СПОСОБ ОЦЕНКИ РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРОВИ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине в области гематологии, а именно к гемостазу, и может быть использовано для ранней диагностики нарушения реологических свойств крови.

Наиболее близким к заявленному является способ выявления нарушения реологических свойств крови (RU 2008674 от 28.02.1994).

Отличие заявленного изобретения от известного заключается в том, что для исследования реологических свойств крови у обследуемого оценивают агрегацию эритроцитов и тромбоцитов с последующей обработкой полученных данных системным многофакторным анализом с вычислением общего реологического потенциала, по величине которого можно судить о степени выраженности и направленности нарушения реологических свойств крови у обследуемого.

Целью изобретения является повышение эффективности диагностики реологических свойств крови.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для исследования реологических свойств крови у обследуемого оценивают агрегацию эритроцитов и тромбоцитов. Для этого из вены берется кровь в пластиковую пробирку, затем исследуется агрегация эритроцитов и агрегация тромбоцитов (АТ) с последующей обработкой полученных данных системным многофакторным анализом с вычислением общего реологического потенциала (ОРП), по величине которого можно судить о степени выраженности и направленности нарушения реологических свойств крови у обследуемого.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Взятие крови проводят в утренние часы после 14 часового голодания трижды в течение трех дней подряд. 9 мл крови берут из вены через толстую иглу самотеком в пробирку с цитратом натрия в соотношении 9:1 для оценки агрегации эритроцитов и тромбоцитов.

Агрегация эритроцитов оценивается по степени способности эритроцитов спонтанно агрегировать (Пахрова О.А., Гринева М.Р., Иванов К.С. Методология и клиническое значение исследования реологических свойств крови // Вестник Ивановской медицинской академии. - 2008. - Т13, №1-2. - с.89-98.).

Для оценки агрегации эритроцитов кровь из вены забирают в цитрат натрия в соотношении 9:1 и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. В 96 луночной планшетке заполняют 2 лунки 0,2 мл плазмы обследуемого. Из пробирки удаляется вся плазма и слой лейкоцитов. Эритроциты ресуспепдируются стандартным фосфатным буфером в соотношении 1:4 с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин, что позволяет отмыть их от остатков плазмы при удалении надосадочной жидкости. После этого берется 0,02 мл эритроцитов и ресуспендируется в первой заполненной аутологичной плазмой лунке 96 луночной планшетки, что позволяет получить 10% гематокрит. Затем из этой лунки забирают чистой сухой пипеткой 0,02 мл содержимого и помещают во вторую заполненную лунку, что позволяет получить 1% гематокрит. После этого 1 сетку в камере Горяева заполняют полученной суспензией эритроцитов, выдерживают 3 мин для возникновения спонтанной агрегации и проводят подсчет свободных эритроцитов (в т.ч. 2 эритроцита вместе) и агрегатов, начиная с 3 эритроцитов, соединенных в виде «монетных столбиков») в 2-х больших квадратах камеры (объектив × 40, окуляр × 10). Считаются количество «монетных столбиков» и количество эритроцитов, вовлеченных в них.

На основе полученных данных рассчитываются следующие показатели.

1. Средний размер агрегата (СРА):

СРА=СЭА/КА,

СЭА - сумма всех эритроцитов в агрегатах;

КА - количество агрегатов.

2. Показатель агрегации (ПА):

ПА=(СРА·КА+КСЭ)/(КА+КСЭ),

КСЭ - количество свободных эритроцитов.

3. Процент неагрегированных эритроцитов (ПНА):

ПНА=КСЭ·100/(СРА·КА+КСЭ).

Нормативными значениями для СРА являются 4-5, для ПА 1,05-1,30, для ПНА 80,0-92,0%.

Оценка ВАТ осуществляется следующим способом (Шитикова А.С.и соавт. Метод определения внутрисосудистой активности тромбоцитов и его значение в клинической практике // Клиническая лабораторная диагностика, 1997, №2. - С.23-35). Из иглы, введенной в локтевую вену, сливают 2-3 мл крови на вату и следующие 2 мл наливают в силиконированную центрифужную пробирку с 8 мл раствора 0,125% глутаральдегида. Эту пробирку заполняют в первую очередь до всех других проб, набираемых для исследования системы гемостаза. Полученную кровь сразу же центрифугируют 6 мин при 1000 об/мин. В случае неполного осаждения эритроцитов (супернатант розового цвета) отбирают 2 мл надосадочной жидкости в другую пробирку и центрифугируют в том же режиме в течение 1 минуты. Супернатант разводят раствором глутаральдегида в четыре раза (0,1 мл + 0,3 мл раствора), перемешивают пипеткой и заполняют камеру Горяева, которую помещают на 20 мин в увлажненную чашку Петри.

С целью определения абсолютного содержания тромбоцитов в 10⁹/л крови в заполненной камере Горяева в пяти больших квадратах подсчитывают число всех единичных кровяных пластинок вне зависимости от их формы. Полученную величину для вычисления содержания тромбоцитов в 10⁹/л крови нужно умножить на 5×4×10×5×10⁶=1×10⁹, где первые две цифры - поправки на произведенные в ходе исследования разведения крови, вторые две цифры - поправки, связанные с высотой камеры Горяева (0,1 мм) и с площадью, на которой подсчитывались кровяные пластинки (5 больших квадратов = 1/5 мм²), 10⁶ - коэффициент пересчета 1 мм³ в 1 л. Определив абсолютное содержание тромбоцитов в исследуемой крови, переводят относительные величины отдельных форм тромбоцитов (в %) в абсолютное их содержание в 10⁹/л крови. Абсолютные величины при патологии могут более адекватно отражать изменения в определяемом распределении форм.

В этом же препарате подсчитывают число агрегатов разного размера (т.е. содержащих по 2, 3, 4, 5 и т.д. кровяных пластинок), приходящихся на 500 свободных тромбоцитов. Результат оценивают по распределению агрегатов разного размера, приходящихся на 100 свободных тромбоцитов. Для облегчения анализа распределительной агрегатограммы полученные результаты могут быть суммированы в виде двух величин: 1) числа агрегатов малого размера, содержащих по 2-3 тромбоцита, и 2) числа агрегатов среднего и большого размера, содержащих по 4 и более тромбоцитов. Изменение этих величин в патологических условиях более наглядно выявляет повышение процесса внутрисосудистой активации кровяных пластинок.

Оценка степени агрегации осуществляется также и по относительному числу всех тромбоцитов, вовлеченных в агрегационную реакцию. Последнее может быть выявлено по процентному отношению числа агрегировавших тромбоцитов к общему их числу в препарате (т.е. к сумме свободно лежащих клеток и вовлеченных в агрегацию) по формуле:

,

где x, y, z, и т.д. - число агрегатов соответствующего размера, приходящееся на 500 свободных тромбоцитов.

Эта формула не может быть применена в том случае, когда в препарате имеются необратимые, оптически гомогенные агрегаты или настолько большие, что в них невозможно подсчитать число клеток. В этом случае ограничиваются данными распределения агрегатов разного размера.

Оценка АТ осуществляется следующим способом (Шитикова А.С. В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян. СПб.: 1999. С.49-52).

Кровь забирают с цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин для получения богатой тромбоцитами плазмы (БТП). Часть плазмы отбирают, а оставшуюся центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 20 мин, получая бедную тромбоцитами плазму (БеТП). БТП стандартизируют по числу тромбоцитов путем разбавления исходной БТП аутологичным образцом БеТП (до 200·10⁹/л.). Концентрация кровяных пластинок в исходной БТП подсчитывается в камере Горяева (в 50 больших квадратах). Объемы смешиваемых БТП и БеТП определяют по формуле:

V_БеТП=V_БТП·[(N/200000)-1],

V_БеТП - объем бедной тромбоцитами плазмы,

V_БТП - объем богатой тромбоцитами плазмы,

N - счетная концентрация тромбоцитов в исходной БТП (клеток/мкл).

Из отобранного объема стандартизированной плазмы на предметное стекло наносят 0,02 мл плазмы и разными пипетками по 0,02 мл р-ра индуктора. В качестве агонистов возможно применение АДФ, коллагена, тромбина, адреналина, ристомицина, перекиси водорода в общепринятых концентрациях, а также сочетание индукторов (АДФ + коллаген, АДФ + адреналин, коллаген + адреналин и т.д.) в концентрациях ниже общепринятых (АДФ - 10^-6 М, коллаген - разведение основной суспензией 1:4, тромбин - 0,09 ед/мл, адреналин 2,5×10^-7 М), но достаточных для возникновения агрегации тромбоцитов при взаимопотенциирующем влиянии индукторов. Стеклянной палочкой смешивают плазму с индукторами и включают секундомер. Смесь перемешивают так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром около 2 см.

Покачивая стекло круговыми движениями в проходящем свете осветителя, на черном фоне следят через лупу за возникновением агрегатов. При появлении отчетливых агрегатов, просветлении раствора и прилипании части агрегатов к стеклу секундомер отключают, фиксируя время агрегации тромбоцитов.

Реакцию повторяют 2-3 раза с каждым индуктором, находя среднее арифметическое значение.

Для определения весомости всех полученных параметров и вычисления общего реологического потенциала у обследованных применяется системный многофакторный анализ, позволяющий перевести исследуемые многомерные количественные характеристики с несопоставимыми абсолютными значениями в сопоставимые относительные величины (Углова М.В., Углов Б.А., Архипов В.В., Горшкова Т.В., Петунина Н.А., Оль Т.Л., Прохуровская М.А., Шубин С.И. Применение методов морфометрии и статистического анализа в морфологических исследованиях. Куйбышев, 1982. - 47 с.). Метод дает возможность выразить весь реологический процесс крови единым интегральным показателем. Расчет производился по формулам:

- исследуемый параметр, - нормативный параметр, - относительная разность.

Pi - весовой коэффициент (коэффициент влияния), а - постоянный множитель (в наших исследованиях а=0,1), σ_j - среднеквадротическое отклонение значения в относительных единицах.

S_i ² - дисперсия исследуемого параметра X_i, n_i - количество наблюдений при определении X_i, S₀ ² - дисперсия нормативного параметра Х₀, n₀ - количество наблюдений при определении Х₀.

- величина, интегрально характеризующая реологические свойства крови на момент исследования (в относительных единицах), который считается нормальным при величине от 0 до 0,015 и указывающего на нормальные реологические свойства крови; при уровне от 0,016 до 0,025 реологические свойства крови понижены, что требует повышенного внимания к пациенту и проведения профилактических мероприятий, направленных на оптимизацию условий жизни и рациона питания; при и выше реологические свойства крови резко понижены с риском развития тромбоза, что требует немедленного начала проведения различных видов коррекции для нормализации реологии крови.

Внедрение данного способа ранней диагностики реологических свойств крови у людей дает возможность решить ряд насущных социально-экономических проблем современности. Ранняя диагностика нарушений реологии крови у людей позволит своевременно начинать лечение тромбофиллии, что сократит у людей сроки временной нетрудоспособности, профилактирует инсульты и инфаркты, уменьшит число выходов на инвалидность и снизит смертность среди разного контингента больных.

Пример 1. Больная С. 39 лет, страдающая артериальной гипертонией на протяжении 2 лет, ведущая здоровый образ жизни, обследована во время диспансерного осмотра по поводу артериальной гипертонии. У больной была взята кровь в пластиковую пробирку с последующим исследованием агрегационной активности эритроцитов (СРА=4,8, ПА=1,16, ПНА=82,6%). Агрегация тромбоцитов (АДФ 37,0 с, коллаген 36,0 с, тромбин 55,0 с, H₂O₂ 48,7 с, адреналин 102,1 с, АДФ + адреналин 39,5 с, АДФ + коллаген 29,0 с, адреналин + коллаген 29,9 с) и несколько усиленная внутрисосудистая активность тромбоцитов (ВАТ) (дискоциты 84,0%, диско-эхиноциты 7,0%, сфероциты 5,0%, сферо-эхиноциты 3,0%, биополярные формы 1,0%). Полученные данные были обработаны системным многофакторным анализом с вычислением общего реологического потенциала, составившего , что указывало на нормальные реологические свойства крови у пациентки.

Больной было рекомендовано и далее контролировать артериальное давление и вести здоровый образ жизни.

Спустя 12 недель у больной были вновь оценены агрегация эритроцитов (СРА=4,9, ПА=1,15, ПНА=83,6%), агрегация тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 36,0 с, коллаген 35,0 с, тромбин 56,0 с, H₂O₂ 48,2 с, адреналин 102,6 с, АДФ + адреналин 38,8 с, АДФ+коллаген 30,2 с, адреналин + коллаген 32,1 с) и ВАТ (дискоциты 82,0%, диско-эхиноциты 8,0%, сфероциты 4,0%, сферо-эхиноциты 4,0%, биополярные формы 2,0%). Общий реологический потенциал составлял , указывая на сохранение нормальных реологических свойств крови.

Пример 2. Больная К. 46 лет, страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 6 лет, обследована во время диспансерного осмотра по поводу артериальной гипертонии. У больной была взята кровь в пластиковую пробирку с последующим исследованием агрегационной активности эритроцитов (СРА=5,9, ПА=1,77, ПНА=53,9%), агрегации тромбоцитов (АДФ 30,2 с, коллаген 28,6 с, тромбин 44,2 с, H₂O₂ 38,5 с, адреналин 85,0 с, АДФ + адреналин 32,0 с, АДФ + коллаген 26,2 с, адреналин + коллаген 25,2 с) и внутрисосудистой активности тромбоцитов (ВАТ) (дискоциты 75,5%, диско-эхиноциты 14,5%, сфероциты 6,0%, сферо-эхиноциты 3,0%, биополярные формы 1,0%). Полученные данные были обработаны системным многофакторным анализом с вычислением общего реологического потенциала, составившего , что свидетельствовало о понижении реологических свойств крови.

Больной были рекомендованы гипокалорийная диета (1820 ккал), дозированные физические нагрузки и строгий контроль артериального давления.

Спустя 6 нед были повторно оценены агрегация эритроцитов (СРА=4,9, ПА=1,16, ПНА=82,7%), агрегация тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 37,0 с, коллаген 36,0 с, тромбин 56,2 с, H₂O₂ 49,4 с, адреналин 102,7 с, АДФ + адреналин 38,8 с, АДФ + коллаген 30,9 с, адреналин + коллаген 32,8 с) и ВАТ (дискоциты 81,0%, диско-эхиноциты 9,0%, сфероциты 5,0%, сферо-эхиноциты 3,0%, биополярные формы 2,0%). Общий реологический потенциал составлял , что указывало на нормализацию реологических свойств крови.

Пример 3. Больная Ц. 56 лет, страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 10 лет, обследована во время диспансерного осмотра по поводу артериальной гипертонии. У больной была взята кровь в пластиковую пробирку с последующим исследованием агрегационной активности эритроцитов (СРА=6,1, ПА=1,92, ПНА=42,7%, агрегация тромбоцитов (АДФ 27,5 с, коллаген 25,0 с, тромбин 40,1 с, H₂O₂ 35,2 с, адреналин 81,4 с, АДФ + адреналин 30,1 с, АДФ + коллаген 22,0 с, адреналин + коллаген 23,0 с) и внутрисосудистой активности тромбоцитов (ВАТ) (дискоциты 70,2%, диско-эхиноциты 15,8%, сфероциты 8,0%, сферо-эхиноциты 5,0%, биополярные формы 1,0%). Полученные данные были обработаны системным многофакторным анализом с вычислением общего реологического потенциала, составившего , что указывало на резкое снижение реологических свойств крови и риск развития тромбоза.

Больной были рекомендованы гипокалорийная диета (1740 ккал), дозированные физические нагрузки, лизиноприл 5 мг утром и амлодипин 10 мг утром.

Спустя 12 недель лечения агрегация эритроцитов (СРА=4,8, ПА=1,17, ПНА=81,6%), агрегация тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 37,4 с, коллаген 36,0 с, тромбин 58,0 с, H₂O₂ 51,0 с, адреналин 102,0 с, АДФ + адреналин 39,4 с, АДФ + коллаген 31,7 с, адреналин + коллаген 33,3 с) и ВАТ (дискоциты 83,5%, диско-эхиноциты 8,5%, сфероциты 4,0%, сферо-эхиноциты 3,0%, биополярные формы 1,0%) нормализовались. Общий реологический потенциал составлял , что указывало на нормализацию реологических свойств крови.

Изобретение относится к медицине в области гематологии, а именно к гемостазу, и может быть использовано для ранней диагностики нарушения реологических свойств крови. Для осуществления способа у обследуемого исследуют агрегацию эритроцитов и тромбоцитов с последующей обработкой полученных данных системным многофакторным анализом с вычислением общего реологического потенциала (ОРП), по величине которого судят о степени выраженности и направленности нарушения реологических свойств крови у обследуемого. Использование изобретения позволяет повысить эффективность диагностики реологических свойств крови и осуществить ее на раннем этапе. Это позволит своевременно начинать лечение тромбофиллии, что сократит у людей сроки временной нетрудоспособности, профилактирует инсульты и инфаркты, уменьшит число выходов на инвалидность и снизит смертность среди разного контингента больных.

Способ оценки реологических свойств крови, отличающийся тем, что одновременно определяют:
агрегацию эритроцитов по среднему размеру агрегатов эритроцитов, показателю агрегации и проценту неагрегированных эритроцитов;
агрегацию тромбоцитов с АДФ, коллагеном, тромбином, адреналином, ристомицином, перекисью водорода в общепринятых концентрациях, а также сочетание индукторов (АДФ + коллаген, АДФ + адреналин коллаген + тромбин), причем, реакцию повторяют 2-3 раза с каждым индуктором, находя среднее арифметическое значение;
внутрисосудистую активность тромбоцитов, в течение трех дней подряд в утренние часы после 14-часового голодания пациента, далее проводят обработку полученных результатов системным многофакторным анализом с определением общего реологического потенциала - величины, интегрально характеризующей реологические свойства крови, при этом, его величина от 0 до 0,015 указывает на нормальные реологические свойства крови; при его величине от 0,016 до 0,025 реологические свойства крови понижены; при его величине 0,026 и выше реологические свойства крови резко понижены с риском развития тромбоза.