ШТАММ ГРИБА TRICHODERMA SP. МГ-97, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ЗАЩИТЫ СЕЯНЦЕВ ХВОЙНЫХ ОТ ФУЗАРИОЗОВ Российский патент 2001 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/885 

Изобретение относится к области микробиологии, касается нового штамма гриба Trichoderma МГ-97 и может быть использовано для защиты сеянцев хвойных от фузариозов.

Грибы рода Trichoderma используются в практике защиты растений более 20 лет. Имеющиеся экспериментальные данные свидетельствуют о большом наборе штаммов, используемых в качестве биопродуцента при производстве триходерминов. Однако отсутствие единой оценки комплекса возбудителей болезней растений зачастую создает затруднения в выборе того или иного штамма Trichoderma в отношении конкретного патогена [1, 2].

Учреждениями-разработчиками: ВНИИБМЗР и БелНИИЗРом рекомендованы соответственно штаммы-продуценты Trichoderma harzianum ТФ-17 и Trichoderma lignorum- 205-М-10, обладающие широким спектром борьбы с комплексом болезней овощных культур [3, 4].

В настоящее время микробиологической промышленностью выпускаются триходермины, использующиеся для защиты овощных культур в закрытых и открытых грунтах, и не освоено производство триходерминов для защиты сеянцев хвойных от почвенных патогенов.

Техническим результатом изобретения является штамм гриба Trichoderma sp. МГ-97 ВКПМ F-765, обладающий высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных микроорганизмов из рода Fusarium - возбудителей полегания сеянцев хвойных.

Технический результат достигается использованием штамма гриба Trichoderma sp. МГ-97 ВКПМ F-765 для защиты сеянцев хвойных от фузариозов. Особенностью штамма является высокая конкурентоспособность и скорость роста. Кроме того, для изолята характерно быстрое накопление биомассы и активное спорообразование.

Предлагается применение этого штамма в качестве биопродуцента для создания на его основе экологически безопасных биопрепаратов.

Штамм выделен из почв Маганского лесопитомника Красноярского края (56^o04' с.ш.; 92^o42' в.д.) в 1997 году.

Штамм характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки: Формирует относительно медленно растущие колонии, которые достигают 2-3,5 см в диаметре на 4 сутки (при 20^oC), цвет воздушного мицелия от белого до слегка сероватого, при температуре выше 30^oC наращивании субстратного мицелия замедляется, происходит резкое снижение роста колоний и гриб переходит к стадии конидиегенеза. Спороношение начинается на 5-7 сут., обильное на 12-15 сутки (фиг. 1).

При росте на картофельно-декстрозном агаре штамм дает тускло-желтый пигмент (фиг. 2).

Изолят формирует прозрачные гладкостенные гифы до 3-8 мкм в диаметре. Конидиеносцы тоже прозрачные, утолщенные у основания, просто ветвящиеся. Размер 3-4 мкм на большей части. У основания размер главной оси до 6-8 мкм в диаметре. Первичные отростки сравнительно одинаковые по длине, расположены в парах на одинаковом расстоянии. Верхушки конидиеносцев имеют 2-4 отростка. Отростки конидиеносцев формируют мутовки из 6-7 фиалид, иногда могут образовываться комбинации из фиалид и вторичных отростков (фиг. 3).

Конидии варьируют по форме: от яйцевидных до широко эллиптических со слегка заостренными основаниями, зеленоватые. Размеры конидий: 1,5-2,0 x 2,5-4,5 мкм. Очертания конидий шероховатые, с выемкой в середине. Конидии соседних фиалид объединяются в крупные слизистые массы (фиг. 4).

Культуральные признаки:
Хорошо растет на жидкой синтетической среде Чапека; плотных питательных средах: натуральных (сусло-агар и картофельно-декстрозный агар) и полусинтетической мальт-экстракт агар.

Среда Чапека (г/л): глюкоза - 30; NaNO₃ - 3; KH₂PO₄ - 1; MgSO₄ - 0,5; KCl - 0,5; FeSO₄ - 0,01.

Сусло-агар: пивное сусло (9^oБ) -1 л; агар - 15 г
Мальт - экстракт агар (г/л): мальт-экстракт Difco - 15; агар - 15 г.

По заключению специалистов Красноярской краевой ветеринарной лаборатории данный штамм авирулентен, нетоксичен, не токсикогенен в отношении теплокровных организмов и не вызывает инфекционных заболеваний.

На фиг. 1-6 представлены следующие иллюстрации:
фиг. 1 - спороношение гриба Trichoderma sp. штамм МГ-97 на мальт-агаре;
фиг. 2 - образование диффузного пигмента гриба Trichoderma sp. штамм МГ- 97;
фиг. 3 - строение конидиеносных форм гриба Trichoderma sp.штамм МГ-97;
фиг. 4 - строение конидий гриба Trichoderma sp. штамм МГ-97;
фиг. 5 - культивирование штамма МГ-97 на среде Захарченко;
фиг. 6 - антибиотическая активность гриба Trichoderma sp. штамм МГ-97.

Реализация использования Trichoderma sp. МГ-97 как продуцента биопрепарата для защиты сеянцев хвойных от полегания.

Пример 1. Технология поверхностного периодического культивирования включает несколько этапов:
Посев гриба производят споровой культурой конидий из расчета 1 x 10⁷ на 1 мл питательной среды. В качестве посевного материала используют споровую культуру штамма, выращенную на косяках с сусло-агаром. Из пробирок делают смыв в колбы со стерильной водой, затем определяют концентрацию конидий в полученной суспензии в камере Горяева или методом Брида; и методом пересчета на весь объем питательной среды используют необходимое количество суспензии для засева. Засев производят в колбы Эрленмейера объемом на 250 мл на 100 мл питательной среды. Для максимального спороношения выращивание производят на оптимизированной среде Захарченко следующего состава (г/л): сахароза - 25,44; кукурузный экстракт - 31,8; KH₂PO₄ -3,14; MgSO₄ - 0,645; культивируют штамм в течение 15 суток при 28^oC (фиг.5).

После окончания культивирования мицелиальную пленку отделяют от питательной среды, высушивают до постоянного веса и измельчают на гомогенизаторе; при такой форме биопрепарата отсутствует питательная среда, на которой выращивался гриб.

Полученный биопрепарат представляет собой сухой порошок темно-зеленого цвета, с титром спор 2 x 10¹¹ спор/г.

Пример 2. Споры Trichoderma sp. МГ-97 с твердой среды засевают в жидкую питательную среду Чапека и культивируют при 28^oC. Через 5 и 10 суток культивирования отбирают пробы культуральной жидкости, которые фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор N 8. Затем культуральной жидкостью смачивают стерильные бумажные диски диаметром 5 мм. Высушенные диски раскладывают на питательную среду в чашках Петри, предварительно засеянную "газоном" тест-организмов: Fusarium avenaceum, Fusarium sporotrichiella v. poae, Fusarium momliforme v. lactis; Fusarium nivale, Fusarium gibbosum. Чашки инкубируют в термостате при 26-28^oC в течение 5-7 суток. Контролем служат бумажные диски, смоченные стерильной водой.

Отсутствие роста тест-организма вокруг бумажного диска свидетельствует о наличие антибиотических свойств у гриба Trichoderma sp. МГ-97. По оси ординат откладывают зону отсутствия роста тест-организма в мм. Так, все исследуемые возбудители фузариозного полегания сеянцев хвойных обладали средней и высокой чувствительностью к действию метаболитов штамма (фиг. 6).

Таким образом, штамм Trichoderma sp. МГ-97 может быть использован в качестве продуцента биопрепарата триходермина для биологического контроля возбудителей фузариозного полегания сеянцев хвойных.

Источники информации
1. Третьяков А.П., Щербаков Г.Я., Стирманова Н.И. Штамм микромицета Trichoderma lignorum для производства препарата против фитопатогенных грибов: Пат. 2034468 Россия, МКИ⁶ A 01 N 63/04, C 12 N 1/14 - N 93028450/13. Заявл. 21.06.93, опубл. 10.05.95. Бюл. N 13.

2. Kubota Т. Trichoderma harzianum SK-55 fungus, fungicide containin it, and method of manufacture of the same and its use: Patent 5422107 USA, M.KИ. ⁶ A 01 N 63/00, A 01 N 1/00. Hokkaido Green Kosan, Inc. N 172273; 23.12.1993; N 4-359484.

3. Гринько Н. Н. Применение триходермина в овощеводстве защищенного грунта. - Минск: БелНИИИНТИ. 1992. - 60 с.

4. Штаммы грибов, рекомендуемых для производства препаратов в биолабораториях // Защита растений. - 1989. -N 12. - С. 56-57.

Изобретение относится к области микробиологии, касается нового штамма Trichoderma sp. МГ-97 и может быть использовано для защиты сеянцев хвойных от фузариозов. Штамм Trichoderma sp. МГ-97 выделен из почвы лесопитомника. Депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов под F-765. Штамм обладает высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных микроорганизмов из рода Fusarium - возбудителей полегания сеянцев хвойных. Штамм гриба Trichoderma sp. МГ-97 используется для защиты сеянцев хвойных от фузариозов. Особенностью штамма является высокая конкурентоспособность и скорость роста. Кроме того, для изолята характерно быстрое накопление биомассы и активное спорообразование. 6 ил.

Штамм гриба Trichoderma sp. МГ-97 ВКПМ F 765 (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов), используемый для защиты сеянцев хвойных от фузариозов.