СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2006 года по МПК A61K39/295 A61K39/265 A61K39/155 C12N7/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии и касается специфической профилактики инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота посредством вакцинации.

Эти болезни играют ведущую роль в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота, в особенности, в крупных хозяйствах и откормочных предприятиях.

Для профилактики ИРТ и ПГ-3 крупного рогатого скота используют моновалентные и ассоциированные вакцины [1].

Недостатком моновалентных вакцин является то, что они стимулируют образование иммунитета только к одной инфекции, возникает необходимость проведения профилактических обработок против каждой инфекции в отдельности с обязательным разрывом между вакцинациями, что увеличивает затраты труда и удлиняет сроки защиты животных, из-за стрессов и возможных осложнений снижается продуктивность скота.

Известна ассоциированная вакцина для профилактики респираторных болезней крупного рогатого скота, содержащая вирусвакцину против ИРТ JBR-JPV и вирусвакцину против ПГ-3 из аттенуированных штаммов [2].

Недостатком известной ассоциированной вакцины против ИРТ и ПГ-3 является то, что живые инфекционные патогены - аттенуированные штаммы способны вызывать осложнения, обусловленные рекомбинацией вакцинного вируса с полевым изолятом или его реактивацией с развитием секундарных инфекций.

Вторым недостатком использования живых аттенуированных штаммов-возбудителей ИРТ и ПГ-3 является их способность персистировать в организме в латентной форме, что существенным образом ограничивает возможности применения живых вакцин.

По ассоциированным инактивированным вакцинам против ИРТ и ПГ-3 в литературе имеются отдельные сообщения.

Известна ассоциированная инактивированная вакцина для профилактики респираторных болезней крупного рогатого скота, содержащая антиген вируса ИРТ из штамма ТК-А (ВИЭВ) В2, антиген вируса диареи из штамма ВК-1 (В-1) №28, антиген хламидий, инактивированные формалином, и масляный адъювант [3].

Недостатком этой ассоциированной инактивированной вакцины является то, что при ее изготовлении не используют антиген против парагриппа-3, в результате чего данный препарат не создает иммунитет против указанной инфекции и требуется дополнительное применение моновакцин.

Наиболее близкой является ассоциированная инактивированная вакцина против ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота производства ВНИИЗЖ. При ее изготовлении используется антиген вируса ИРТ из штамма ВНИИЗЖ, выращенного в монослое клеток МДВК и антиген вируса ПГ-3 из штамма ВГНК-4, выращенного в суспензии клеток ВНК-21, инактивированные аминоэтиленимином (АЭЭИ), в качестве адъюванта используют ГОА и сапонин [4]. Недостатком способа изготовления этой вакцины является то, что для получения вирусного сырья используют штаммы вирусов ИРТ и ПГ-3, которые репродуцируются в культурах клеток с относительно невысокой инфекционной активностью, в результате чего не обеспечивается необходимое количество в прививной дозе протективных антигенов против указанных болезней.

Целью изобретения является разработка эпизоотологически и экологически безопасной ассоциированной инактивированной вакцины, создающей напряженный иммунитет одновременно против ИРТ и ПГ-3 крупного рогатого скота.

Технический результат изобретения заключается в получении ассоциированной инактивированной вакцины против ИРТ и ПГ-3, обеспечивающей необходимое количество протективных антигенов в прививной дозе. Кроме того, для получения вируса ПГ-3 с высокой биологической активностью используется высокопродуктивная перевиваемая линия клеток почки сайги (ПС). Использование при инактивации вирусов щадящего в антигеном отношении препарата 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетраазациклодекан (теотропин) обеспечивает безопасность и высокую эпизоотологическую (иммунологическую) эффективность вакцины.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Способ изготовления ассоциированной инактивированной культуральной вакцины против инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота включает культивирование вакцинных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 в культуре клеток, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию вируса и добавление адъюванта, при этом в качестве вакцинных штаммов используют штамм ТК-А/К вируса инфекционного ринотрахеита, выращенный в перевиваемой культуре клеток МДВК, с активностью 7,5-8,0 lg ТЦД₅₀/см³, и штамм ПГ/К-2002 вируса парагриппа-3, выращенный в перевиваемой культуре клеток ПС, с активностью 7,5-8,0 lg ТЦД₅₀/см³, после сбора вируссодержащей культуральной жидкости проводят инактивацию вируса каждого штамма теотропином в течение 5-7 суток при температуре 36,5-37,5°С, рН 7,2-7,5, причем к вируссодержащей жидкости каждого штамма добавляют теопропин в конечной концентрации 0,1%, а затем смешивают инактивированные вируссодержащие жидкости обоих штаммов в соотношении 1:1 и добавляют адъювант в количестве 20%, содержащий 19% 6%-ного геля гидроокиси алюминия и 1% 10%-ного раствора сапонина от всего объема вакцины.

Входящие в предлагаемую ассоциированную инактивированную вакцину против ИРТ и ПГ-3 указанные штаммы депонированы в ВГНКИ (№ТК-АК-А/К-ДЕП и №ПГ/К-2002-ДЕП), используются впервые и являются производственными при изготовлении моно- и бивалентной вакцины.

Инактивация раздельно вирусов ИРТ и ПГ-3 теотропином с последующим их смешиванием, добавление в качестве адьюванта 6%-ной гидроокиси алюминия в объеме 19% и 10%-ного раствора сапонина в объеме 1% от общего количества вакцины обеспечивают одновременно индукцию иммунитета против ИРТ и ПГ-3, повышение иммуногенности препарата, проявляющейся в увеличении напряженности и длительности иммунитета. Повышенный защитный эффект вакцины достигается за счет увеличения в 10-100 раз инфекционной активности вирусов ИРТ и ПГ-3 в вируссодержащем материале до инактивации и, соответственно, количества их антигенов в прививной дозе, а также щадящих в антигенном отношении условий инактивации биоматериалов. Результаты оценки инактивированной вакцины предложены в таблице.

Таблица
Сравнительная характеристика эффективности прототипа и предложенного способа изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против ИРТ и ПГ-3.Способ изготовления вакциныШтаммы вирусовКультуры клетокТитр вирусного сырья(lg ТЦ₅₀/см³)ИнактиваторПродолжительность иммунитета (мес)ПримечаниеИРТПГ-3ИРТПГ-3ИРТПГ-3ПредложенныйТК-А/КГП/К-2002МДВКПС7,5-8,07,5-8,0Теотропин12Штаммы впервые использованыПрототипВНИИЗЖВГНКИ-4МДВКВНК-216,88-7,337,33*-7,88Аминоэтиленимин6Вирус, выращенный методом суспензионного культивирования, в сравнении с монослойным способом обладает более низкой иммуногенностью.* Примечание: для получения необходимого количества антигена в прививной дозе требуется концентрирование вирусного сырья, полученного суспензионным методом

Как видно из таблицы, более эффективной в иммунобиологическом отношении оказалась вакцина, полученная предложенным способом.

Пример №1: Производственный аттенуированный вакцинный штамм ТК-А/К вируса ИРТ размножают в перевиваемой культуре клеток почки теленка (МДВК). Культуру клеток заражают указанным вирусом в дозе 0,1-1,0 ТЦД₅₀/клетка. Зараженные культуры в культуральных матрасах или во вращающихся сосудах инкубируют при 36,5-37,5°С в течение 48-72 часов до полного разрушения монослоя. Затем вируссодержащую культуральную жидкость собирают, определяют активность суспендированного в ней вируса и используют для изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против ИРТ и ПГ-3. Вируссодержащую культуральную жидкость инактивируют теотропином в конечной концентрации 0,1% при 36,5-37,5°С, рН 7,2-7,5 в течение 5-7 суток, проверяют в 3 пассажах в культуре МДВК на полноту инактивации вируса.

Производственный вакцинный аттенуированный штамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 размножают в монослое перевиваемой культуры клеток почки сайги (ПС). Культуру клеток заражают указанным вирусом в дозе 0,01-1,0 ТЦД₅₀/клетка. Зараженные культуры в матрасах или во вращающихся сосудах инкубируют при 36,5-37,5°С в течение 96-120 часов, затем вируссодержащую культуральную жидкость собирают, определяют активность и используют для изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против ИРТ и ПГ-3. Вируссодержащую культуральную жидкость инактивируют теотропином в конечной концентрации 0,1% при 36,5-37,5°С, рН 7,2-7,5 в течение 5-7 суток, проверяют в 3 пассажах в культуре ПС на полноту инактивации вируса. Для изготовления 1 литра вакцины используют сырье, содержащее вирус ИРТ - 400 мл, вирус ПГ-3 - 400 мл и 200 мл адъюванта, содержащего 19% 6%-ного геля гидроокиси алюминия (ГОА) и 1% 10%-ного раствора сапонина от всего объема вакцины, тщательно перемешивают полученную смесь компонентов в жидкости, расфасовывают во флаконы.

Пример №2: Полученную ассоциированную инактивированную вакцину против ИРТ и ПГ-3 применяют в неблагополучных по этим болезням хозяйствах и угрожаемых зонах для профилактики ИРТ и ПГ-3 крупного рогатого скота. В животноводческих комплексах откормочного типа клинически здоровых телят с месячного возраста вакцинируют в первые два дня после поступления в хозяйство по группам, обеспечив в последующем сохранение этих групп, разрешая перемещение животных не ранее чем через 2 недели со дня повторной вакцинации. В хозяйствах племенного и репродуктивного типа вакцинируют только клинически здоровых животных, в том числе находящихся под угрозой заражения. Перемещение животных разрешают не ранее чем через 2 недели со дня повторной вакцинации.

Вакцину вводят подкожно по 5 см³ в среднюю часть шеи двукратно с интервалом 14-28 дней. Иммунитет формируется через 2 недели после первой вакцинации и длится не менее 12 месяцев.

Вакцина апробирована на крупном рогатом скоте в условиях хозяйств различного направления, продуктивности и в разной эпизоотической ситуации на территории Орловской области. Эта апробация подтверждает безвредность препарата и его противоэпизоотическую эффективность, проявляемую в усилении иммунизирующей активности компонентов ассоциированной инактивированной вакцины. Защитный уровень ВН-антител у привитых животных данной вакцинной сохранялся 12 месяцев.

Применение ассоциированной культуральной инактивированной вакцины против ИРТ и ПГ-3 позволяет существенно снизить уровень респираторных и других патологий в стадах крупного рогатого скота.

Литература

1. Инфекционные болезни животных. Справочник. П/р Д.Ф. Осидзе. М.: Агропромиздат, 1987, с.19, 47, 99.

2. Патент СРР №58827, С 12 К 5/00, 1975.

3. А.с. СССР №178219, А 61 К 39/118, 1993.

4. Лисицин В.В., Ручнов Ю.Е. и др. Изучение биологических свойств вакцины сорбированной инактивированной против ПГ-3 и ИРТ производства ВНИИЗЖ / Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота. Конф. молод. ученых 27-28 фев. 2002, Владимир, ФГУ ВНИИЗЖ, с.43-49.

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Целью изобретения является разработка эпизоотологически и экологически безопасной ассоциированной инактивированной вакцины, создающей напряженный иммунитет одновременно против ИРТ и ПГ-3 крупного рогатого скота. Способ включает культивирование вакцинных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 в культуре клеток, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию вируса и добавление адъюванта. При этом в качестве вакцинных штаммов используют штамм ТК-А/К вируса инфекционного ринотрахеита, выращенный в перевиваемой культуре клеток МДВК, с активностью 7,5-8,0 lg ТЦД₅₀/см³, и штамм ПГ/К-2002 вируса парагриппа-3, выращенный в перевиваемой культуре клеток ПС, с активностью 7,5-8,0 lg ТЦД₅₀/см³. После сбора вируссодержащей культуральной жидкости проводят инактивацию вируса каждого штамма теотропином в течение 5-7 суток при температуре 36,5-37,5°С, рН 7,2-7,5. Причем к вируссодержащей жидкости каждого штамма добавляют теопропин в конечной концентрации 0,1%, а затем смешивают инактивированные вируссодержащие жидкости обоих штаммов в соотношении 1:1 и добавляют адъювант в количестве 20%, состоящий из 6%-ного геля гидроокиси алюминия и сапонина. Способ позволяет получить эпизоотологически и экологически безопасную вакцину, создающую напряженный иммунитет у привитых животных, стабильную при хранении. 1 табл.

Способ изготовления ассоциированной инактивированной культуральной вакцины против инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота, включающий культивирование вакцинных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 в культуре клеток, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию вируса и добавление адъюванта, отличающийся тем, что в качестве вакцинных штаммов используют штамм ТК-А/К вируса инфекционного ринотрахеита, выращенный в перевиваемой культуре клеток МДВК, с активностью 7,5-8,0 lg ТЦД₅₀/_см ³, и штамм ПГ/К-2002 вируса парагриппа-3, выращенный в перевиваемой культуре клеток ПС, с активностью 7,5-8,0 lg ТЦД₅₀/_см ³, после сбора вируссодержащей культуральной жидкости проводят инактивацию вируса каждого штамма теотропином в течение 5-7 суток при температуре 36,5-37,5°С, рН 7,2-7,5, причем к вируссодержащей жидкости каждого штамма добавляют теопропин в конечной концентрации 0,1%, а затем смешивают инактивированные вируссодержащие жидкости обоих штаммов в соотношении 1:1 и добавляют адъювант в количестве 20%, состоящий из 6%-ного геля гидроокиси алюминия и сапонина.