СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ГАЛОБАКТЕРИЙ Российский патент 2008 года по МПК C07K14/215 C12N1/20 C12P13/00 C12R1/01 

Изобретение относится к способам культивирования галобактерий и получения синтезируемого ими белка - бактериородопсина.

Известен способ культивирования галобактерий и получения бактериородопсина из биомассы галобактерий. Способ осуществляется в периодическом режиме на питательных средах, включающих гидролизаты белковых веществ (пептон, триптон), источник ростовых факторов - дрожжевой экстракт, глицерин (дополнительный источник углерода), минеральные соли [1]. Недостатками способа являются низкий уровень накопления биомассы галобактерий, невысокий выход бактериородопсина, наличие большого количества каротиноидов, содержащихся в биомассе и затрудняющих последующее выделение бактериородопсина в чистом виде или в составе пурпурных мембран.

Известен также способ получения бактериородопсина и каротиноидов, включающий подготовку посевного материала, глубинное культивирование биомассы галобактерий с электростатической обработкой биомассы, последующее выделение бактериородопсина [2]. Недостатками способа являются невысокий выход бактериородопсина и наличие большого количества каротиноидов в биомассе.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ культивирования галобактерий и получения бактериородопсина, включающий подготовку посевного материала, глубинное культивирование биомассы галобактерий в мембранном биореакторе с контролем содержания кислорода в культуральной жидкости и подпиткой субстратом, удаление ингибиторов роста галобактерий через мембрану и последующее выделение бактериородопсина [3]. Недостатками способа являются невысокий уровень удельного накопления бактериородопсина в биомассе галобактерий, наличие большого количества каротиноидов в биомассе, большой расход питательной среды.

Задачей изобретения является повышение уровня накопления биомассы, увеличение удельного содержания бактериородопсина в биомассе галобактерий и совокупного выхода бактериородопсина при минимальном содержании каротиноидов в биомассе, а также снижение расхода питательной среды.

Поставленная задача решается тем, что для подготовки посевного материала и глубинного культивирования используют инкапсулированный адсорбент и/или антиоксидант, при этом посевной материал с адсорбентом и/или антиоксидантом вносят в емкость с культуральной жидкостью и проводят культивирование до стационарной фазы роста, причем глубинное культивирование проводят путем одновременного засевания биореактора посевным материалом и приведения содержимого биореактора в контакт с инкапсулированным адсорбентом и/или антиоксидантом, при этом содержание кислорода в биореакторе поддерживают на уровне 5-10% от равновесного, а подпитку осуществляют сухим или концентрированным субстратом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Подготовка посевного материала.

Для выращивания галобактерий используется свежеприготовленная среда следующего состава, г/л: NaCl - 250, MgSO₄×7H₂O - 20, KCl - 2, цитрат Na - 3, триптон фирмы Serva - 5, дрожжевой экстракт Organotechnie - 2, глицерин - 4.

Подготовительные операции перед культивированием.

В колбу 1 объемом 250 мл вносится активированный уголь марки АГ-3 в количестве 3 г (30 г активированного угля на 1 л среды культивирования). Гранулы активированного угля заливаются 30 мл среды культивирования, содержащей 2,5-5% агара, колба закрывается ватной пробкой и стерилизуется 30 мин при 0,5 ати. Параллельно в колбе 2 с ватной пробкой в таких же условиях стерилизуется 100 мл среды культивирования.

После стерилизации и охлаждения уголь инкапсулирован в слое агара и хорошо фиксируется на дне колбы 1, в которую вливают стерильную и охлажденную среду культивирования из колбы 2.

В колбу 1 производится засев клеток галобактерий (4 об.% посевного материала). Культивирование проводится на качалке до стационарной фазы роста при освещенности 500-1000 лк, температуре 37-38°С 6 суток. При разных условиях аэрации, что определяется частотой оборотов качалки, накапливается от 3,4 (150 об/мин) до 5,4 (180 об/мин) г/л биомассы галобактерий (по сухим веществам биомассы) с содержанием бактериородопсина от 120 до 140 мг/л среды культивирования. Подготовленный таким образом материал используют в качестве посевного.

Пример 2.

Подготовка посевного материала.

То же, что в примере 1, но вместо активированного угля используют ионообменную смолу АВ-16 ГС (промежуточно-основный анионит) в количестве 3,5 г (35 г на 1 л среды культивирования). При разных условиях аэрации, что определяется частотой оборотов качалки, получается от 3,4 (150 об/мин) до 5,4 (180 об/мин) г/л биомассы галобактерий с содержанием бактериородопсина от 110 до 120 мг/л среды культивирования.

Пример 3.

Подготовка посевного материала.

То же, что в примере 1, но вместо активированного угля и агара в стерильную колбу 1 вносят 50-200 мг антиоксиданта (цистеина, токоферола, сульфита натрия). Выход биомассы 3,4-4 г/л с содержанием бактериородопсина 85-95 мг/л.

Пример 4.

Подготовка посевного материала.

То же, что в примере 1, но после стерилизации и охлаждения инкапсулированного адсорбента в колбу 1 вносят 50-200 мг антиоксиданта (цистеина, токоферола, сульфита натрия). Выход биомассы 3,4-5,4 г/л с содержанием бактериородопсина 120-140 мг/л.

Пример 5.

Подготовка посевного материала.

То же, что в примере 2, но после стерилизации и охлаждения инкапсулированного адсорбента в колбу 1 вносят 50-200 мг антиоксиданта (цистеина, токоферола, сульфита натрия). Выход биомассы 3,4-5,4 г/л с содержанием бактериородопсина 110-120 мг/л.

Посевной материал любого из этих пяти примеров можно использовать в качестве посевного для глубинного культивирования в биореакторе.

Пример 6.

Глубинное культивирование.

В биореактор рабочим объемом 3 л вносят 2,7 л среды состава примера 1 и стерилизуют 40 мин при 0,5 ати. После охлаждения производят засев посевным материалом примеров 1-5 (300 мл - 10 об.% посевного материала). Культивирование проводится при освещенности 500-1000 лк, температуре 37-38°С. Содержание кислорода поддерживается на уровне 5% от равновесного. Через трое суток выход биомассы составляет 3,8 г/л с содержанием бактериородопсина 80-85 мг/л. На четвертые сутки включается прокачка содержимого реактора через емкость с инкапсулированным активированным углем АГ-3 (в расчете 30 г активированного угля на 1 л культуральной жидкости). Предварительно подготавливают патроны с инкапсулированным активированным углем: гранулы активированного угля помещаются в цилиндрическую форму диаметром 15 мм и высотой 50 мм, заливаются 30 мл среды культивирования, содержащей 2,5-5% агара, и стерилизуется 30 мин при 0,5 ати. После охлаждения патроны вынимаются из формы и переносятся в емкость для прокачки культуральной жидкости, которая осуществляется перистальтическим насосом. Прокачка насосом культуральной жидкости осуществляется через сосуд с угольными патронами в условиях хорошего перемешивания. На момент начала прокачки вносят подпитку (в сухом виде триптон с дрожжевым экстрактом и глицерин либо свежеприготовленный стерильный высококонцентрированный раствор этих ингредиентов) состава 15 г триптона, 6 г дрожжевого экстракта, 6 мл глицерина (1 доза подпитки на 3 л культуральной жидкости).

Режим внесения подпиток следующий: на момент начала прокачки (после 3-х суток культивирования) вносят 2 дозы подпитки, через сутки - 3 дозы подпитки, через сутки - 4 дозы подпитки и еще через сутки - 5 доз подпитки. После 8 суток культивирования уровень биомассы 42 г/л с содержанием бактериородопсина 1,55-1,6 г/л.

Пример 7.

Глубинное культивирование.

То же, что в примере 6, но вместо активированного угля используют ионообменную смолу АВ-16 ГС (промежуточно-основный анионит) в количестве 3,5 г (35 г на 1 л среды культивирования). Содержание кислорода поддерживается на уровне 10% от равновесного. После 8 суток культивирования уровень биомассы 40 г/л с содержанием бактериородопсина 1,35-1,4 г/л.

Пример 8.

Глубинное культивирование.

То же, что в примере 6, но вместо прокачки через емкость с инкапсулированным активированным углем на четвертые сутки в биореактор вносят антиоксидант (цистеин, токоферол, сульфит натрия) в расчете 50-200 мг антиоксиданта на 100 мл культуральной жидкости. После чего продолжают культивирование. Содержание кислорода поддерживается на уровне 8% от равновесного. Выход биомассы 36 г/л с содержанием бактериородопсина 950 мг/л.

Пример 9.

Глубинное культивирование.

То же, что в примере 6, но на четвертые сутки в биореактор вносят антиоксидант (цистеин, токоферол, сульфит натрия) в расчете 50-200 мг антиоксиданта на 100 мл культуральной жидкости. После чего продолжают культивирование. Содержание кислорода поддерживается на уровне 6% от равновесного. Выход биомассы 42 г/л с содержанием бактериородопсина 1,55-1,6 г/л.

Пример 10.

Глубинное культивирование.

То же, что в примере 7, но на четвертые сутки в биореактор вносят антиоксидант (цистеин, токоферол, сульфит натрия) в расчете 50-200 мг антиоксиданта на 100 мл культуральной жидкости. После чего продолжают культивирование. Содержание кислорода поддерживается на уровне 9% от равновесного. Выход биомассы 40 г/л с содержанием бактериородопсина 1,35-1,4 г/л.

Прототип.

Подготовка посевного материала Halobacterium halobium штамма R1 осуществлялась в периодическом режиме. Культивирование проводилось в ферментере объемом 2,5 литра с объемом среды 1,3 литра при температуре 37°С и освещении галогеновыми лампами. Доля посевного материала - 2% объема культуральной жидкости. После 60 часов прирост биомассы прекратился. После 85 часов культивирования уровень биомассы составил 1,87 г/л с содержанием бактериородопсина 12 мг/л.

Последующее культивирование проводили сначала в периодическом режиме в биореакторе рабочим объемом 1,4 л при доле посевного материала - 2% объема культуральной жидкости, температуре 37°С, освещении биореактора галогеновыми лампами. При достижении концентрации биомассы 1,78 г/л начинали циркуляцию его содержимого с помощью перистальтического насоса через внешний контур с мембранным модулем с полыми волокнами объемом 0,1 л для удерживания клеток галобактерий в биореакторе и вывода свободного от клеток пермеата из фильтрующего модуля. Свежая среда подавалась с той же скоростью, что удалялся фильтрат при скорости разбавления 0,1 час^-1. В ходе культивирования концентрация растворенного кислорода поддерживалась выше 20% от насыщения путем регулирования скорости перемешивания или добавлением чистого кислорода. Через 10 суток культивирования концентрации клеток и бактериородопсина за 10 дней составили 30,3 г клеток по сухому весу на литр и 282 мг/л соответственно.

Сравнение различных вариантов глубинного культивирования с прототипом приведено в таблице 1.

Таблица 1Предложенные вариантыВремя культивированияСодержание биомассы в конце культивированияСодержание бактериородопсина, мг/лСодержание каротиноидовПример 68 суток42 г/л1,55-1,6 г/лНетПример 78 суток40 г/л1,35-1,4 г/лНетПример 88 суток36 г/л950 мг/лСледыПример 98 суток42 г/л1,55-1,6 г/лНетПример 108 суток40 г/л1,35-1,4 г/лНетПрототип10 суток30,3 г/л282 мг/лПовышенное количество

Предлагаемый способ позволяет резко увеличить выход биомассы галобактерий и бактериородопсина, сократить время получения единицы массы целевого продукта и уменьшить затраты на производство бактериородопсина.

Литература

1. Sehgal S.N., Gibbons N.E. Effect of some metal ions on the growth of Halobacterium cutirubrum. Can. J. Microbiol, 1960, 6, 165-169.

2. Патент США N 5888791, приоритет 15.01.1997.

3. Sang Yup Lee, Но Nam Chang, Young Soon Um, and Soon Ho Hong. Bacteriorhodopsin production by cell recycle culture of Halobacterium halobium. Biotechnology Letters, Vol 20, No8, August 1998, pp.763-765.

При подготовке посевного материала и глубинного культивирования используют инкапсулированный адсорбент и/или антиоксидант. Причем при подготовке посевного материала культивирование ведут в свежеприготовленной питательной среде до стационарной фазы роста. Глубинное культивирование проводят путем одновременного засевания биореактора посевным материалом и приведения содержимого биореактора в контакт с инкапсулированным адсорбентом и/или антиоксидантом. Содержание кислорода в биореакторе поддерживают на уровне 5-10% от равновесного. Изобретение позволяет увеличить выход биомассы галобактерий до 42 г/л с содержанием бактериородопсина до 1,6 г/л при практически отсутствующих каротиноидах в биомассе. При этом сокращается время получения единицы массы целевого продукта и уменьшаются затраты на производство бактериородопсина. 1 табл.

Способ получения биомассы галобактерий, включающий подготовку посевного материала, глубинное культивирование биомассы галобактерий в биореакторе с контролем содержания кислорода в культуральной жидкости на определенном уровне и подпиткой, отличающийся тем, что подготовку посевного материала и глубинное культивирование проводят в присутствии инкапсулированного адсорбента и/или антиоксиданта, причем при подготовке посевного материала культивирование ведут в свежеприготовленной питательной среде до стационарной фазы роста, глубинное культивирование проводят путем одновременного засевания биореактора посевным материалом и приведением содержимого биореактора в контакт с инкапсулированным адсорбентом и/или антиоксидантом, при этом содержание кислорода поддерживают на уровне 5-10% от равновесного.