ШТАММ БАКТЕРИЙ Clostridium acetobutylicum - ПРОДУЦЕНТ н-БУТАНОЛА Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12P7/16 C12R1/145 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению штамма-продуцента н-бутанола, используемого в качестве органического растворителя, биотоплива и основы для синтеза многих промышленноценных органических соединений.

Известен штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-4786, который на питательном субстрате из 6% водной суспензии ржаной муки синтезирует 7,9 г/л н-бутанола [1].

Ближайшим аналогом заявляемого штамма является штамм Clostridium acelobutylicum №6, который на питательном субстрате из 6% водной суспензии ржаной муки синтезирует до 8,3 г/л н-бутанола [1].

В качестве контрольного будем использовать штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10289, который на 6% водной суспензии ржаной муки с добавкой 1,35% РВИ мелассы синтезирует н-бутанол в количестве до 14 г/л (Заявка на патент РФ 2011105882).

Задача заявляемого изобретения - получить штамм бактерий Clostridium acetobutylicum с повышенным уровнем биосинтеза н-бутанола.

Задача решена путем получения штамма Clostridium acetobutylicum CB-2, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290.

Заявляемый штамм получен путем облучения ультрафиолетом суспензии бактерий штамма Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-4786 с последующей селекцией в анаэробных стационарных условиях и обладает следующими характеристиками.

Культурально-морфологические свойства

Через 4 суток роста в анаэробных условиях на агаризованной среде SOL (мас.%): КН₂РO₄ - 0,07; K₂HPO₄ - 0,07; MgSO₄·7H₂O - 0,01; MnSO₄·7H₂O - 0,002; FeSO₄·7H₂O - 0,0015; NaCl - 0,001; ацетат аммония - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,1, пептон - 0,1; цистеин - 0,05; крахмал - 0,1; глюкоза 1; витаминный раствор - 1 мл/л, резазурин - 1 мг/л, вода - остальное; колонии плоские, центр колонии менее выражен, выглядит как цельная колония без ореола, края неровные. Штрих: поверхность ровная, края ровные.

Клетки в виде одиночных вытянутых палочек.

Физиологические свойства

Сбраживает сахара: гексозы (глюкозу, галактозу, маннозу, фруктозу), пентозы (ксилозу, арабинозу), дисахара (лактозу, сахарозу, мальтозу), олигосахара, крахмал и др.; в качестве источника азота использует пептон и аммонийный.

Штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 синтезирует н-бутанол в количестве до 20 г/л на субстратах, состоящих из суспензии ржаной муки с добавкой мелассы и мальтозы.

Устойчив к содержанию в питательном субстрате до 30 мас.% культуральных жидкостей после маслянокислого брожения штаммов Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 или Clostridium butyricum ВКПМ В-9619.

Условия хранения

Штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 хранят в лаборатории №12 ФГУП «ГосНИИгенетика» (адрес: 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд д. 1) в споровом состоянии на среде следующего состава (мас.%): ржаная мука обдирная - 3; вода - остальное или среде MSS (мас.%): КН₂РO₄ - 0,1; К₂НРO₄ - 0,08; MgSO₄×7H₂O - 0,1; FeSO₄×7Н₂О - 0,005; ацетат аммония - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,5; цистеин-HCl - 0,05; дрожжевой экстракт - 0,5; пара-аминобензойная кислота - 0,001; глюкоза - 2 вода -остальное.

Пересев осуществляют через полгода на один из питательных субстратов, указанных выше, термостатируют при t=37°С в течение 2-3 суток. Полученную суспензию бактерий хранят при t=4-6°C.

Во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 хранят в лиофилизированном виде.

Определение количества н-бутанола и других компонентов культуральной жидкости во всех примерах осуществляют методом газохроматографического анализа.

Пример 1. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на 6% водной суспензии ржаной муки с добавкой мелассы

Ферментацию заявляемого штамма проводят в лабораторных, статических, строго анаэробных условиях во флаконах общим объемом 120 см³ и рабочим объемом 50 см³, доза посевного материала 4 об.% при рН 4,0-6,3, температуре 37°С, в течение 96 ч.

Характеристика используемого питательного субстрата: 6% водная суспензия ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 0,5% по сахарозе (содержание условного крахмала 43,75 г/л).

Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что на субстрате, представляющем собой 6% водную суспензию ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 0,5% по сахарозе, заявляемый штамм превосходит ближайший аналог, родительский и контрольный штаммы как по уровню биосинтеза н-бутанола (9,4 вместо 8,3, 8,4 и 8,5 г/л, соответственно), так и ряду других приведенных в таблице показателей.

Пример 2. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на 7% водной суспензии ржаной муки

Условия ферментации, как в примере 1, но время ферментации для заявляемого штамма 54 ч, для контроля и ближайшего аналога - 96 ч, для родительского 120 ч.

Характеристика используемого питательного субстрата: 7% водная суспензия ржаной муки (содержание крахмала 45,5 г/л).

Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что на субстрате, представляющем собой 7% водную суспензию ржаной муки, заявляемый штамм превосходит ближайший аналог, родительский и контрольный штаммы как по уровню биосинтеза н-бутанола (12 г/л вместо 8,6, 9,0 и 8,8 г/л, соответственно), так и ряду других приведенных в таблице показателей при более коротком времени ферментации.

Пример 3. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на 7% водной суспензии ржаной муки с добавкой мелассы и мальтозы

Условия ферментации, как в примере 1, но время ферментации для заявляемого штамма - 96 ч.

Характеристика используемого питательного субстрата: 7% суспензия ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 0,5% по сахарозе и 1% мальтозы (содержание условного крахмала 59,75 г/л).

Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что на субстрате, представляющем собой 7% водную суспензию ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 0,5% по сахарозе и 1% мальтозы, заявляемый штамм имеет высокие показатели как по уровню биосинтеза н-бутанола (20 г/л), так и ряду других приведенных в таблице показателей.

Контрольный штамм и штамм-ближайший аналог такой субстрат не сбраживают.

Пример 4. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на субстрате, содержащем картофель и глюкозу

Условия ферментации, как в примере 1, но в течение 48 ч. Остаточная глюкоза - 0,74 мас.%.

Характеристика используемого питательного субстрата (мас.%): картофель - 25,0 г/л (75% влажность, 18% крахмала), уксуснокислый аммоний - 0,15; мел - 0,2; цистеин - 0,05; глюкоза - 5,0 (∑56,3 г/л условного крахмала).

Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что на субстрате, содержащем картофель и глюкозу, заявляемый штамм имеет высокие показатели как по уровню биосинтеза н-бутанола (12,2 г/л), так и ряду других приведенных в таблице показателей. Контрольный штамм и штамм-ближайший аналог такой субстрат не сбраживают.

Пример 5. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на ржаной муке с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 в количестве 8 мас.%

Подготавливают посевной материал штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ-10406. Для этого используют питательный субстрат SOL следующего состава (мас.%): КН₂РO₄ - 0,07; К₂НРO₄ - 0,07; MgSO₄·7H₂O - 0,01; MnSO₄·7H₂O - 0,002; FeSO₄·7H₂O - 0,0015; NaCl - 0,001; ацетат аммония - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,1, пептон - 0,1; цистеин - 0,05; витаминный раствор - 1 мл/л, вода - остальное. Содержание моносахаридов 2%. В качестве источников моносахаридов используют ферментативный гидролизат растительного сырья (кукурузная кочерыжка и др.) с добавками инвертированной мелассы в количестве 1% по сахарозе (мелассу применяют как источник биотина). Питательный субстрат стерилизуют при t=125°C в течение 1 ч. Выращивание ведут в течение 7 суток.

Полученный посевной материал в количестве 10 об.% засевают в биореактор, содержащий питательный субстрат выше указанного состава с концентрацией РВ=2 мас.% и проводят процесс маслянокислого брожения в течение 10 суток.

При приготовлении посевного материала и проведении маслянокислого брожения используют следующий технологический режим: t=37°C, pH 5,2. рН среды регулируют предпочтительно 25% раствором аммиачной воды.

Выросшую бактериальную биомассу отделяют центрифугированием (10 об/мин).

Фугат используют при приготовлении питательного субстрата для процесса ацетоно-бутилового брожения в количестве 8 мас.%.

Для ацетоно-бутилового брожения используют штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 (СВ-2). Для получения посевного материала культуру засевают в количестве 4 об.% по отношению к объему субстрата следующего состава: 6% суспензия ржаной муки, меласса в количестве 0,5% по сахарозе (условный крахмал в субстрате 43,75 мас.%) и культивируют в течение 48 ч.

Полученный посевной материал в количестве 4 об.% засевают в биореактор со стерильным питательным субстратом. Состав субстрата: 6% суспензия ржаной муки, меласса в количестве 0,5% по сахарозе (условный крахмал в субстрате 43,75 мас.%), 8 мас.% культуральной жидкости после маслянокислого брожения со штаммом Clostridium tyrobutiricum ВКПМ-10406.

Процесс ацетоно-бутилового брожения проводят в течение 48 ч.

При приготовлении посевного материала и проведении ацетоно-бутилового брожения используют следующий технологический режим: t=37°C, pH 4,0-6,3. рН среды регулируют предпочтительно 25% раствором аммиачной воды.

Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что в предлагаемых условиях заявляемый штамм имеет высокие показатели по уровню синтеза н-бутанола (9,52 г/л), а также ряду других, приведенных в таблице 2 показателей.

Пример 6. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на ржаной муке с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 в количестве 20 мас.% в течение 48 ч

Условия ферментации, как в примере 5, но с добавлением культуральной жидкости (КЖ) штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 в количестве 20 мас.%.

В качестве контроля использован штамм Clostridium tyrobutyricum №6 - ближайший аналог.

Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что в предлагаемых условиях заявляемый штамм превосходит ближайший аналог по уровню синтеза н-бутанола (5,42 г/л вместо 4,4 г/л).

Таблица 2 Содержание КЖ в питательном субстрате, штамм Время, ч Химический состав отработанной культуральной жидкости, г/л Выход от условного крахмала, % бутанол ацетон этанол кислоты бутанола растворителей масляная уксусная Субстрат - 6% водная суспензия ржаной муки с добавкой мелассы и КЖ Clostridium tyrobutyricum ВКПМ-10406 КЖ 8 мас.% пример №5 Штамм ВКПМ В-10290 (заявляемый) 48 9,52 4,75 1,04 0,67 1,39 21,8 35,0 КЖ 20 мас.% пример №6 Штамм ВКПМ В-10290 (заявляемый) 48 5,42 3,25 0,32 2,17 1,69     КЖ 20 мас.% пример №6 Штамм №6 (ближайший аналог) 48 4,4 2,7 0,3 2,16 1,82 10,0 16,9 КЖ 20 мас.% пример №7 Штамм ВКПМ В-10290 (заявляемый) 96 11,02 5,77 0,69 1,66 2,37 25,2 40,0 КЖ 30 мас.% пример 8 Штамм ВКПМ В-10290 (заявляемый) 96 10,2 5,10 0,83 0,89 1,73 23,3 36,9 Субстрат - 6% водная суспензия ржаной муки с добавкой мелассы и КЖ Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 в количестве 20 мас.% Штамм ВКПМ В-10290 (заявляемый) 48 10,4 5,7 0,7 0,8 1,6 23,8 38,4 Штамм ВКПМ В-10289 (контрольный) 48 9,90 5,19 0,72 1,39 1,67 22,6 36,1 Штамм №6 (ближайший аналог) 48 0,15 0,04 0,03 0,95 0,83 0,3 0,5

Пример 7. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на ржаной муке с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 в количестве 20 мас.% в течение 96 ч

Условия ферментации, как в примере 6, но в течение 96 ч. Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что в предлагаемых условиях заявляемый штамм имеет высокие показатели по уровню синтеза н-бутанола (11,02 г/л), а также ряду других, приведенных в таблице 2 показателей.

Пример 8. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на ржаной муке с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 в количестве 30 мас.%

Условия ферментации, как в примере 7, но с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 в количестве 30 мас.%.

Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что в предлагаемых условиях заявляемый штамм имеет высокие показатели по уровню синтеза н-бутанола (10,02 г/л), а также ряду других, приведенных в таблице 2 показателей.

Пример 9. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на ржаной муке с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium butyricum ВКПМ-9619

Технологическая схема и субстраты аналогичны технологической схеме и субстратам, описанным в примере 5, но для проведения процесса ацетоно-бутилового брожения используют питательный субстрат с добавкой культуральной жидкости штамма Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 в количестве 20 мас.%. Для ацетоно-бутилового брожения используют штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 (СВ-2). Время брожения 48 ч.

Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что в предлагаемых условиях заявляемый штамм превосходит по уровню синтеза н-бутанола как ближайший аналог, так и контрольный (10,4 г/л вместо 0,15 г/л и 9,9 г/л, соответственно), а также превосходит ближайший аналог по ряду других, приведенных в таблице 2 показателей.

Таким образом, заявляемый штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 во всех предложенных условиях ферментации превосходит ближайший аналог по уровню биосинтеза н-бутанола.

Источники информации

1. Березина О.В., Синеокий С.П., Великодворская Г.А. и др. Внеклеточная гликозилгидролазная активность клостридий, образующих ацетон, бутанол и этанол // Прикладная биохимия и микробиология. - 2008. - Т.44. - №1.

Штамм бактерий Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 получен путем облучения ультрафиолетом суспензии бактерий штамма Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-4786 и последующей селекцией в анаэробных стационарных условиях. При различных условиях ферментации штамм характеризуется повышенным уровнем биосинтеза н-бутанола. Выход н-бутанола составляет до 20 г/л на среде, состоящей из суспензии ржаной муки с добавкой мелассы и мальтозы. 2 табл., 9 пр.

Штамм бактерий Clostridium acetobutylicum СВ-2, ВКПМ В-10290 - продуцент н-бутанола.