах слияния 1 и 2 на З-й день появляется сильный рост очень крупных слипшугхся клеток, На 5-й день основную массу не сл1т- шихся клеток осторожно суспендируют и распределяют на две новые 24-е Costar Tupfelo (например, в Al, В1 и С1). На 28-й день в слиянии 1: ма- ленькие колонии в А2 и A3, в остальных пятнах только слипшиеся клетки; в слиянии 2: массивньй рост множественных колоний во всех пятнах, за исключением СЗ. Осуществленный с культуральной надосадочной жидкостью на день ELISA для доказательства человеческого иммуноглобулина со специфичностью против Hepatitis-В-анти- гена дает (см. табл. 5) результат: слияние 1 (интактные Ag 8.653 клетки, культивирование в НАТ-среде) не дает никакой положительной культуры; напротив, 5 из 12 культур слияния 2 (Ag 8.653 фрагменты, культивирование в нормальной среде) отчетливо анти- НВд положительны.

Таблица 5

EL1SA для доказательства человеческой анти-HBs в культуральной надосадочной жидкости в день 35 после слияния: а) слияние 1 (ин- тактный Ag 8.653)j слияние 2 (фрагменты Ag 8.653); отрицательный контроль (анти-НВ - отрицательная человеческая сыворотка): :000; положительный контроль (анти-НВд - положительная человеческая сыворотка) : 185. а)

б)

5

А 010 В 000 С 000

000 003 173

189 553 198 032 000 107

17

Пример 5. Слияние liPBL с фрагментами из линии челонечоской плазмацитомы IIS SUl.TAN.

US SULTAN относится к американской коллекции типов культур (ЛТСС) под кодовым номером CR L-148A в качестве криопредохраняющегося клеточного материала и оттаивается по АТСС-пред- писанию и культивируется.ю

HPBL, как в примере 4, приготовляется одинаковыми донорами и реимму- низируется in vitro с НВ

ют 1 мл растрора ПЭГ, После минутого воздействия ПЭГ - раствор разбавляют путем добавк и К I flI-1640- питательной среды и путем центрифугирования отделяют от клеток. Клетки вносят в R РМ1-среду с 20% плодной (зародьшшвой) телячьей сыворотки

(FKS, ВМ), распределяют на 12 пятен

Ч;

15

35

Слияние: 4x10 MS SULTAN клеток фрагментируют посредством лизиса с глицерином. Пузырьковые фракции мембранной цитоплазмы ссдиментируют при 5500 g (АО мин) и затем наносят смесь примерно 4x10 HS SULTAN ядер и Ах 10 liPBL(B). ПЭГ - слияние осуществляется по примеру 4, Посев продукта слияния осуиествляется на 12 2А-НЫХ Costar-fupfeln в R PMI 16АО + 20% FKS + пируват + инсулин (NOVO 2 ед/мл) + 1% не основных аминокислот (ВМ) 1% метоцелия 1500 без добавки HAT.

Па 1А-Й день после слияния: рост больших, неслипшихся лимфо1щных лоний клеток.

Пример 6. Обессмертивание человеческих Т-лимфош1тов.

Т-лимфоциты выделяют с помощью стандартного способа (придание формы розетки с помощью овечьих эритроцитов, центрифугирование с градиентами по Ficoll) из общей фракции лимфоцитов и тотчас или после 3-дневного культивирования обрабатывают Ehrlich асцитные клетки (АТСС; CCL 77) культивируют в ДМЕИ с 10%-ной лошадиной сыворо -кой и они служат в качестве донора трансформирующих фрагментов. Фрагментацию EAZ осуществляют с помощью глицеринового лизиса. Содержащую преобладающе материал ядер фракцию отделяют путем центрифугирования и отбрасывают. Для трансформации используют обогащенную митохондриями цитоплазма- тическую мембрана-пузырьковую фракцию .(QIV) 5x10 Т-лимфоцитов, нагружают избытком РИА-лектина (Difco), смешивают с СГЛ -фракцией из EAZ и ий- кубируют 20 мин при комнатной температуре. Смесь седиментируют путем центрифугирования, остаточную над- осадочную жидкость удаляют и заменядля культивирования по 1 мл и культивируют при 37°С в содержащей 5% COj-атмосфере. Охарактеризовывание клеток осуществляют руководствуясь поверхностными признаками посредством овечьих эритроцитов (Е) - розе- тировапис и посредством иммунофлу- оресценции при применении обоих специфических для Т-клеток антител ОКТ-3 и флуоресцентно маркированного 20 античеловеческого иммуноглобулина (Ig, фирма Дако) для доказательства типичного для В-клеток мембранного Ig.

В течение первых 1А дн большая 25 часть клеток в культурах погибает. На 21-й день в клеточных остатках колоний проявляются от маленьких до средних размеров клетки, которые непрерывно размножаются. Рост колоний ко- 30 обнаружен во всех 12 Tupfе1п- пятнах, а именно вплоть до 50 колоний на пятно. На 30-й день колонии nepie- водят в более крупные сосуды для культивирования и размножают далее. Клетки анализируют, руководствуясь их поверхностной маркировкой, и получают следующие результаты, %:

Е-розетки - положительные

ОКТ-3 - положительные

А-11 - положительные

Igs положительный

Фрагменты, которые могут получаться из EAZ (перманентная линия клеток мышей) с помощью глицеринового

лизиса, после ПЭГ-слияния с изолированными Т-лимфоцитами производят перманентно растущие в культуре клетки, которые на основании их поверхностной характеристики четко идентифицируются как Т-лимфоциты.

Пример 7. Придание бессмертности человеческим клеткам эндотелия.

Все сосуды для культивирования перед посевом клеток покрывают желатиной, Питательная среда состоит из (1:1) смеси R PMI-16AO и среды 199 (ВМ) с 20% FKS. ЧeJroвeчecкиe клетки эндотелия получают посредством раствора коллагеназы (Cibco) из вен

40

95 90 90 5,

45

50

4Д18

ют 1 мл растрора ПЭГ, После минутого воздействия ПЭГ - раствор разбавляют путем добавк и К I flI-1640- питательной среды и путем центрифугирования отделяют от клеток. Клетки вносят в R РМ1-среду с 20% плодной (зародьшшвой) телячьей сыворотки

(FKS, ВМ), распределяют на 12 пятен

Е-розетки - положительные

ОКТ-3 - положительные

А-11 - положительные

Igs положительный

95 90 90 5,

свеж1гх пуповин и перед трансформацией размножаются в течение 14 дн благодаря предрасположению первичной культуры. Для трансформации растущие как слипшиеся клетки эндотелия отделяют посредством растворм трипсина с EDTA (ВМ) и в суспензии, как описано в примере 6, подвергаются слиянию с С1(У-фракцией из EAZ. Таким образом обработанные клетки высевают в сосуд для культивирования емкостью 75 см при плотности клеток 5x10 на один сосуд и культивируют в COj-инкубаторе. Для контроля при необходимости аликвотную часть клеток эндотелия из первичных культур без фракции CIIV обрабатывают ПЭГ-раствором (кажущееся слияние) и повторно культивируют. Как только клетки на дне сосуда для культивирования образуют сплошные клеточные газоны, то их отделяют с помощью трипсин-EDTA - раствора и в соотношении 1:3 переносят в свежи сосуд для культивирования (-пассаж).

Подвергнутые с помощью CMV-фракци слиянию клетки эндотелия после посева прилипают с эффективностью 20-30% и вырастают в течение 2-3 дн до сливающихся клеточных газонов. Кажущиеся слившимися клетки прикрепляются примерно с одинаковой эффективностью, однако они едва размножаются и в течение 21 дн полностью погибают, не образуя сливаюшяхся клеточных: газонов. Совершенно необработанные клетки эндотелия размножаются до максимальной величины при 3-м пассаже, затем рост останавливается, их освобождают при скатывании со дна сосуда для культивирования и подвергают лизису. В 8 различных сосудах с клетками эндотелия из в целом 18 различных пуповин вырастают, без всяких проблем CIIV-обработанные клетки .в течение 10-го пассажа. Трансформированные клетки эндотелия без потерь в жизнеспособности и способности к делению могут утверждаться в жидком азоте..

Человеческий пуповинные клетки эндотелия без трансформирующей мани- пулящт согласно изобретению могут культивироваться в течение не более 3-х пассажей. Путем слияния обогащенной митохондриями CMV-фракции из ас- цитных клеток Эрлиха свойства культуры клеток эндотелия изменяются так, что они без всякой, проблемы

размножаются свыше критического 3-го пассажа (найдено, что в 23-ем пассаже

клетки находятся без явлений усталости) .

Пример 8. Придание бессмертности человеческим меланомным клеткам.

Содержащую клетки меланомы ткань получают путем хирургического иссе- кания метастаз подвздошных лимфатических узлов, разрезают в стерильных условиях на маленькие кубики и хранят вплоть до слияния в сжиженном азоте. СМУ-фракции из EAZ готовят, как в примере 6.

Перед слиянием содержащий меланом- ные клетки материал оттаивают и посредством обработки трипсином готовят суспензию из отдельньк клеток. Фракцию больших, пигментированных в красно-коричневый цвет меланомных клеток путем центрифугирования с градиентами по Ficoll освобождают от сопровождающих лимфоцитов и как в примере 6 подвергают слиянию с CMV-фракцйей при воздействии ПЭГ (примерно 4х10 меланомных клеток с CMV из примерно 1x10 EAZ). Для контролирования слияния служат 4x10 меланомных клеток, которые обрабатываются без CMV с помощью ПЭГ. Клетки после слияния высевают при их плотности 1x10 на Tupfel (пятно) в R PMI 1640 + 20% FKS и культивируют при в содержащей 5% COj -атмосфере.

40

45

50

55

Во всех 4-х частичных культурах подвергнутые слиянию с CMV-клетки меланомы на 28-й день вырастают в колонии типично пигментированных клеток в форме полуслипшихся клеточных груд, которые непрерывно увеличиваются. В контрольной культуре псевдослившиеся клетки не дают никакого размножения клеток, напротив, клетки на 8-й день показывают уве- личива1бщсеся гранулирование и на 22-й день в культуре наблюдают только обломки клеток.

Человеческие меланомные клетки из криопредохраненной метастазной ткани путем CriV-слияиия могут трансформироваться в способные размножаться и культивироваться in vitro клетки. Псевдослившиеся меланомные клетки равного происхождения, напротив, по211

гибают даже при идентичных условиях культивирования.

Формула изобретения

2474422

обогащенной митохондриями лимфатических или эпителиальных опухолевых клеток.

10 3. Способ по п. 1,отличаю- щ и и с я тем, что ядерную фракцию и фракцию цитоплазмы получают путем механического разрушения или лизиса в глицерине,

15 Приоритет по пунктам 04.05.82 по пп. 1-3; 09.12.82 по п. 1.