СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БЛЮТАНГА КРУПНОГО И МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА (ВАРИАНТЫ) И ВАКЦИНА ПРОТИВ БЛЮТАНГА КРУПНОГО И МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2010 года по МПК A61K39/12 

Описание патента на изобретение RU2391114C1

Группа изобретений относится к области ветеринарии, в частности к ветеринарной вирусологии и биотехнологии.

Известен способ изготовления вакцины универсальной против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающий приготовление посевного атериала вируса блутанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделением вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта (Патент RU 2077583 С1, 20.04.1997).

Способ включает приготовление посевного материала на основе вируса блютанга одного или смеси серотипов в различных комбинациях и культуры перевиваемых клеток ВНК-21/13, инфицирование клеток вирусом, их культивирование, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию, очистку и приготовление целевого продукта с добавлением комплекса гидроокись алюминия с сапонином или масляным адъювантом.

Недостатком известного способа является его сложность, а вакцина, полученная по известному способу, имеет низкую инфекционную и иммуногенную активность.

Задачей заявленной группы изобретений является упрощение способа изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота и увеличение инфекционной и иммуногенной активности полученной вакцины.

Поставленная задача по первому варианту изготовления вакцины решается тем, что в способе изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающем приготовление посевного материала вируса блютанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделение вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта, согласно изобретению в качестве культуры клеток животного используют клетки ВНК-21/13, инфицирование клеток животного проводят заражающей дозой 0,001-0,002 ТЦД50/клетка, а культивирование клеточно-вирусной суспензии ведут при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-3 7,5°С в течение 48-72 часов до содержания жизнеспособных клеток 7-10%, далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5-3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель в конечной концентрации 0,02-0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7-0,8%, перемешивание проводят в течение 1,5-2,0 часов при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С, далее реакционную смесь инкубируют 1,5-2 часа при температуре 36,5-37,5°С и центрифугируют при 8000-9000 об/мин, отделяют антиген в виде супернатанта, антиген концентрируют до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5-7,5 lg ТЦД50/см3, к антигену добавляют адъювант в конечной концентрации 40-65%.

Задача решается также тем, что в качестве адьюванта используют адъювант «ISA 50» или адъювант «ISA 70».

Поставленная задача по второму варианту изготовления вакцины решается тем, что в способе получения вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающем приготовление посевного материала вируса блютанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделение вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта, согласно изобретению в качестве культуры клеток животного используют клетки ВНК-21/13, инфицирование клеток животного проводят заражающей дозой 0,001-0,002 ТЦД50/см3, а культивирование клеточно-вирусной суспензии ведут при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С в течение 48-72 часов до содержания жизнеспособных клеток 7-10%, далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5-3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель в конечной концентрации 0,02-0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7-0,8%, перемешивание осуществляют в течение 1,5-2,0 часов при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С, далее реакционную смесь инкубируют 1,5-2 часа при температуре 36,5-37,5°С и центрифугируют при 8000-9000 об/мин, отделяют антиген в виде супернатанта, антиген концентрируют до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5-7,5 lg ТЦД50/см3, к антигену добавляют сапонин, взятый в конечной концентрации 0,0001-0,0005%, или гидроокись алюминия, или смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятые в массовых соотношениях 1:0,000004-0,0000625, в конечной концентрации 8-25%.

Задача решается также тем, что в качестве пеногасителя используют пеногасители Пента-465П, или Пента-473П, или Пента-483П.

Известно использование пеногасителей Пента-465П (ТУ 2257-001-40245042-98), Пента-473 П (ТУ 2229-062-40245042-2004), Пента-483 П (ТУ 2257-008-40245042-99) при производстве пищевых и кормовых дрожжей, а также на сахарном производстве.

Технический результат, полученный при реализации заявленной группы изобретений, заключается в том, что впервые предложена вакцина против блютанга крупного и мелкого рогатого скота с инфекционной активностью 6,5-7,5 lg ТЦД50/см3. В настоящее время известны 24 серотипа возбудителя блютанга, которые вызывают сходную клиническую картину при заражении восприимчивых животных. Авторами впервые показано, что использование серотипов вируса блютанга 1, 2, 4, 8, 9, 12 и 14 при культивировании на культуре клеток ВНК-21/13 существенно повышает инфекционную и иммуногенную активность целевого продукта, снижая вакцинальную дозу с 4,0 мл до 2,0 мл (внутримышечно для крупного рогатого скота (КРС) и с 2,0 мл до 1,0 мл (внутримышечно для мелкого рогатого скота), что позволяет решить поставленную задачу.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 9 из расчета 0,001 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%, перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-х суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют сапонин до конечной концентрации 0,0001%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 2. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 9 из расчета 0,0015 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8%-ным раствором соды до pH 7,3- Вирус культивируют в течение 60 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,75 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6-7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 7,5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 4°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к смеси добавляют сапонин до конечной концентрации 0,00035%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 3. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 9 из расчета 0,002 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 72 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH 7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 22 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 10 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 6°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют 10%-ный сапонин до конечной концентрации 0,0005% мг/мл, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 4. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 12 из расчета 0,001 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473 П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%, перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют гидроокись алюминия до конечной концентрации 8%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 5. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 12 из расчета 0,0015 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8%-ным раствором соды до pH 7,3. Вирус культивируют в течение 60 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,75 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6-7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 7,5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 4°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к смеси добавляют гидроокись алюминия до конечной концентрации 14%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 6. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 12 из расчета 0,002 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 72 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH 7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3 6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 22 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 10 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 6°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют гидроокись алюминия, взятого в конечной концентрации 25%. перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 7. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 14 из расчета 0,001 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-483П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%, перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,000004, взятых в конечной концентрации 8%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 8. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 14 из расчета 0,0015 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8%-ным раствором соды до pH 7,3. Вирус культивируют в течение 60 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-483П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,75 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6-7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 7,5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 4°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к смеси добавляют смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,000005125, взятых в конечной концентрации 14,25%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 9. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 14 из расчета 0,002 ТТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 72 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-483П в конечной концентрации 0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 22 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 10 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 6°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,0000625, взятых в конечной концентрации 25%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 10. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 1 из расчета 0,001 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,2 и температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,0%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%, перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5 ч, затем каждые 8 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:8 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5 lg ТЦД50/см3 и добавляют адъювант «ISA 70» в конечной концентрации 40%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 11. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 1 из расчета 0,0015 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,3 и температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,3. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,05 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 37°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 1 ч, затем каждые 9 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре 37°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 7,0 lg ТЦД50/см3 и добавляют адъювант «ISA 70» в конечной концентрации 47,5%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 3°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 12. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 1 из расчета 0,002 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,4 и температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH 7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 37,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 1 ч, затем каждые 10 ч. С помощью 22%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:11 и выдерживают 22 мин при температуре 37,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 8 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 7,5 lg ТЦД50/см3 и добавляют адьювант «ISA 70» в конечной концентрации 65%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 13. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 2 из расчета 0,001 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,2 и температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,0%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%), перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5 ч, затем каждые 8 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:8 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5 lg ТЦД50/см3 и добавляют адъювант «ISA 50» в конечной концентрации 40%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 14. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 4 из расчета 0,0015 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,3 и температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,3. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,05 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 37°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 1 ч, затем каждые 9 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре 37°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 7,0 lg ТЦД50/см3 и добавляют адъювант «ISA 50» в конечной концентрации 47,5%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 3°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 15. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 8 из расчета 0,002 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,4 и температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH 7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД50/см3.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 37,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 1 ч, затем каждые 10 ч. С помощью 22%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13.

Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:11 и выдерживают 22 мин при температуре 37,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 8 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 7,5 lg ТЦД50/см3 и добавляют адъювант «ISA 50» в конечной концентрации 65%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

При производстве вакцины полностью исключается необходимость проведения специальных операций для получения вирусного посевного материала, практически полностью исключается необходимость проведения трудоемких операций, связанных с мойкой и подготовкой большого количества сосудов культивирования и многократной боксовой работы с каждым из них. Увеличивается количество полноценного иммуногена с одного и того же объема вируссодержащей клеточной суспензии.

Вакцины, приготовленные согласно изобретению, при более производительном и технологическом способе изготовления обладают большой иммуногенной потенцией и, следовательно, будут более надежно защищать животных от блютанга (катаральной лихорадки) крупного и мелкого рогатого скота.

Похожие патенты RU2391114C1

название год авторы номер документа
ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬГИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ БЛЮТАНГА 2008
  • Балышева Вера Ивановна
  • Жестерев Виктор Иванович
  • Колбасов Денис Владимирович
  • Луницин Андрей Владимирович
  • Новикова Марина Борисовна
RU2378012C1
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2005
  • Закутский Николай Иванович
  • Жестерев Виктор Иванович
  • Конакова Людмила Дмитриевна
  • Цыбанов Содном Жамьянович
  • Чермашенцева Наталья Анатольевна
  • Деев Николай Иванович
  • Юрков Сергей Григорьевич
RU2288007C2
ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА СОРБИРОВАННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ 2004
  • Мищенко Владимир Александрович
  • Гетманский Олег Иванович
  • Ручнов Юрий Евгеньевич
  • Костыркин Юрий Алексеевич
  • Никешина Татьяна Борисовна
  • Жбанова Татьяна Валентиновна
RU2268747C1
ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЭМУЛЬСИОННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ 2004
  • Мищенко Владимир Александрович
  • Гетманский Олег Иванович
  • Ручнов Юрий Евгеньевич
  • Костыркин Юрий Алексеевич
  • Никешина Татьяна Борисовна
  • Жбанова Татьяна Валентиновна
RU2271220C1
ШТАММ "Г 244/11" ВИРУСА БЛЮТАНГА 14 СЕРОТИПА ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ, ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ 2013
  • Новикова Марина Борисовна
  • Вялых Иван Владимирович
  • Балышева Вера Ивановна
  • Куриннов Виктор Васильевич
  • Сидлик Марина Валерьевна
  • Горшкова Татьяна Федоровна
  • Живодеров Сергей Петрович
RU2528057C1
ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА СОРБИРОВАННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ СУХАЯ 2016
  • Самуйленко Анатолий Яковлевич
  • Красочко Пётр Альбинович
  • Еремец Владимир Иванович
  • Албулов Алексей Иванович
  • Гринь Светлана Анатольевна
  • Красочко Павел Петрович
  • Еремец Наталья Киреевна
  • Бобровская Ирина Владимировна
  • Попова Вера Михайловна
  • Мурадян Жора Юрикович
  • Фролова Марина Алексеевна
RU2644339C2
АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЭМУЛЬСИОННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ 2007
  • Мищенко Владимир Александрович
  • Думова Виктория Валентиновна
  • Кононов Александр Владимирович
  • Гетманский Олег Иванович
  • Павлов Дмитрий Константинович
  • Никешина Татьяна Борисовна
  • Костыркин Юрий Алексеевич
  • Зинина Ольга Александровна
  • Гришина Елена Сергеевна
  • Пономарев Алексей Петрович
RU2378017C2
АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ПАРАГРИППА-3, ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЭМУЛЬСИОННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ 2007
  • Мищенко Владимир Александрович
  • Гетманский Олег Иванович
  • Думова Виктория Валентиновна
  • Кононов Александр Владимирович
  • Павлов Дмитрий Константинович
  • Никешина Татьяна Борисовна
  • Костыркин Юрий Алексеевич
  • Гришина Елена Сергеевна
  • Зинина Ольга Александровна
  • Пичугина Екатерина Геннадьевна
  • Шулик Юлия Эдуардовна
  • Пономарев Алексей Петрович
RU2378014C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ 2013
  • Самуйленко Анатолий Яковлевич
  • Зенов Николай Иванович
  • Красуткин Сергей Николаевич
  • Мельник Николай Васильевич
  • Пухова Нина Михайловна
  • Литенкова Ирина Юрьевна
  • Елисеев Анатолий Константинович
  • Абрашин Евгений Васильевич
  • Кожушко Маргарита Юрьевна
  • Маслов Евгений Витальевич
  • Хайкина Людмила Сергеевна
  • Иванова Александра Федоровна
  • Красуткина Светлана Владимировна
RU2538617C2
ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2001
  • Мищенко В.А.
  • Лисицын В.В.
  • Алексанян Р.Л.
  • Никешина Т.Б.
  • Жбанова Т.В.
RU2212896C2

Реферат патента 2010 года СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БЛЮТАНГА КРУПНОГО И МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА (ВАРИАНТЫ) И ВАКЦИНА ПРОТИВ БЛЮТАНГА КРУПНОГО И МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА

Группа изобретений относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота по первому вариану включает приготовление посевного материала вируса блютанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделение вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта. В качестве культуры клеток животного используют клетки ВНК-21/13. Инфицирование клеток животного проводят заражающей дозой 0,001-0,002 ТЦД50/клетка. Культивирование клеточно-вирусной суспензии ведут при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С в течение 48-72 часов до содержания жизнеспособных клеток 7-10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5-3,5 тыс.об/мин. К супернатанту добавляют пеногаситель в конечной концентрации 0,02-0,025%. 3атем при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7-0,8%. Перемешивание осуществляют в течение 1,5-2,0 часов при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С. Далее реакционную смесь инкубируют 1,5-2 часа при температуре 36,5-37,5°С и центрифугируют при 8000-9000 об/мин, отделяют антиген в виде супернатанта. Концентрируют антиген до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5-7,5 lg ТЦД50/см3 и по способу получения вакцины по первому варианту добавляют к антигену адъювант в конечной концентрации 40-65%, а по способу получения вакцины по второму варианту к антигену добавляют сапонин в конечной концентрации 0,0001-0,0005%, или гидроокись алюминия, или смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,000004-0,0000625, в конечной концентрации 8-25%. При производстве вакцины полностью исключается необходимость проведения трудоемких операций, связанных с мойкой и подготовкой большого количества сосудов культивирования и многократной боксовой работы с каждым из них, увеличивается количество полноценного иммуногена с одного и того же объема вируссодержащей клеточной суспензии. Вакцина, приготовленная согласно изобретению, обладает большой иммуногенной потенцией и, следовательно, будет более надежно защищать животных от блютанга. 3 н. и 2 з.п. ф-лы.

Формула изобретения RU 2 391 114 C1

1. Способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающий приготовление посевного материала вируса блютанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделение вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток животного используют клетки ВНК-21/13, инфицирование клеток животного проводят заражающей дозой 0,001-0,002 ТЦД50/клетка, а культивирование клеточно-вирусной суспензии ведут при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С в течение 48-72 ч до содержания жизнеспособных клеток 7-10%, далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5-3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель в конечной концентрации 0,02-0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7-0,8%, перемешивание осуществляют в течение 1,5-2,0 ч при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С, далее реакционную смесь инкубируют 1,5-2 ч при температуре 36,5-37,5°С и центрифугируют при 8000-9000 об/мин, отделяют антиген в виде супернатанта, концентрируют его до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5-7,5 lg ТЦД50/см3, к антигену добавляют адъювант в конечной концентрации 40-65%.

2. Способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота по п.1, отличающийся тем, что в качестве адъюванта используют адъювант «ISA 50» или адъювант «ISA 70».

3. Способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающий приготовление посевного материала вируса блютанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделение вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток животного используют клетки ВНК-21/13, инфицирование клеток животного проводят заражающей дозой 0,001-0,002 ТЦД50/клетка, а культивирование клеточно-вирусной суспензии ведут при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С в течение 48-72 ч до содержания жизнеспособных клеток 7-10%, далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5-3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель в конечной концентрации 0,02-0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7-0,8%, перемешивание осуществляют в течение 1,5-2,0 ч при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С, далее реакционную смесь инкубируют 1,5-2 ч при температуре 36,5-37,5°С и центрифугируют при 8000-9000 об/мин, отделяют антиген в виде супернатанта, концентрируют его до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5-7,5 lg ТЦД50/см3, к антигену добавляют сапонин в конечной концентрации 0,0001-0,0005% или гидроокись алюминия, или смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,000004-0,0000625, в конечной концентрации 8-25%.

4. Способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота по любому из пп.1 и 3, отличающийся тем, что в качестве пеногасителя используют пеногасители Пента-465П, или Пента-473П, или Пента-483П.

5. Вакцина против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, полученная по любому из пп.1 и 2 или по любому из пп.3 и 4.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2010 года RU2391114C1

ШТАММ "ТАПХАР" ВИРУСА БЛЮТАНГА FEBRIS INFECTHIOSA CATARHALISS OVIUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ 1995
  • Вишняков И.Ф.
  • Стрижаков А.А.
  • Новикова М.Б.
  • Луницын А.В.
  • Куриннов В.В.
  • Карпов Г.М.
  • Балышева В.И.
  • Волокитина К.С.
RU2077583C1
US 5833995 A, 10.11.1998
ZA 9005296 A, 27.03.1991.

RU 2 391 114 C1

Авторы

Колбасов Денис Владимирович

Шурыгин Александр Иванович

Малышева Вера Ивановна

Чудин Олег Васильевич

Зенов Николай Иванович

Красуткин Сергей Николаевич

Мельник Николай Васильевич

Луницын Андрей Иванович

Литенкова Ирина Юрьевна

Рахманин Павел Петрович

Крюков Сергей Вениаминович

Тренев Василий Николаевич

Соловьев Борис Васильевич

Балашов Владимир Григорьевич

Кузнецов Дмитрий Павлович

Лозовой Дмитрий Анатольевич

Охапкин Сергей Сергеевич

Дорохин Владимир Васильевич

Даты

2010-06-10Публикация

2008-12-29Подача