СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ КАРОТИНСИНТЕЗИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/16 C12N1/38 C12P23/00 C07C403/24 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к области культивирования микроорганизмов для получения кормовых продуктов, и может быть использовано в промышленности для получения биомассы каротинсинтезирующих дрожжей как источника каротиноидов.

Известен способ получения каротиноидов с использованием микроводорослей (патент US 2010184194, 22.07.2010). Предлагается способ выращивания микроводорослей, основанный на изменении соотношения источника углерода к азоту в культуральной среде в процессе культивирования с добавлением цитратов и ацетатов, что позволяет повысить выход каротиноидов.

Известен также способ культивирования микроскопических грибов порядка Mucorales, а именно гетероталличного гриба Blakeslea trispora для микробиологического производства β-каротина (патент RU 2211862 С2, 10.09.2001). Предложен состав питательной среды, в которой в качестве органического источника азота предлагается использовать ячменную муку, соевую муку, гречневую муку, кукурузный экстракт, причем массовая доля этих компонентов питания достаточно велика и составляет от 4,0 до 8,0%. Также обязательным компонентом среды является растительное масло (3,0-6,0 мас.%).

Недостатки вышеуказанных способов состоят в том, что для культивирования микроскопических грибов и микроводорослей используют сложные многокомпонентные питательные среды. При этом не уделяется должного внимания подготовке посевного материала.

За прототип выбран способ стимулирования синтеза β-каротина посредством внесения пероксида водорода в культуру гетероталличного гриба Blakeslea trispora (JAE-CHEOL JEONG, 1999).

Сущность способа заключается в совместном культивировании двух штаммов Blakeslea trispora ATCC 14271 (+) и АТСС 14272 (-) на питательной среде следующего состава: 70 г глюкозы, 2 г L-аспарагина, 1 г дрожжевого экстракта, 1,5 г КН₂РO₄, 0,5 г MgSO₄·7H₂O, 5 мг тиамина гидрохлорида в 1 л дистиллированной воды. рН питательной среды - 5,5. Культивирование проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с содержанием питательной среды 50 мл при 27°С и постоянном встряхивании (180 об/мин). В полуторасуточную культуру Blakeslea trispora вносят 10 µМ пероксида водорода (0,0136 г/л - концентрация пероксида водорода в ферментационной среде). Это позволяет увеличить выход β-каротина на 46%.

Недостатком предлагаемого метода является незначительное увеличение выхода каротиноидов.

Задачей изобретения является увеличение выхода каротиноидов при культивировании каротинсинтезирующих микроорганизмов.

Поставленная задача решается тем, что культивирование микроорганизмов проводят путем последовательных пересевов в количестве не менее 8-10 пассажей при концентрации пероксида водорода в ферментационной среде 5,0-6,5 г/л, внесенного на 24-27 час культивирования, с последующей выдержкой не менее 2 часов, причем в качестве каротинсинтезирующего микроорганизма используют дрожжи Rhodotorula glutinis Y-608.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Объектом исследования являются дрожжи Rhodotorula glutinis ВКПМ Y-608, которые продуцируют такие каратиноиды, как β-каротин, торулин,торулародин. Культивирование дрожжей проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с содержанием питательной среды 50 мл на термостатируемой качалке (оптимальная температура 28-30°С) с числом оборотов 200-220 об/мин при начальном значении рН среды 5,5 в течение 4 суток.

Состав среды для культивирования дрожжей Rhodotorula glutinis ВКПМ Y-608, г/л: КН₂РO₄ - 1,0, (NH₄)₂SO₄ - 5,0, MgSO₄·7H₂O - 0,5, CaCl₂ - 0,1, NaCl - 0,1, дрожжевой экстракт - 0,5, глюкоза - 40,0, вода - водопроводная. Компоненты среды стерилизуют при 0,5 кгс/см² в автоклаве в течение 30 мин.

Вначале готовят посевной материал. Для этого делают смыв культуры стерильной водой с агаризованной среды и переносят в колбу со стерильной питательной средой. Культивирование проводят 1-1,5 суток.

В колбу с питательной средой вносят посевной материал в количестве 10% об. и культивируют в течение 1 суток. На 24-й час культивирования в колбу с дрожжевой суспензией вносят пероксид водорода в количестве 1,0 г/л (концентрация пероксида водорода в ферментационной среде) и продолжают инкубирование в течение 3 суток. В конце процесса культивирования в биомассе дрожжей определяют содержание каротиноидов.

В конце процесса культивирования в биомассе дрожжей определяют количество каротиноидов. Дрожжевые клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием в течение 15 мин при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а оставшиеся капли удаляют с помощью фильтровальной бумаги.

Навеску сырой биомассы растирают в фарфоровой ступке и экстрагируют каротиноиды ацетоном. Экстракт сливают в делительную воронку, а экстракцию проводят до полного обесцвечивания биомассы. Далее каротиноиды в делительной воронке переводят в петролейный эфир. Для получения разделения смеси прибавляют дистиллированную воду. Эфирную фракцию собирают в сухую градуированную пробирку с притертой пробкой. Экстракты фотометрируют на спектрофотометре при длинах волн 450,509 и 537 нм.

Определение концентрации каротиноидов в экстракте, мкг/мл:

С₁=3,9·D₄₅₀+ 1,8· D₃₅₇-3,6· D₅₀₉

С₂= 5,3·D₅₀₉-6,7·D₅₃₇

С₃= 6,7·D₅₃₇-1,1·D_509,

где С₁ - концентрация β-каротина, С₂ - концентрация торулина, С₃ - концентрация торулародина, D₄₅₀ - оптическая плотность экстракта при длине волны 450 нм, D₅₀₉ - оптическая плотность экстракта при длине волны 509 нм, D₅₃₇ - оптическая плотность экстракта при длине волны 537 нм.

Определение общего количества каротиноидов, мкг/г АСБ:

А=(С₁+С₂+С₃)·V/m,

где А - общее количество каротиноидов,V - объем экстракта (мл), m - сухой вес биомассы (г), взятой на экстракцию.

В примерах 2-9 культивирование дрожжей проводят, как в примере 1, а концентрация пероксида водорода в ферментационной среде и полученные результаты сведены в таблицу 1.

Таблица 1 Примеры Концентрация Н₂O₂ в ферментационной среде, г/л Содержание каротиноидов, % от контроля контроль - 100,0 1 1,0 80,9 2 4,0 103,7 3 4,5 127,4 4 5,0 161,9 5 5,5 177,8 6 6,0 217,2 7 6,5 165,7 8 7,0 130,0 9 10,0 73,7

Показано, что пероксид водорода в определенных пределах концентраций оказывает стимулирующее действие на биосинтез каротиноидов дрожжей Rhodotorula glutinis ВКПМ Y-608. Из приведенных примеров 1-9 видно, что при культивировании дрожжей с концентрацией пероксида водорода в ферментационной среде 5,0-6,5 г/л выход каротиноидов увеличивается более чем на 60%, при этом максимальный выход каротиноидов достигается при концентрациии пероксида водорода в ферментационной среде 6,0 г/л и превышает контрольное значение на 117,2%.

В диапазоне концентраций пероксида водорода в ферментационной среде 1,0-4,5 г/л и 7,0-10,0 г/л увеличение выхода каротиноидов незначительно (или ниже контрольного значения) и не превышает заявленного в прототипе.

В примерах 10-14 культивирование дрожжей проводят, как в примере 1, но концентрация пероксида водорода в ферментационной среде составляет 6,0 г/л, а пероксид водорода вносят в среду культивирования на 18, 21, 24, 27 и 30-й часы инкубирования. Полученные результаты сведены в таблицу 2.

Таблица 2 Примеры Концентрация Н₂O₂ в ферментационной среде, г/л Время внесения Н₂О₂ в ферментационную среду, ч Содержание каротиноидов, % от контроля контроль - - 100,0 10 6,0 18 123,7 11 21 143,8 12 24 217,2 13 27 194,1 14 30 145,7

Установлено, что существенное влияние на накопление каротиноидов оказывает время внесения пероксида водорода в ферментационную среду. В примерах 10-14 показано, что при внесении пероксида водорода на 24-27 часы культивирования выход каротиноидов увеличивается на 94,1-117,2%.

Пример 15.

Получение культуры первого пассажа. В колбу с питательной средой вносят посевной материал в количестве 10% об., приготовленный в соответствии с примером 1, и культивируют в течение 1 суток. На 24-й час культивирования в колбу с дрожжевой суспензией вносят пероксид водорода в количестве 6,0 г/л (концентрация пероксида водорода в ферментационной среде) и продолжают инкубирование в течение 3 суток. В конце процесса культивирования в биомассе дрожжей определяют содержание каротиноидов.

Пример 16.

Получение культуры второго пассажа. Через 2 часа после внесения пероксида водорода в ферментационную среду культуры первого (предыдущего) пассажа дрожжевую суспензию в количестве 10% об. переносят в колбу с питательной средой и культивируют в течение 1 суток. Через 24 часа культивирования в колбу вносят пероксид водорода в количестве 6,0 г/л и продолжают инкубирование в течение 3 суток. В конце процесса культивирования в биомассе дрожжей определяют содержание каротиноидов.

В примерах 17-29 культивирование дрожжей проводят как в примере 16, но для каждого последующего пассажа в качестве инокулята используют суспензию дрожжей предыдущего пассажа. Полученные результаты сведены в таблицу 3.

Таблица 3. Пример Пересев/пассаж № Характеристики культивирования Концентрация Н₂О₂ в ферментационной среде, г/л Время внесения Н₂О₂ в ферментационную среду, ч Содержание каротиноидов, % от контроля контроль - - - 100,0 15 1 6,0 24 217,2 16 2 274,8 17 3 297,0 18 4 313,5 19 5 301,5 20 6 322,8 21 7 313,5 22 8 336,9 23 9 336,1 24 10 361,3 25 11 - - 358,3 26 12 377,0 27 13 373,9 28 14 372,0 29 15 247,6

Из приведенных примеров видно, что культивирование дрожжей Rhodotorula glutinis ВКПМ Y-608 необходимо проводить при концентрации пероксида водорода в ферментационной среде 5,0-6,5 г/л, внесенного на 24-27 час инкубирования. При этом выход каротиноидов от пассажа к пассажу существенно увеличивается (примеры 15-24) и в 8-10 пассаже выход каротиноидов увеличивается на 236,1-261,3%, что примерно в 3,5 раза больше по сравнению с контролем (примеры 22-24). Показано, что дрожжевая культура, адаптированная к действию пероксида водорода (примеры 25-28), сохраняет свою активность в отношении биосинтеза каротиноидов в течение не менее четырех последовательных пересевов. Учитывая все эти факторы, можно в значительной степени увеличить выход каротиноидов, а адаптированная культуру дрожжей Rhodotorula gkitinis ВКПМ Y-608 может быть использована в промышленности в качестве источника каротиноидов.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области культивирования микроорганизмов для получения кормовых продуктов, и может быть использовано в промышленности для получения биомассы каротинсинтезирующих дрожжей как источника каротиноидов. Способ предусматривает культивирование культуры микроорганизма, в качестве которого используют дрожжи Rhodotorula glutinis ВКПМ Y-608 при концентрации пероксида водорода в ферментационной среде 5,0 - 6,5 г/л, внесенного на 24-27 час культивирования, и выдержку не менее 2 часов с получением целевого продукта. Изобретение позволяет повысить выход каротиноидов. 3 табл.,29 пр.

Способ получения биомассы каротинсинтезирующих микроорганизмов путем внесения в культуру пероксида водорода, отличающийся тем, что культивирование микроорганизмов проводят путем последовательных пересевов в количестве не менее 8-10 пассажей при концентрации пероксида водорода в ферментационной среде 5,0-6,5 г/л, внесенного на 24-27 час культивирования, с последующей выдержкой не менее 2 часов, причем в качестве каротинсинтезирующего микроорганизма используют дрожжи Rhodotorula glutinis ВКПМ Y-608.