ШТАММ БАКТЕРИЙ CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM - ПРОДУЦЕНТ Н-БУТАНОЛА Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12P7/16 C12R1/145 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению штамма - продуцента н-бутанола, используемого в качестве органического растворителя, биотоплива и основы для синтеза многих промышленно ценных органических соединений.

Известен штамм ВКПМ В-4786, который на субстрате из 6% ржаной муки синтезирует до 7,9 г/л н-бутанола [1].

Ближайшим аналогом заявляемого штамма является штамм Clostridium acetobutylicum №6, который на питательном субстрате из 6% ржаной муки синтезирует до 8,3 г/л н-бутанола [1].

Задача заявляемого изобретения - получить штамм бактерий Clostridium acetobutylicum с повышенным уровнем биосинтеза н-бутанола.

Задача решена путем получения штамма Clostridium acetobutylicum CB 6-1, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10289.

Заявляемый штамм получен путем облучения ультрафиолетом суспензии бактерий штамма Clostridium acetobutylicum №6 и последующей селекции в анаэробных стационарных условиях и обладает следующими характеристиками.

Культурально-морфологические признаки

Через 4 суток роста в анаэробных условиях на агаризованной среде SOL (мас.%): KH₂PO₄ - 0,07; K₂HPO₄ - 0,07; MgSO₄·7H₂O - 0,01; MnSO₄·7H₂O - 0,002; FeSO₄·7H₂O - 0,0015; NaCl - 0,001; ацетат аммония - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,1; пептон - 0,1; цистеин - 0,05; крахмал - 0,1; глюкоза 1; витаминный раствор - 1 мл/л; резазурин - 1 мг/л; вода - остальное; колонии имеют белый центр и ореол с ровными краями. Штрих на анаэробном агаре: поверхность ровная, края ровные.

Клетки в виде одиночных вытянутых палочек.

Физиологические признаки

Сбраживает сахара: гексозы (глюкозу, галактозу, маннозу, фруктозу), пентозы (ксилозу, арабинозу), дисахара (лактозу, сахарозу, мальтозу), олигосахара, крахмал и др.; в качестве источника азота использует пептон и аммонийный.

Штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10289 синтезирует н-бутанол в количестве до 14 г/л на субстратах, содержащих ржаную муку. Устойчив к содержанию в питательном субстрате до 20 мас.% культуральных жидкостей после маслянокислого брожения штаммов Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 или Clostridium butyricum ВКПМВ-9619.

Условия хранения

Штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10289 хранят в лаборатории №12 ФГУП «ГосНИИгенетика» (адрес: 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1) в споровом состоянии на среде следующего состава (мас.%): ржаная мука обдирная - 3; вода - остальное, или на среде MSS (мас.%): KH₂PO₄ - 0,1; K₂HPO₄ - 0,08; MgSO₄·7H₂O - 0,1; FeSO₄·7H₂O - 0,005; ацетат аммония - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,5; цистеин-HCl - 0,05; дрожжевой экстракт - 0,5; пара-аминобензойная кислота - 0,001; глюкоза - 2; вода - остальное.

Пересев осуществляют через полгода на один из питательных субстратов, указанных выше, термостатируют при t=37°C в течение 2-3 суток. Полученную суспензию бактерий хранят при t=4-6°C.

Во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10289 хранят в лиофилизированном виде.

Пример 1. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на 6% водной суспензии ржаной муки

Брожение проводят в лабораторных, статических, строго анаэробных условиях во флаконах общим объемом 120 см³ и рабочим объемом 50 см³, доза посевного материала 5 об.%.

Условия ферментации: рН 4,0-6,3, температура 37°С, 48 ч. Характеристика используемого питательного субстрата: 6% водная суспензия ржаной муки с содержанием крахмала 39 г/л.

В качестве контроля используют родительский штамм Clostridium acetobutylicum №6, который является также ближайшим аналогом. Время его ферментации 72 ч.

Определение количества н-бутанола и других компонентов культуральной жидкости во всех примерах осуществляют методом газохроматографического анализа.

Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что на субстрате, представляющем собой 6% водную суспензию ржаной муки, заявляемый штамм превосходит ближайший аналог как по уровню биосинтеза н-бутанола (9,1 г/л вместо (8,3 г/л)), так и ряду других приведенных в таблице показателей.

Пример 2. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на 6% водной суспензии ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 0,5% по сахарозе

Условия ферментации и контроль, как в примере 1, время ферментации 48 ч для заявляемого штамма и 48 ч - для контроля.

Характеристика используемого питательного субстрата: 6% водная суспензия ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 0,5% по сахарозе (содержание условного крахмала 43,75 г/л).

Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что на субстрате, представляющем собой 6% водную суспензию ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 0,5% по сахарозе заявляемый штамм превосходит ближайший аналог как по уровню биосинтеза н-бутанола (8,6 г/л вместо 8,3 г/л), так и ряду других приведенных в таблице показателей.

Пример 3. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на 6% водной суспензии ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 1,35% РВИ

Условия ферментации и контроль, как в примере 1, но время ферментации для заявляемого штамма 72 ч, а для контроля - 96 ч.

Характеристика используемого питательного субстрата: 6% суспензия ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 1,35% по редуцирующим веществам после инверсии - РВИ (содержание условного крахмала 51,8 г/л).

Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что на субстрате, представляющем собой 6% водную суспензию ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 1,35% РВИ, заявляемый штамм превосходит ближайший аналог как по уровню биосинтеза н-бутанола (14,0 г/л вместо 9,1 г/л), так и ряду других приведенных в таблице показателей.

Пример 4. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на 7% водной суспензии ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 1,35% РВИ

Условия ферментации и контроль, как в примере 1, но для контроля время 54 ч.

Характеристика используемого питательного субстрата: 7% суспензия ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 1,35% по РВИ (содержание условного крахмала 58,3 г/л).

Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что на субстрате, представляющем собой 7% водную суспензию ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 1,35% РВИ, заявляемый штамм превосходит ближайший аналог как по уровню биосинтеза н-бутанола (13,5 г/л вместо 12,3 г/л), так и ряду других приведенных в таблице показателей.

Пример 5. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на ржаной муке с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406

Подготавливают посевной материал штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ-10406. Для этого используют питательный субстрате SOL следующего состава (мас.%): KH₂PO₄ - 0,07; K₂HPO₄ - 0,07; MgSO₄·7H₂O - 0,01; MnSO₄·7H₂O - 0,002; FeSO₄·7H₂O - 0,0015; NaCl - 0,001; ацетат аммония - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,1; пептон - 0,1; цистеин - 0,05; витаминный раствор - 1 мл/л; вода - остальное. Содержание моносахаридов 2%. В качестве источников моносахаридов используют ферментативный гидролизат растительного сырья (кукурузная кочерыжка и др.) с добавками инвертированной мелассы в количестве 1% по сахарозе (мелассу применяют как источник биотина). Питательный субстрат стерилизуют при t=125°C в течение 1 ч. Выращивание ведут в течение 7 суток.

Полученный посевной материал в количестве 10 об.% засевают в биореактор, содержащий питательный субстрат выше указанного состава с концентрацией РВ=2 мас.% и проводят процесс маслянокислого брожения в течение 10 суток.

При приготовлении посевного материала и проведении маслянокислого брожения используют следующий технологический режим: t=37°C, pH 5,2-6,5. рН среды регулируют предпочтительно 25% раствором аммиачной воды.

Выросшую бактериальную биомассу отделяют центрифугированием или сепарированием (5-10 об/мин). Фугат используют при приготовлении питательного субстрата для процесса ацетонобутанольного брожения в количестве 20 мас.%.

Для ацетонобутанольного брожения используют штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10289 (СВ 6-1). Для получения посевного материала культуру засевают в количестве 5 об.% по отношению к объему субстрата. Субстрат стерилизуют при температуре 135°С в течение 1 ч. Брожение проводят в течение 48 ч.

Полученный посевной материал в количестве 3 об.% засевают в биореактор со стерильным питательным субстратом. Состав субстрата (мас.%): ржаная мука - 6, меласса - 0,5 по сахарозе, культуральная жидкость после маслянокислого брожения со штаммом Clostridium tyrobutiricum ВКПМ-10406 - 20, вода - остальное (условный крахмал в субстрате 4,375 мас.%). Время брожения составляет 48 ч.

При приготовлении посевного материала и проведении ацетонобутанольного брожения используют следующий технологический режим: t=37°C, pH 4,0-6,3. рН среды регулируют предпочтительно 25% раствором аммиачной воды.

Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что в предлагаемых условиях заявляемый штамм превосходит ближайший аналог по уровню биосинтеза н-бутанола (8,9 г/л вместо 4,4 г/л), а также ряду других приведенных в таблице 2 показателей.

Пример 6. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на ржаной муке с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium butyricum ВКПМ В-9619

Технологическая схема, субстраты и условия ферментации аналогичны описанным в примере 5. Для проведения процесса ацетонобутанольного брожения используют питательный субстрат с добавкой культуральной жидкости штамма Clostridium butiricum ВКПМ В-9619 в количестве 20 мас.%. Для ацетонобутанольного брожения используют штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10289.

Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что в предлагаемых условиях заявляемый штамм превосходит ближайший аналог по уровню биосинтеза н-бутанола (9,9 г/л вместо 0,15 г/л), а также ряду других приведенных в таблице 2 показателей.

Таким образом, заявляемый штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10289 во всех предложенных условиях ферментации превосходит ближайший аналог по уровню биосинтеза н-бутанола, а срок его ферментации либо короче, либо соответствует таковому у ближайшего аналога.

Источники информации

1. Березина О.В., Синеокий С.П., Великодворская Г.А. и др. Внеклеточная гликозилгидролазная активность клостридий, образующих ацетон, бутанол и этанол // Прикладная биохимия и микробиология. - 2008. - Т.44. - №1.

Штамм бактерий Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10289 получен путем облучения ультрафиолетом суспензии бактерий штамма Clostridium acetobutylicum №6 и последующей селекцией в анаэробных стационарных условиях. При различных условиях ферментации штамм характеризуется повышенным уровнем биосинтеза н-бутанола. Выход н-бутанола составляет 8,3-14 г/л. 2 табл., 6 пр.

Штамм бактерий Clostridium acetobutylicum CB 6-1, ВКПМ В-10289 - продуцент н-бутанола.