ТЕСТ-СИСТЕМА КОАГУЛЯЦИИ Российский патент 2010 года по МПК B01L3/00 G01N33/49 

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к тест-системе коагуляции для измерения коагуляции крови в образце физиологической жидкости.

Предпосылки создания изобретения

Процесс коагуляции крови является сложным и затрагивает большое число компонентов крови, включая образование волокон фибрина. Эти волокна образуются путем полимеризации молекул белка, называемого фибриногеном. Фибриноген образуется при катализе из энзима, называемого тромбином, который сам образуется при катализе из энзима протромбина.

Тест протромбинового времени (ПВ тест) обычно используют в больницах, клиниках и лабораториях для определения способности пробы крови свертываться. Этот тест широко используется для предоперационных оценок и для антикоагуляционной терапии, назначаемой, например, кардиологическим пациентам. ПВ тест основан на продолжительности времени, необходимого для свертывания образца крови под действием некоторых реагентов, таких как ионы кальция и тромбопластин.

Аналогично пациентам, страдающим заболеваниями сердечно-сосудистой системы и (или) с механическими клапанами сердца, часто назначают лечение с ежедневным приемом разжижающих кровь лекарственных средств, обычно называемых антикоагулянтами. Эффективное количество антикоагулянта в крови должно поддерживаться на уровне, который врач считает правильным. Последствия неправильных количеств антикоагулянта в крови тяжелые, приводящие к нарушению мозгового кровообращения или кровотечению.

Для поддержания такого баланса пациенты вынуждены часто, с высокими затратами и неудобством, посещать клинику, в которой можно тщательно контролировать способность крови свертываться. Мониторинг проводят с периодическими измерениями ПВ в соответствии с Международным нормализованным отношением (показатель состояния системы свертывания крови) - MHO. Например, MHO больше 3 приводит к более высокому риску тяжелого кровотечения, в то время как MHO 6 повышает риск развития сильного кровоизлияния почти в 7 раз, чем у пациентов с MHO ниже 3. В противоположность этому, MHO ниже 2 связано с повышенным риском нарушения мозгового кровообращения. Поэтому мониторинг протромбинового времени рекомендован для обеспечения уровней доз в пределах терапевтического диапазона.

Посредством мониторинга таких компонентов, как уровни фибриногена и протромбина в крови, врач может получить значимые данные в отношении свертывания крови пациента или других клинических состояний. Белки, участвующие в процессе свертывания (коагуляции), обычно называют факторами. Факторы пронумерованы I-XIII, и ссылка на фактор по его номеру идентифицирует соответствующий белок для специалистов.

Активация протромбина происходит в результате действия фактора свертывания крови Ха, который образуется за счет активации фактора Х во время протеолиза. Существуют два молекулярных канала, приводящих к активации фактора Х для получения фактора Ха, в основном упоминаемые как наружный и внутренний каналы свертывания крови. При наружном канале используется только тканевый фактор, специфический для поврежденной мембраны, в то время как при внутреннем канале используются только факторы, являющиеся внутренними для циркулирующей крови. Оба эти канала связаны с взаимодействием энзимов, участвующих в процессе свертывания крови, с поверхностными белками и фосфолипидами.

Предложены различные тесты для измерения коагуляции и при наружном, и при внутреннем каналах пробы крови пациента. Например, при тесте активированного частичного тромбопластинового времени (АРТТ) измеряются факторы коагуляции внутреннего канала. Эти факторы включают факторы XII, XI, X, IX, VIII, V, II и I, которые могут быть аномальны вследствие наследственности, заболевания или влияния гепариновой терапии. Таким образом, АРТТ тест полезен в качестве дооперационного скрининга и для мониторинга гепариновой терапии. Аналогично, тест скорости полимеризации фибриногена с использованием теста тромбинового времени (ТВ) или количественного теста фибриногена обеспечивает полезную диагностическую информацию для пациентов при терапии варфарином (торговое название: Кумадин®) или близкими фармацевтическими препаратами.

Как упомянуто выше, наиболее широко используемым тестом для мониторинга антикоагуляционной терапии является одноэтапный тест протромбинового времени. Измеряемая с помощью ПВ теста реакция следующая:

Кровь+Тромбопластин+Са⁺⁺→Сгусток фибрина

Тромбопластин является препаратом фосфолипида-белка, который активирует свертывание в образцах крови. Тромбопластины имеются в продаже от различных изготовителей и могут быть получены из экстрактов легких, мозга или плаценты, а также синтезированы. В основном, значения ПВ для разных лабораторий не совпадают, таким образом, такие значения неприемлемы для определения терапевтических диапазонов для антикоагуляционной терапии.

Поэтому в начале 1980-х годов Всемирной организацией здравоохранения разработано и принято Международное нормализованное отношение (MHO). Нормализованное отношение призвано обеспечить стандартизацию результатов от различных тромбопластинов и привести в соответствие анализаторы коагуляции. Следовательно, под этим отношением изготовитель присваивает Международный индекс чувствительности (МИЧ) каждой партии тромбопластина, который указывает относительную чувствительность тромбопластина по сравнению с международным референтным тромбопластином. Например, если тромбопластин обладает той же чувствительностью, что и референтный тромбопластин, то МИЧ составляет 1,0. Значение МИЧ больше 1,0 указывает, что тромбопластин не является столь же чувствительным, как референтный тромбопластин. Выражение внизу используется для расчета значения MHO с использованием значения ПВ и значения МИЧ:

Среднее нормальное ПВ определено в каждой лаборатории посредством усреднения значений ПВ на число здоровых людей.

Обнаружение образования сгустков фибрина восходит к середине 1850-х годов, и первоначально обнаружение осуществлялось вручную. К 1910 г. был разработан аппарат для определения изменения вязкости пробы крови по мере ее свертывания. Этот аппарат обеспечивал прямую индикацию напряжения, для которого можно было построить график зависимости от времени свертывания. В 1920-е годы стали известны фотоэлектрические методы обнаружения различных изменений коэффициента пропускания света пробы крови во время свертывания с изменением оптического коэффициента пропускания пробы, наблюдаемого с помощью гальванометра. Последующие исследования коагуляции плазмы крови с использованием улучшенных фотоэлектрических методов проводили в середине 1930-х годов с наблюдением возрастания оптической плотности по мере свертывания крови. Это привело к разработке прибора, который показывает возрастающую плотность по мере образования сгустка.

Следовательно, современные системы регистрации оптической плотности работают по принципу того, что возрастание оптической плотности коагулирующей пробы снижает пропускание света через пробу. В типичной системе регистрации оптической плотности исследуемую пробу крови помещают в прозрачную кювету и наблюдают реакцию со стимулирующим коагуляцию реагентом, таким как тромбопластин. Световое или электромагнитное излучение в видимой или близкой инфракрасной области спектра затем пропускали через смесь плазмы-реагента по мере свертывания пробы. Поскольку биохимическое изменение, приводящее к образованию фибрина, происходит внутри пробы, оптическая плотность пробы возрастает. Выходное напряжение, соответствующее оптической плотности пробы, позволяет после обработки с помощью блока обработки, определить коагуляцию пробы.

В то время как давно признано существование взаимосвязи между уровнями фибриногена (фибрина) и оптической плотностью, возникли широкие разногласия в отношении сущности и правильной методологии измерения этой взаимосвязи, и введено множество параметров тестов для определения уровней фибриногена с использованием данных оптической плотности.

Далее, возросшие познания в отношении негативного влияния нерегулярного времени коагуляции крови, принятие самоконтроля и самолечения привело к разработке множества мониторов коагуляции крови и способов персонального использования и диагностики на месте. Однако этим устройствам еще недостает этапа отработки, экономичности и удобства, известных для систем мониторинга уровня глюкозы на дому у пациентов, страдающих диабетом.

Пример способа и системы для измерения времени коагуляции крови описан в патенте US 4252536. Способ включает обеспечение смеси пробы крови и реагента, воздействие на смесь пучка света и регистрацию света, отраженного от смеси, получение представительного электрического сигнала. Затем по электрическому сигналу определяют время, когда происходит наиболее быстрое изменение электрического сигнала, а затем определяют в качестве конечной точки момент времени перед первым временем, когда происходит изменение, которое составляет 1/n от наиболее быстрого изменения, где n больше 1. Большинство способов измерения времени коагуляции основаны на плазме, вводимой в кювету, и на анализе свойств коагуляции за некоторый период времени.

В ЕР 1162457 описана тест-система для определения соответствующего вещества, способствующего коагуляции для назначения пациенту в качестве терапии для улучшения функции свертывания с использованием трех пробирок с пробами для получения нужного количества крови.

В патенте US 6066504 описана система электродов, которая обеспечивает количественное измерение изменений вязкости за некоторые интервалы времени, что является показателем коагуляции или лизиса пробы крови.

В ЕР 974840 описано жидкостное диагностическое устройство для измерения концентрации аналита или свойств биологической жидкости с использованием оптических устройств регистрации.

В WO 20047/044560 описано фотометрическое определение времени коагуляции в неразбавленной цельной крови с емкостью для приема пробы неразбавленной цельной крови, источником для испускания света и фотоприемником для измерения количества света от указанной емкости.

В патенте US 6084660 описано жидкостное медицинское диагностическое устройство, содержащее у одного конца отверстие для введения пробы и у другого конца надувную камеру для всасывания проб в измерительную область, которое измеряет концентрацию аналита или физическое свойство цельной крови, в частности время коагуляции, только после подтверждения того, что проба цельной крови введена в устройство.

В WO 2002/086472 описано использование флуоресцентных молекулярных роторов, у которых меняется интенсивность флуоресценции в зависимости от вязкости среды. Изобретение дополнительно относится к классу молекулярных двигателей, которые при модифицированной углеводородной цепи или гидрофильной группе позволяют измерить вязкость мембраны или жидкости.

В публикациях заявок на патент US 2002/0110486 А1 и US 2003/0031594 А1 описана тест-полоска, содержащая множество зон реакции, используемых для обеспечения качества. Тест-полоска требует объема примерно 20 мкл крови. Однако если пользователь проводит тест часто, как этого требует правильное выполнение коагуляционной терапии, эти большие объемы проб неудобны и являются недостатком.

В заявке РСТ/ЕР 2004/002284 описан тест-элемент с сухим реагентом для фотометрической регистрации и количественного определения аналита, например глюкозы, в физиологической жидкости, например крови, с системой распределения проб по меньшей мере с двумя чувствительными участками, который снабжен встроенной калибровочной системой и который требует очень малых объемов проб примерно 0,5 мкл.

Однако до настоящего времени не существует тест-системы, которая пригодна для измерения коагуляции пробы крови и которая снабжена встроенным устройством контроля качества и требует только малых объемов проб.

Соответственно в основу настоящего изобретения положена задача обеспечить тест-систему для определения коагуляции цельной крови, которая требует только минимальных этапов, таких как нанесение крови на полоску, которая обеспечивает последующий автоматический расчет точного результата теста, включая средство для контроля качества "на полоске", и которая требует только малого количества пробы.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение способа изготовления тест-элемента коагуляции, который не требует большого числа сложных этапов и, следовательно, является недорогим и применимым для изделий, помогающих пациентам выполнять мониторинг коагуляции крови самостоятельно и(или) у врача.

Сущность изобретения

Соответственно, в настоящем изобретении предлагается тест-элемент для определения коагуляции в плазме или пробе цельной крови с первой поверхностью и второй поверхностью на заданном расстоянии друг напротив друга, причем обе поверхности снабжены двумя по существу одинаковыми и конгруэнтно выровненными участками с высокой и низкой поверхностной энергией (поверхностным натяжением), причем участки с высокой поверхностной энергией создают систему распределения пробы, по меньшей мере, с одним чувствительным участком, причем этот чувствительный участок(и) первой и (или) второй поверхностей снабжен, по меньшей мере, одним стимулирующим коагуляцию реагентом.

В настоящем изобретении также предлагается способ изготовления тест-элемента коагуляции.

Кроме того, предлагается тест-система коагуляции, состоящая из тест-элемента коагуляции и измерительного устройства для выполнения анализа коагуляции крови с использованием упрощенного формата для обеспечения достоверного результата в соответствии с мировыми стандартами путем обеспечения контроля качества полоски.

Особенности и преимущества настоящего изобретения будут лучше понятны из следующего подробного описания иллюстративных и предпочтительных вариантов осуществления в сочетании с приложенными чертежами.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показан вид в перспективе одного варианта предлагаемого в настоящем изобретении тест-элемента коагуляции, выполненного в виде тест-полоски;

на фиг.2 показан вид в перспективе варианта осуществления по фиг.1, показывающий распределение пробы в увеличенном масштабе;

на фиг.3 показан вид в перспективе с разбиением на части устройства по фиг.1, показывающий три слоя по отдельности;

на фиг.4 показаны различные формы выреза центрального слоя, образующего полость для пробы вместе с первой и второй поверхностями;

на фиг.5а представлен вид в сечении чувствительного участка системы распределения пробы, созданного гидрофобными направляющими элементами;

на фиг.5б представлен вид в сечении другого варианта осуществления чувствительного участка системы распределения пробы с использованием гидрофильных каналов;

на фиг.6 показаны различные варианты осуществления системы распределения пробы с различными схемами каналов и чувствительных участков, пригодных для различных способов оценки;

на фиг.7а показана система распределения пробы по фиг.5б в сочетании с излучателем света и устройством регистрации на виде в сечении, позволяющие оценить изменения поглощения света пробы;

на фиг.7б показана система распределения пробы по фиг.5б в сочетании с регистрирующим устройством, сконфигурированным для оценки изменений сигнала флуоресценции молекулярного ротора, добавленного к пробе, или для оценки мутности подаваемой жидкости пробы;

на фиг.8 показаны различные молекулярные роторы и их молекулярная структура;

на фиг.9 приведен график, показывающий схематическую оценку результатов коагуляции с использованием положительного и отрицательного контроля качества;

на фиг.10 показан оптический спектр цельной крови в диапазоне от 500 до 700 нм;

на фиг.11 представлен график, показывающий ход реакции коагуляции крови, вызванной Тромборелом С® с мониторингом при 600 нм;

на фиг.12 показана упрощенная блок-схема примера измерительного устройства для использования в предлагаемом в настоящем изобретении способе;

на фиг.13 показано влияние сбоев фиксации во время ламинирования на объем пробы тест-элемента и соответствующий вид сверху в сечении альтернативного варианта осуществления, который обеспечивает большее допустимое отклонение для установки нижнего слоя и верхнего слоя без ущерба для качества тест-полоски;

на фиг.14 показаны этапы изготовления тест-элементов коагуляции с формой полоски.

Подробное описание изобретения

Как показано на фиг.1 и 2, тест-полоска 1 коагуляции по настоящему изобретению представляет собой многослойную структуру, содержащую нижний слой 2, центральный слой 3, расположенный над нижним слоем 2, и верхний слой 4, расположенный над центральным слоем 3. Центральный слой 3 имеет вырез 5, который вместе с нижним слоем 2 и верхним слоем 4 образует внутреннюю полость. Внутри полости расположена система 6 распределения пробы, которая сообщается с расположенным на краю тест-полоски коагуляции участком 9 взятия пробы. Используемый пользователем участок 9 взятия пробы предпочтительно имеет форму скругленного выступа 10, расположенного на одной из главных сторон тест-полоски коагуляции для более простого взятия пробы. На другой главной стороне тест-полоски коагуляции против участка 9, 10 взятия пробы расположено вентиляционное отверстие 11, через которое заполняющая систему распределения проба физиологической жидкости или жидкости на водной основе вытесняет воздух и поступает на заранее определенные чувствительные участки 6а, 6'а (см. фиг.3). Следует отметить, что при этой конструкции необходимо только одно вентиляционное отверстие независимо от количества заранее определенных чувствительных участков, используемых внутри тест-элемента коагуляции. Описанные элементы системы распределения пробы с участками с высокой поверхностной энергией, участком взятия пробы, вентиляционным отверстием, центральным слоем и вырезом в центральном слое образуют собственно тест-элемент коагуляции, который создает внутренний капиллярный эффект, обеспечивающий распределение взятой физиологической жидкости или жидкости на водной основе на заранее определенные чувствительные участки.

Кроме того, тест-полоска 1 коагуляции содержит регистрирующие (позиционирующие) элементы 7, 8, используемые для различения нескольких типов тест-полосок для определения различных параметров, таких как протромбиновое время (ПВ) и активированное частичное тромбопластиновое время (АРТТ). Посредством этого измерительное устройство для нескольких аналитов настроено на выполнение специальной программы или процедур с выбираемыми параметрами при введении полоски для определения различных параметров, как показано на фиг.3, на котором представлена многослойная структура по фиг, 1 и 2 в разобранном виде, причем нижний слой 2 обеспечивает первую поверхность 2а, и верхний слой 4 обеспечивает вторую поверхность 4а. Первая поверхность 2а и вторая поверхность 4а сконструированы с участками, которые создают систему 6 распределения пробы. Структура системы 6 распределения пробы содержит заранее определенное число чувствительных участков 6а и каналов пробы 6b, которые совмещены и зафиксированы в основном конгруэнтно при сборке многослойной структуры. Центральный слой 3 обеспечивает расстояние между первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4 и содержит вырез 5 для создания внутренней полости совместно с первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4. Система 6 распределения пробы, которая образована между первой поверхностью 2а и второй поверхностью 4а, расположена внутри полости, создаваемой вырезом 5 центрального слоя 3 и первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4. Предпочтительно внутренняя полость конструктивно по существу больше, чем система распределения пробы.

Поскольку назначение выреза 5 центрального слоя состоит только в создании полости для системы 6 распределения пробы, вырез 5 центрального слоя 3 может иметь различную форму; примеры показаны на фиг.4. На фиг.4а показана полость 12 тест-элемента коагуляции в форме зонтика. На фиг.4б показана прямоугольная полость 13 тест-элемента коагуляции, и на фиг.4с полость 14 для пробы имеет круглую форму. Вырез 5 центрального слоя 3 не влияет на размер заранее определенных чувствительных участков 6а и размер каналов 6b системы 6 распределения пробы и, следовательно, не влияет или не меняет требуемый объем пробы. По сравнению с системой 6 распределения пробы форма полости, показанная на фиг.4, довольно проста, таким образом обеспечивается использование простых пробивных штампов и быстрая обработка с меньшими требованиями по точности установки.

Система 6 распределения пробы, расположенная в полости, образованной вырезом 5 центрального слоя 3 и первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4, образована за счет создания участков с высокой и низкой поверхностной энергией на указанных поверхностях 2а и 4а. Участки с высокой и низкой поверхностной энергией на первой поверхности 2а нижнего слоя 2 и второй поверхности 4а верхнего слоя 4 совмещены по существу конгруэнтно друг относительно друга. Поскольку нанесенная физиологическая жидкость или любая другая проба на водной основе смачивает только участки с высокой поверхностной энергией, таким образом, она ограничена в пределах заранее определенных каналов 6b потока и чувствительных участков 6а системы 6 распределения пробы и между первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4.

На фиг.5а показана конструкция системы 6 распределения пробы с использованием гидрофобных "направляющих элементов". В этом варианте осуществления тест-элемента коагуляции по настоящему изобретению нижний слой 2 и верхний слой 4 покрыты гидрофобным слоем 16, за исключением участков, которые образуют каналы пробы, и чувствительных участков. Гидрофобный слой 16 создает участок с низкой поверхностной энергией, который проявляет силу отталкивания по отношению к нанесенной жидкости 15 пробы и, следовательно, ограничивает жидкость 15 пробы участками с высокой поверхностной энергией, которые образуют систему 6 распределения пробы.

Предпочтительно гидрофобный слой наносится на гидрофильную поверхность, которая смачивается физиологической жидкостью или жидкостью на водной основе. Описанная выше процедура требует наличия гидрофильной поверхности, которую можно изготовить из натурального гидрофильного полимера, такого как целлофан или стекло, а также на основе гидрофобных поверхностей общих полимеров (примеры приведены ниже), придав гидрофобной поверхности гидрофильные свойства с использованием покрытия или физического или химического плазменного осаждения гидрофильных мономеров, которые можно испарить в вакууме, например диоксид кремния, оксид этилена, этилен гликоль, пиррол или акриловая кислота. Следовательно, структура "направляющих элементов" может быть реализована печатью гидрофобной краски на гидрофильные поверхности нижнего и верхнего слоев.

Пригодная гидрофобная краска обладает углом смачивания с водой обычно больше 100° и поверхностной энергией обычно менее 25 мН/м и обычно содержит мономеры, олигомеры и полимеры с гидрофобными свойствами, придающие гидрофобные свойства добавки или гидрофобные пигменты и наполнители.

На фиг.5б показана другая конструкция системы распределения пробы с использованием гидрофильных каналов. В этом варианте осуществления тест-элемента коагуляции нижний слой 2 и верхний слой 4 покрыты гидрофильным слоем 17, создавая, тем самым, участки с высокой поверхностной энергией.

Гидрофильный слой 17, нанесенный печатью на гидрофобную поверхность, сильно смачивается физиологической жидкостью или жидкостью на водной основе; таким образом, участки с высокой поверхностной энергией, создающие гидрофильные каналы системы распределения пробы, оказывают воздействие положительной капиллярной силы на нанесенную физиологическую жидкость или жидкость пробы на водной основе, чтобы передать жидкость пробы на отдельные чувствительные участки.

Гидрофильный слой 17 может быть реализован путем печати гидрофильных или амфифильных реагентов на гидрофобную поверхность. Краски с гидрофильными свойствами могут быть выбраны из широкого ряда растворимых в воде и спирте полимеров с высокой молекулярной массой и их смесей. В частности, пригодны производные альгинатов, целлюлозы, гидроксиэтил целлюлозы, смол, многоатомных спиртов, полиэтиленгликолей, оксидов полиэтилена, винилпиролидона, сульфонатов полистирола, полисульфонатов, производных алкил-фосфохолина и других; в частности, пригодны также органо-модифицированные акрилаты кремния, которые являются перекрестно-сшитым видом органо-модифицированных поликсилоксанов и фторированных поверхностно-активных веществ. Пригодные покрытия обеспечивают угол смачивания с водой обычно менее 35° и поверхностную энергию обычно более 50 мН/м.

Нижний слой и верхний слой, пригодные в качестве подложки для печати, могут быть созданы из материала типа стекла, поливинил ацетата, полиметилметакрилата, полидиметилсилоксана, сложных полиэфиров полиэфирных смол, содержащих кольца флюорена, полистиролы, поликарбонаты и привитые сополимеры поликарбоната-полистирола, концевые модифицированные поликарбонаты, полиолефины, циклоолефины и сополимеры циклоолефинов и(или) сополимеры олефина-малеинимида.

В случае, когда подложка относится к промежуточному гидрофобному типу, также возможно нанесение печатью гидрофильных каналов с окружающей гидрофобной структурой, т.е. комбинация конструкций по фиг.5а и фиг.5б.

В альтернативном варианте осуществления (не показан) либо первая, либо вторая поверхность предусмотрена с гидрофильной/гидрофобной структурой и соответствующая поверхность обеспечивает гомогенную структуру гидрофильных пикселей, окруженных гидрофобным участком, создавая тем самым поверхность с полугидрофильными, полугидрофобными свойствами (амфифильный характер поверхности), что устраняет необходимость совмещения гидрофильной и гидрофобной структур первой поверхности с эквивалентной гидрофильной и гидрофобной структурой второй поверхности. Свойства такой амфифильной поверхности можно легко спроектировать посредством геометрической структуры гидрофильных пикселов и общего соотношения между гидрофильным и гидрофобным участком. В данном варианте осуществления изобретения амфифильный характер, соответственно, соотношение между гидрофильными пикселями и гидрофобными участками, заданы такими, чтобы жидкость пробы проходила от гидрофильного пикселя к гидрофильному пикселю, только если противоположная поверхность обеспечивает гидрофильный характер. Если противоположная поверхность обеспечивает гидрофобный характер, движение жидкости внутри капиллярного зазора тест-элемента коагуляции прекращается. Этот механизм позволяет создавать по вышеописанному способу функциональный тест-элемент коагуляции без строгого требования точного позиционирования соответствующей структуры системы распределения пробы, предусмотренной на первой и второй поверхностях. Однако предпочтительно, чтобы и первая, и вторая поверхности были предусмотрены с одинаковыми структурами с высокой и низкой поверхностной энергией для обеспечения быстрого распределения жидкости пробы внутри гидрофильных каналов системы распределения пробы.

Более того, можно физически поднять участки с высокой поверхностной энергией первой и второй поверхностей относительно участков с низкой поверхностной энергией за счет травления, тиснения или просто печати гидрофильного слоя толщиной больше примерно в три-пять раз на первой и второй поверхности. Благодаря этому подъему капиллярный зазор гидрофильных каналов становится меньше относительно окружающего участка и оказывает более сильное воздействие капилляров на жидкость пробы.

Требования к объему для системы распределения пробы, содержащейся в тест-элементе коагуляции по предпочтительному варианту осуществления, очень низкие и составляют примерно 0,5 мкл-1,0 мкл, так что требуется примерно только 100 нл-150 нл на чувствительный участок, в зависимости от того, созданы ли участки с высокой и низкой поверхностной энергией гидрофобными направляющими элементами или гидрофильными каналами или их комбинацией. Однако для специалистов будет очевидно, что объем системы распределения пробы различен для различных конструкций и в зависимости от числа использованных заранее определенных чувствительных участков.

На фиг.6 показаны различные структуры системы распределения пробы, которые можно осуществить посредством гидрофильных каналов, как показано на фиг.5б, или посредством гидрофобных "направляющих элементов", как показано на фиг.5а, или посредством комбинации гидрофильных каналов и гидрофобных направляющих элементов. Выбранная система распределения пробы должна соответствовать оцениваемому выбранному физиологическому параметру и используемому химическому способу регистрации.

Таким образом, повтор измерений пробы и стандарта возможен для конкретных проб сыворотки или цельной крови по вариантам осуществления, показанным в рядах со II по IV. Аналогично этому, можно использовать тест-элемент коагуляции, предусмотренный в ряду IV для оценки двух параметров коагуляции, таких как протромбиновое время и активированное частичное тромбиновое время.

Как описано выше, образование сгустка фибрина зависит от реакции между тромбопластином и ионами кальция, вступающими в реакцию с кровью, как указано ниже (Реакция I):

Тромбопластин+Са⁺⁺+Кровь (или Плазма)→Сгусток фибрина

При реакции (1) чувствительные участки 6'а системы 6 распределения пробы первой поверхности 2а нижнего слоя 2 или второй поверхности 4а верхнего слоя 4 характеризуются тем, что они покрыты составом 18, 19, как показано на фиг.5а и 5б, который способствует и обеспечивает регистрацию реакции коагуляции в пробе крови.

В одном варианте осуществления тест-элемента по настоящему изобретению состав 18 содержит вызывающий коагуляцию реагент, такой как Тромбопластин (например, предлагаемый компанией Dade Behring Holding GmbH, Höchster Strasse 70, 65835 Liederbach, Германия), в то время как состав 19 содержит ионы кальция. Вызывающий коагуляцию реагент является ускорителем коагуляции крови на чувствительном участке, позволяя, таким образом, зарегистрировать оптические свойства с помощью фотометрии пропускания или поглощения или рассеяния света.

Протромбиновое время или активированное частичное тромбиновое время можно регистрировать путем изменения поглощения света или рассеяния света. Во время коагуляции фибриноген преобразуется в фибрин, что вызывает преждевременное произвольное распределение эритроцитов и тромбоцитов в наиболее связанной стадии, таким образом, эритроциты и тромбоциты будут захвачены и соединены с волокнами фибрина и друг с другом, образуя сгусток крови. Эти изменения физической консистенции пробы крови приводят к сокращению числа центров рассеяния и, следовательно, к изменению поглощения света и мутности исследуемой пробы крови. Для оценки изменения поглощения света используется конструкция регистрирующего устройства, показанная на фиг.7а.

На фиг.7а показана конструкция регистрирующего устройства для измерения оптической плотности пробы внутри тест-элемента коагуляции по фиг.5б. Эта конструкция содержит источник 20 света, который испускает свет 24 некоторой длины волны в направлении чувствительного к пробе участка. Свет, испускаемый источником 20 света, проходит через оптическую схему 21, например диффузор или линзу, и апертуру 22, нижний слой 2, пробу 15 и верхний слой 4 чувствительного участка и регистрируется на противоположной стороне прибора регистрирующим устройством 23.

В другом варианте осуществления тест-элемент коагуляции предназначен для выполнения нескольких определений для обеспечения дополнительных измерений контроля качества. В этом случае тест-элемент коагуляции имеет по меньшей мере два, предпочтительно три чувствительных к коагуляции участка. Предпочтительно все чувствительные участки 6'а на первой поверхности 2а покрыты вызывающим коагуляцию реагентом 18 (например, тромбином), ускоряющим реакцию между химическими компонентами для образования сгустка фибрина, между тем как чувствительный к пробе участок, например 6а2, второй поверхности 4а покрыт химическим составом, содержащим ускоритель коагуляции, способствующий быстрой и полной коагуляции (положительный контроль), и другой чувствительный участок, например 6а3, второй поверхности 4а покрыт химическим составом, содержащим ингибитор коагуляции, подавляющий коагуляцию крови (отрицательный контроль).

При реакции (1) количества тромбопластина, ионов кальция и, если это необходимо, состава контроля качества, такого как ингибитор или ускоритель коагуляции, точно дозируют на указанных чувствительных к пробе участках. Предпочтительно дозирование выполняется способом осаждения с дозированием, хотя другие способы, такие как струйная печать, известны специалистам. Точное дозирование вызывающего коагуляцию реагента, нанесенного на чувствительные к пробе участки, критично для правильной процедуры реакции и, таким образом, для надежного расчета конечной точки реакции коагуляции. Например, в примере варианта осуществления количество тромбопластина может быть постоянным на каждом чувствительном к пробе участке, в то время как концентрация ингибитора коагуляции, такого как этилендиаминтетрауксусная кислота, может меняться.

В другом варианте осуществления тест-элемента по настоящему изобретению кроме дозирования тромбопластина, ионов кальция и составов контроля качества, таких как ингибитор и ускоритель коагуляции, дополнительный компонент, который действует как вспомогательная добавка для регистрации флуоресценции, может быть нанесен на чувствительные к пробе участки первой и(или) второй поверхности(ей) 2а, 4а. Если указанные чувствительные участки снабжены так называемыми флуоресцентными молекулярными роторами, реакцию коагуляции можно контролировать по флуоресценции.

Флуоресценция - это испускание света каким-либо веществом, которое происходит из первого возбужденного состояния молекулы. При инициализации такая молекула возбуждается за счет поглощения света. В течение следующих нескольких наносекунд молекула возвращается в основное состояние и освобождается от энергии возбуждения либо путем испускания света, называемого флуоресценцией, либо путем перемещения и вращения основной цепи молекулы.

Флуоресценция обычно возникает у ароматических молекул. Ароматические молекулы, поглощающие видимый свет в диапазоне от 400 до 800 нм, кажутся цветными. Более того, хромофор является частью краски, определяющей свойства поглощения и испускания всей молекулы. Количество или интенсивность испускания конкретного хромофора оценивается количественно по его квантовому выходу флуоресценции. Квантовый выход флуоресценции определяется как число испущенных фотонов по отношению к числу поглощенных фотонов. Широкий диапазон обычно используемых флуоресцентных красок обладает фиксированным квантовым выходом, тем самым, все краски с большим квантовым выходом, достигающим 100% эффективности испускания, обнаруживают наиболее яркое испускание, например сульфородамин 101, также известный как Texas Red.

Краски, несущие гибкие группы на конце их хромофора, известны как молекулярные роторы и обнаруживают зависимость их квантового выхода флуоресценции от вязкости растворителя. По мере того как вязкость растворителя возрастает, квантовый выход флуоресценции этих красок также возрастает. Это можно отнести за счет подвижности подвижных нежестких групп на конце хромофора, которая снижается при увеличении вязкости. Чем больше замедляется подвижность боковых групп, присоединенных к хромофору, тем больше молекул краски не могут перейти в свое основное состояние посредством перемещений их молекулярного каркаса и освободиться от энергии возбуждения посредством испускания света. Примеры флуоресцентных красок, чувствительных к вязкости растворителя, можно найти в классе красок на основе ксантина, оксазина и карбопиронина.

Этот эффект можно отнести за счет подвижности диэтиламиновых групп, которая снижается при возрастании вязкости. Одним примером такой краски в классе ксантина является родамин В, который может быть показан в виде следующей химической структуры:

Нижеследующая химическая структура показана в качестве примера подвижности диэтиламиновых групп, которая, соответственно, снижается за счет контакта с реагентами реакции 1. Поскольку эти реагенты приводят к образованию сгустка фибрина, т.е. коагуляции физиологической жидкости, возрастает вязкость пробы и, следовательно, флуоресценция молекул. Отмеченные диэтиламино-группы на конце хромофора не являются жесткими и вращаются, как отмечено, вокруг связи. Так как это движение сильно замедляется при повышении вязкости из-за коагуляции, испускание флуоресценции краски возрастает.

В отношении настоящего изобретения флуоресцентные пробы, чувствительные к изменению вязкости, наиболее полезны. Другими примерами молекулярных роторов являются орамин О., кристаллический фиолет 4, р-N,N-диметиламинобензонитрил 5, p-N,N-диметиламинобензонитрил 6, юлолидинбензилиденмалононитрил, родамин 19, родамин G6, родамин В, оксазин 1, оксазин 4, оксазин 170. Их молекулярная структура показана на фиг.8.

В случае мониторинга реакции по флуоресценции наиболее полезно расположить источник света и регистрирующее устройство не напротив друг друга, а под углом приблизительно 90 градусов для достижения максимальной чувствительности, как показано на фиг.7б. Предпочтительный угол между источником света и регистрирующим устройством составляет от 80 до 120 градусов, но наиболее предпочтителен угол приблизительно 109 градусов и размещение тест-системы коагуляции в оптической регистрирующей схеме таким образом, чтобы угол между нижним слоем и источником света и угол между верхним слоем и регистрирующим устройством составлял приблизительно 54 градуса во избежание фонового шума, обусловленного внутренним отражением на различных поверхностях чувствительного участка (или, в основном, тест-системы коагуляции). Для полного использования указанное регистрирующее устройство 23 сконфигурировано помимо оптической схемы 21 и 22 с оптическими фильтрами 21а и 22а для различения длины волны возбуждения и испускания, таким образом, регистрирующее устройств "видит" только свет 24, испускаемый от флуоресцентной краски, и "не видит" свет 24а, испускаемый источником света. Тем не менее, специалист заметит, что фактический угол должен быть оптимизирован для конкретного применения, требуемой чувствительности и требований к измерительному устройству в отношении регистрирующего устройства.

Тест-элемент 1 коагуляции содержит по меньшей мере один чувствительный участок 6а, который необходим для точного измерения протромбинового времени, но в предпочтительном варианте осуществления можно использовать три чувствительных участка 6а1-6а3. Физическая компоновка тест-элемента 1 коагуляции обеспечивает гибкость в отношении состава соединений, наносимых на различные чувствительные участки. Например, чувствительные участки 6а-6с могут иметь различную концентрацию вызывающего коагуляцию реагента, такого как тромбопластин, нанесенный на первую поверхность 2а нижнего слоя 2, в то время как ионы кальция и флуоресцентный молекулярный ротор могут быть нанесены на вторую поверхность 4а верхнего слоя 4. В альтернативном варианте все реагенты могут быть нанесены либо на первую поверхность 2а нижнего слоя 2, либо на вторую поверхность 4а верхнего слоя 4 тест-элемента 1 коагуляции.

После того как физиологическая жидкость, такая как кровь или плазма, нанесена на участок 9 взятия пробы и распределена на чувствительные участки под воздействием капилляров, она растворяет вызывающий коагуляцию реагент, содержащийся в составе 18 на чувствительных участках первой поверхности 2а, а также молекулярный ротор и(или) потенциальный ингибитор коагуляции, такой как этилендиаминотетрауксусная кислота, и содержащийся в составе 19 на заранее определенных чувствительных участках второй поверхности 4а, образуя смесь крови или плазмы, и вызывающего коагуляцию реагента, такого как тромбопластин, и ионы кальция плюс дополнительные материалы, предусмотренные на второй поверхности.

Предпочтительно, чтобы вызывающие коагуляцию реагенты, нанесенные на заранее определенные чувствительные участки, были хорошо растворимы физиологической жидкостью, такой как кровь, и расположены близко друг к другу, чтобы обеспечивать быстрое диффузионное смешивание всех компонентов, обеспечивая, таким образом, быструю реакцию компонентов, содержащихся на чувствительных участках для ускорения быстрого фотометрического определения вызывающей коагуляцию реакции.

Если имеется больше двух, предпочтительно трех, чувствительных к пробе участков, расположенных в пределах системы распределения пробы, один, например 6а1, может быть использован для регистрации протромбинового времени или активированного частичного тромбопластинового времени. Дополнительный чувствительный к пробе участок, например 6а2, может быть конфигурирован для обеспечения отрицательного контроля с использованием ингибитора коагуляции на второй поверхности 4а или отсутствия вызывающего коагуляцию реагента на первой поверхности 2а, тем самым дополнительный чувствительный к пробе участок, например 6а3, может быть конфигурирован для обеспечения положительного контроля с использованием ускорителя коагуляции, например гелеобразующее средство воспроизводит коагуляцию крови, даже если кровь слабо коагулирует. Таким образом, устройство обработки измерительного устройства позволяет сравнить результат измерений пробы с двумя предусмотренными стандартами, обеспечивая ясное решение или индикацию ошибочного измерения.

На фиг.9 показана схематическая оценка и измерение времени коагуляции с использованием молекулярного ротора в качестве флуоресцентной пробы и вспомогательного средства регистрации. На чертеже также показано сравнение сигнала измерения относительно пробы крови 27 с положительным стандартом 26, обеспечивающим максимальную флуоресценцию, достижимую после полного образования сгустка крови, и сравнение с отрицательным стандартом 25, обеспечивающим минимальный сигнал флуоресценции относительно некоагулированной пробы крови. После нанесения пробы цельной крови на участок 9 взятия пробы проба 15 крови переносится под действием капилляров, создаваемым системой распределения пробы, на различные чувствительные к пробе участки 6а/6'а, показанные на фиг.3. Проба растворяет вызывающий коагуляцию реагент, предусмотренный на первой поверхности 2а нижнего слоя 2, обеспечивая начало реакции коагуляции сразу после заполнения чувствительного к пробе участка 6'а1. Блок регистрации измерительного устройства регистрирует введение пробы крови, таким образом, может быть запущено устройство обработки блока регистрации, чтобы выполнить оценку времени реакции коагуляции.

Как упомянуто выше, один чувствительный к пробе участок, например 6а2, может быть конфигурирован как отрицательный стандарт, обеспечивающий средство сравнения измеренного сигнала пробы крови на чувствительном к пробе участке 6а1 с измеренным сигналом пробы крови, показывающим отсутствие реакции коагуляции. Такое поведение достигается либо осаждением не вызывающего коагуляцию реагента на чувствительном к пробе участке 6'а2, либо осаждением ингибитора коагуляции на чувствительном к пробе участке 6а2. Типичными ингибиторами коагуляции являются гепарин лития и натрия и, соответственно, соль калия этилендиаминотетрауксусной кислоты.

С другой стороны, положительный стандарт может быть осуществлен посредством ускорения реакции коагуляции или путем воспроизведения вязкости полностью сформировавшегося сгустка крови с другим сшивающим реагентом, который обеспечивает более быстрое время реакции, чем непатогенная проба крови, таким образом, положительное референтное значение достигается до коагуляции пробы крови на чувствительном участке 6а1. Этот тип перекрестной сшивки может быть достигнут за счет правильной концентрации альгината на второй поверхности 4а второго слоя 4. Альгинат смешивают с кровью и начинают желатинизировать, соответственно при коагуляции в результате реакции с ионами кальция внутри пробы крови и(или) дополнительными ионами кальция, предусмотренными на первой поверхности нижнего слоя. Однако специалисты в этой области понимают, что могут быть использованы другие гелеобразующие средства, также применимые для этой реакции.

Во время реакций устройство обработки измерительного блока может сравнивать отсчеты чувствительного к пробе участка 6а1 с отрицательным стандартом 25 и положительным стандартом 26. Как только измеренный сигнал пробы крови, обеспечиваемый чувствительным к пробе участком 6а1, достигает той же величины, что и положительный стандарт (указан выноской 28 на фиг.9), блок обработки измерительного устройства может остановить таймер и оценить конечный результат. Дополнительно блок обработки может выполнить некоторые дополнительные проверки качества для подтверждения правильности выполнения анализа и обеспечения значимых данных для пользователя/пациента. В этом отношении блок обработки может сравнивать фактические измеренные значения положительного и отрицательного стандартов, которые необходимо разделить посредством минимального и заранее запрограммированного значения. Если величина обоих сигналов становится мала, устройство может выдать сообщение об ошибке, указывающее, что определение неуспешно. Дополнительно это устройство может рассчитывать наклон 27 реакции коагуляции и сравнивать его с некоторыми заранее запрограммированными физиологическими значениями, которые описывают наиболее экстремальные значения, наблюдаемые клиницистами.

При мониторинге мутности пробы в широком диапазоне спектра, например путем использования галогенной лампы в качестве источника света, полезно ограничить окно мониторинга узкой частью спектра, если изменения пробы наблюдают по поглощению света. На фиг.10 показан спектр цельной крови в диапазоне от 500 до 700 нм. Распространенной особенностью спектра является двойной пик 40 гемоглобина между 520 и 600 нм. В принципе, можно оценить ход реакции коагуляции по поглощению света в любом месте в предусмотренной области спектра цельной крови. Требования к техническому измерительному устройству менее жесткие, если мониторинг реакции осуществляется при длине волны вне диапазона поглощения гемоглобина, т.е. 600 нм, как указано ссылочным номером 41.

На фиг.11 приводится пример оценки при обеспечении реакции коагуляции по поглощению света при 600 нм. Кровь вводится в тест-элемент коагуляции через отверстие 9 для нанесения пробы, и пропускание света быстро снижается, а поглощение света, соответственно, быстро возрастает, как указано номером 42. Следовательно, состав для коагуляции, предусмотренный на чувствительных к пробе участках 6'а первой поверхности 2а нижнего слоя 2, растворяется, и реакция коагуляции инициируется за счет реакции тканевого фактора (тканевой тромбопластин) с кровью или плазмой пробы. Этот момент времени определен как t=0, и блок обработки запускает запись результатов измерений. Период времени между событиями 42 и 43 можно считать фазой задержки реакции, когда достигается полное растворение реагентов и смешивание с пробой крови или плазмы, и тканевой тромбопластин запускает серию факторов коагуляции наружного канала, показанную в последовательности активации фактора VII, фактора X, фактора V, фактора II. Последние этапы последовательности коагуляции можно контролировать между событиями 43 и 44, когда фибриноген преобразуется в фибрин. Часто сгусток фибрина нестабилен и начинает разрушаться после достижения плато 44. Скорость и степень разрушения зависят от количества волокон фибрина в сгустке и различны для разных пациентов. Обычно пробы крови с высокой вязкостью обнаруживают более медленное разрушение, чем пробы крови с низкой вязкостью.

Результат измерений, в основном, и результат протромбинового времени по приведенному выше примеру следует оценивать между событиями 42-43, указывающими период времени t₁, и между событиями 43-44, указывающими период времени t₂, в основном, в соответствии с уравнением 1:

Факторы а и b необходимы, чтобы получить пропорциональные весовые множители для периодов времени t₁ и t₂, которые дают вклад в различные пропорции результата ПВ, задаваемого функцией fPT. Таким образом, на t₁ больше влияет тип инертных компонентов коагуляционного состава, который управляет растворением тканевого фактора, на t₂ в наибольшей степени влияет активность самого примененного тканевого фактора и концентрация ионов кальция. Дополнительно оба периода времени t₁ и t₂ модулируются температурой реакции, которая в идеале должна быть установлена или близка к 37°С, режимы более низких температур увеличивают время коагуляции. Однако для малогабаритных устройств следует находить оптимальное соотношение между портативностью, энергопотреблением и лабораторными характеристиками.

На фиг.12 показана упрощенная блок-схема измерительного устройства 80 для использования в настоящем изобретении. Измерительное устройство 80 может быть спроектировано на базе блока обработки, такого как микроконтроллер MAXQ2000 (предлагаемый компанией Dallas Semiconductor Corporation, 4401 South Beltwood Parkway,

Даллас, Техас, США). Блок обработки 81 может выполнять следующие функции контроля: (1) таймер всей системы; (2) обработка данных устройства регистрации света; (3) расчет времени ПВ по измеренным данным и (4) вывод времени ПВ или значения MHO на дисплей 83. Схема памяти позволяет сохранять данные и рабочую программу блока обработки. Дисплей 83 может иметь различный вид, такой как жидкокристаллический или светодиодный дисплей. Измерительное устройство 80 также может включать кнопку пуска-останова и может обеспечивать звуковой или визуальный вывод времени для индикации нанесения проб, считывания показаний и т.д., если это необходимо.

Блок 81 обработки может быть запрограммирован для использования в сочетании с измерительным устройством 80 измерения коагуляции. Свет, испущенный источником 20 света, проходит через оптическое устройство 21 и регистрируется регистрирующим устройством 23. Программа блока 81 обработки может дополнительно включать алгоритм расчета времени коагуляции как Международного нормализованного отношения, сформулированный в середине 1980-х годов, чтобы стандартизировать значения ПВ таким образом, чтобы результаты от различных тромбопластинов и анализаторов коагуляции были одинаковы. Ниже приводится Уравнение 2:

где МИЧ - Международный индекс чувствительности, ПВ пациента - время коагуляции пробы крови пациента, среднее нормальное ПВ - среднее ПВ время примерно для 20 людей. Значение МИЧ дано различными изготовителями тромбопластина.

Способ с использованием тест-элемента 1 коагуляции по настоящему изобретению может быть отнесен к блок-схеме измерительного устройства, показанного на фиг.12. Пользователь вводит тест-элемент 1 коагуляции в держатель 82 полоски измерительного устройства 80, который автоматически приводится в действие посредством запуска нажимной кнопки, которая может быть встроена в него. Регистрирующие (позиционирующие) элементы, расположенные на элементе 1, взаимодействуют с регистрирующими элементами на держателе 82 полоски для обеспечения расположения элемента 1 в правильном положении. Такое правильное расположение элемента крайне важно для действия комбинации измерительного устройства 80 и полоски 1. Необязательно измерительное устройство 80 может быть приведено в действие пользователем нажатием кнопки. Соответственно, пользователь делает прокол пальца и наносит цельную кровь на участок 9 нанесения пробы вставленного тест-элемента 1 коагуляции.

Объем крови, необходимой для выполнения теста по настоящему изобретению, составляет примерно 1 мкл. Поскольку гидрофильный реагент, нанесенный печатью на гидрофобную поверхность, сильно смачивается физиологической или водной жидкостью, участки с высокой поверхностной энергией, создающие гидрофильные каналы системы распределения пробы, вызывают положительную силу воздействия капилляров на нанесенную физиологическую жидкость пробы для перенесения жидкости пробы на отдельные чувствительные участки. Следовательно, физиологическая проба быстро распределяется на каждый чувствительный к пробе участок (6а-с) и активирует на нем вызывающие коагуляцию реагенты.

Затем начинается время теста коагуляции, поскольку реагент на чувствительных участках 6а-6с способствует коагуляции, и оптические свойства меняются, чтобы привести к моменту осуществления коагуляции.

Способ изготовления тест-элемента коагуляции

Тест-элемент коагуляции по настоящему изобретению, который предпочтительно изготовлен в виде полоски, можно легко изготовить по методам, известным специалистам в этой области, посредством печати, использования пробивных штампов и ламинирования. Конструкция тест-элемента коагуляции обеспечивает простой и затрато-эффективный способ, который предпочтительно, но необязательно, может быть непрерывным.

На первом этапе способа изготовления структура систему 6 распределения пробы образуют созданием участков с высокой и низкой поверхностной энергией на подложке. В первом варианте осуществления участки с высокой поверхностной энергией, образующие каналы 6b пробы и чувствительные участки 6а, 6'а на первой и второй поверхностях 2а, 4а, создаются нанесением гидрофильного состава на гидрофобную поверхность подложки. Как подробно описано выше, также можно создать участки с высокой и низкой поверхностной энергией нанесением структуры гидрофобных "направляющих элементов" на гидрофильную поверхность. В предпочтительном случае подложка обладает промежуточными гидрофобными свойствами имеющихся в продаже прозрачных полимерных пленок, посредством чего участки с низкой и высокой поверхностной энергией системы распределения пробы и чувствительных к пробе участков созданы печатью гидрофильных каналов под или окруженных гидрофобной структурой гидрофобных направляющих элементов.

Подложка может быть образована из материала типа стекла, поливинил ацетата, полиметилметакрилата, полидиметилсилоксана, полистиролов, сложных полиэфиров и полиэфирных смол, содержащих кольца флюорена, поликарбонаты и привитые сополимеры поликарбоната-полистирола, концевые модифицированные поликарбонаты, полиолефины, циклоолефины и сополимеры циклоолефинов и(или) сополимеры олефина-малеинимида.

Нанесение гидрофильной структуры на гидрофобную подложку и(или) нанесение гидрофобных "направляющих элементов" на гидрофильную подложку или любое их сочетание может быть выполнено по способу флексографии, литографии, глубокой печати, способов переноса на основу твердого красителя или струйной печати.

Однако предпочтительным способом изготовления является способ флексографии, который позволяет выполнить печать с высоким разрешением на ротационных печатных машинах и обеспечивает высокую производительность. Этот способ широко применяют для печати на полимерных пленках и повсеместно используют в упаковочной промышленности. Способ оптической регистрации требует прозрачной и чистой краски с низкой вязкостью для гидрофильной структуры. Краски с низкой вязкостью предпочтительны для получения тонкого и ровного покрытия толщиной примерно 2-4 микрона. Оптическое окно спектра краски должно находиться в диапазоне длин волны, пригодном для оптической регистрации химической реакции. Требования к гидрофобной краске, помимо гидрофобных свойств, менее строгие, и ее можно использовать также для украшения тест-элемента коагуляции нужным цветом, таким образом, для этого этапа предпочтительна непрозрачная краска. Использование четырехцветной машины для флексографической печати получило широкое распространение, и их использование, по существу, не создает проблем. То же относится к литографическому устройству.

Наиболее пригодны для изготовления тест-элемента коагуляции краски на базе растворителя, широко представленные различными изготовителями. Дополнительно, все имеющиеся печатные краски можно подбирать с дополнительными добавками и пигментами для оптимизации требуемых параметров. Многие из этих красок основаны на смесях нитроцеллюлозного этанола или поливинил бутирал этанола и могут быть получены, например, в компании Sun Chemicals Inc. (35 Waterview Boulevard, Parsippany, Нью-Йорк, США) или Flint Ink Inc. (4600 Arrowhead Drive, Ann Arbor, Мичиган, США).

Хотя краски на основе растворителя или закрепляемые под действием ультрафиолетового излучения применимы для изготовления тест-элемента коагуляции, некоторыми предпочтительными свойствами обладают краски, закрепляемые пучком электронов (ЭП). Эти краски обеспечивают самое высокое сопротивление механическим и химическим факторам и содержат 100% полимеров, необязательно с пигментами, но без летучих органических растворителей и фотоингибиторов, которые, как доказано, влияют на стабильность при использовании сенсоров. Эти положительные достижения в улучшении характеристик получены за счет способности электронов создавать сшитые полимерные пленки и проникать вглубь поверхности.

Печатные краски, которые закрепляются в пучке электронов, позволяют использовать способность акриловых мономеров и олигомеров к полимеризации. Использование акриловых соединений для приготовления печатных красок в настоящее время становится все более актуальным (см. J.T.Kunjappu. "The Emergence of Polyacrylates in Ink Chemistry," Ink World, февраль, 1999 г., стр.40.) Простейшее акриловое соединение, а именно акриловая кислота, имеет следующую формулу (I):

Двойная связь в акриловом фрагменте при взаимодействии с электронами (инициация) раскрывается и образует свободный радикал, в результате взаимодействия которого с другими образующими цепь (развитие цепи) мономерами образуются высокомолекулярные полимеры. Как уже было отмечено выше, радиационная полимеризация не требует никакого внешнего инициатора, поскольку излучение высокой энергии само генерирует свободные радикалы, благодаря чему в покрытии не остается никаких остатков инициаторов.

К акриловым мономерам, которые закрепляются в потоке электронов, относится большое количество акриловых мономеров, начиная от простых акрилатов типа 2-феноксиэтилакрилата и изооктилакрилата и заканчивая форполимерами типа эпоксиакрилата бисфенола А и акрилатов сложных/простых полиэфиров (R.Golden. J.Coatings Technol., 69, 1997, с.83). Подобный (электронно-лучевой) способ закрепления печатных красок позволяет создать "функциональные печатные краски" с определенными химическими и физическими свойствами без использования растворителя и необходимых при работе с другими печатными красками систем закрепления, которые заметно усложняют весь технологический процесс изготовления предлагаемых в изобретении тест-элементов.

В основном, пригодные гидрофобные краски могут содержать мономеры, олигомеры и форполимеры с гидрофобными свойствами, например изооктилакрилаты, додецилакрилаты, производные стирола или кремния, соединения с частично фторированными углеродными цепями и дополнительные гидрофобные добавки и (или) наполнители, такие как придающие гидрофобные свойства реагенты, относящиеся к серии TEGO Phobe (компания TEGO Chemie Service, Эссен, Германия), гидрофобные пигменты, такие как фталоцианы меди, углерод, графит, или гидрофобные наполнители, такие как модифицированная кремнием коллоидальная двуокись кремния или порошки ПТФЭ и гранулы ПТФЭ. Благодаря широкому разнообразию добавок, пигментов и наполнителей предложенные выше соединения даны только для примера.

Печатные краски с гидрофильными свойствами могут быть получены путем выбора растворимых в этаноле и воде полимеров и смесей этих полимеров. Можно использовать полимеры и производные полимеров, сополимеры и соединения на основе альгината, целлюлозы и сложного эфира целлюлозы, гидроксиэтил целлюлозы, смол, акриловой кислоты, поливинилового спирта, полиэтиленгликоля, оксида полиэтилена, винилпиролидона, полистирол сульфоната, поли(метилвинилового эфира/малеиновой кислоты), сополимеров винилпиролидона/триметиламмония и производных алкил-фосфохолина. Возможна дополнительная оптимизация за счет использования добавок органомодифицированных силиконакрилатов, которые являются сшиваемыми разновидностями органомодифицированных полисилоксанов, и фторированных поверхностно-активных веществ. Общее пригодное покрытие обычно обеспечивает угол смачивания с водой менее 35° и поверхностную энергию более 50 мН/м.

Второй этап производства включает нанесение коагуляционных составов, содержащих вызывающий коагуляцию реагент и дополнительные реагенты для получения печатных и(или) дозируемых красок, образующих однородный слой в пределах чувствительных к пробе участков.

В предпочтительном варианте осуществления количество тромбопластина на первой поверхности 2а нижнего слоя 2 точно дозировано с использованием соответствующего метода, такого как струйная печать. Действительно, для специалистов очевидно, что можно использовать другие способы дозирования для целей настоящего изобретения.

На всех соответствующих чувствительных к пробе участках противоположная поверхность должна быть обработана требуемым количеством контрольного состава, содержащего нужное количество альгината или другого ускорителя коагуляции, этилендиаминотетрауксусную кислоту или другие ингибиторы коагуляции и флуоресцентный молекулярный ротор в качестве вспомогательного реагента регистрации, если это необходимо для выбранного режима регистрации.

Поскольку уровень концентрации, соответствующий общему количеству вызывающего коагуляцию реагента, нанесенного на заранее определенные чувствительные к пробе участки с 6'а1 по 6'а3, ответственен за чувствительность и динамический диапазон различных описываемых тест-элементов коагуляции, а также уровень концентрации и точность нанесенного количества соединений контроля ответственны за точность результатов теста, для этого применения важно обеспечить тест-элементы коагуляции с точной дозировкой вышеуказанных элементов, соединений и компонентов. Достичь точной дозировки можно, например, за счет использования системы микродозирующего устройства (например, предлагаемого компанией Vermes Technik GmbH & Со. KG, Palnkamer Str. 18-20, D-83624 Otterfing, Германия). Состав покрытия должен быть легко растворимым в жидкой среде пробы, чтобы обеспечить быстрое восстановление без остатков после введения жидкости пробы.

Следующий этап включает процедуру ламинирования, при которой нижний и верхний слои, представляющие собой первую и вторую поверхности системы распределения пробы, наложены слоями на центральный слой, определяя, тем самым, расстояние между первой и второй поверхностями нижнего и верхнего слоев. Центральный слой обеспечивает вырез для создания полости для системы распределения пробы на участках, где система распределения пробы образована на первой и второй поверхности нижнего и верхнего слоев. Структуры с высокой и низкой поверхностной энергией, образованные на первой и второй поверхности нижнего и верхнего слоев, должны быть выровнены практически конгруэнтно, чтобы обеспечивать образование функциональной системы распределения пробы между первой и второй поверхностями.

Точная xy-установка (фиксация) нижнего и верхнего слоев становится критичной для функционирования элемента, если это не достигается, система распределения пробы не будет функционировать правильно и(или) обладать большим отклонением по отношению к указанному объему пробы. Допустимые пределы отклонения должны составлять +/- 5% ширины гидрофильных каналов для достижения надежных характеристик.

На фиг.13 показан вид сверху (слева) и вид в поперечном сечении (справа) тест-элемента коагуляции и влияния качества установки. В случае 13а система распределения пробы собрана правильно с надежным совмещением гидрофильных каналов первой 2а и второй поверхностей 4а. Результат неправильно совмещенного тест-элемента коагуляции показан на фиг.13б. Хотя проставка между нижним 2 и верхним слоем 4 одинакова в случае 13а и 13б, объем пробы ошибочно увеличен в случае b, поскольку жидкость пробы частично покрывает гидрофобные направляющие элементы системы распределения пробы. Это вызвано жидкостью пробы внутри тест-элемента коагуляции, которая стремится обладать минимальной площадью поверхности, граничащей с атмосферой, чтобы достичь наиболее предпочтительного энергетического состояния и, следовательно, преодолеть влияние гидрофобных участков.

В альтернативном варианте осуществления, как показано на фиг.13в, система распределения пробы верхнего слоя 4 выполнена примерно на 10% меньше, чем система распределения пробы нижнего слоя 2, таким образом, общий объем пробы тест-элемента коагуляции определен выступами системы распределения пробы нижнего слоя, обеспечивающим большие допустимые пределы для смещения во время изготовления без ущерба для точности требуемого объема пробы.

Нанесение центрального слоя, который может быть двухсторонней клейкой лентой предпочтительно толщиной 80 микрон или, в альтернативном варианте, клеем-адгезивом, нанесенным с одинаковой толщиной, упрощено за счет относительно большого выреза в материале по сравнению с размером гидрофильных каналов. Правильная фиксация особенно важна на линиях непрерывного производства, где подложка поступает с несколькими измерительными устройствами до десятков измерительных устройств в минуту. Выступы подложки и натяжение полотна затрудняют установку в x-направлении (направление перемещения полотна) по сравнению с y-направлением, перпендикулярным перемещению полотна.

Способ изготовления гибких полимерных пленок, обеспечивающий точную фиксацию структур первой и второй поверхности, показан на фиг.14, где указаны этапы непрерывного производства полотна. На первом этапе производства по фиг.14а структуры системы 6 распределения пробы нижнего и верхнего слоя нанесены печатью на одну подложку 49 полотна, которая представляет собой материал создаваемых тест-элементов коагуляции. Как показано на фиг.14, напечатанные структуры системы 6 распределения пробы расположены на полотне подложек 49 таким образом, что две системы распределения пробы находятся друг напротив друга слева и справа от зеркальной линии. Необязательно, система распределения пробы присоединена на участках, которые образуют участки нанесения пробы. Таким образом, положение заранее определенных чувствительных участков 6а, 6'а фиксировано друг относительно друга и не зависит от выступов материала и натяжения полотна.

Штриховые линии 50 указывают линии будущего разреза для разделения тест-элементов коагуляции на полоски, в то время как штриховые линии 51 указывают зеркальную линию заготовки полоски и будущую линию сгиба подложки полотна.

После печати траекторий потока тест-элемента коагуляции чувствительные участки 6а, 6'а системы распределения пробы покрывают требуемым составом. Например, чувствительные участки 6а верхнего ряда подложки 49 полотна, которые представляют собой вторую поверхность тест-элемента коагуляции, покрывают составом для контроля качества. Один из составов контроля качества (например, расположенный на участке 6'а1) не содержит активных соединений, которые либо ингибируют, либо ускоряют реакцию коагуляции и, следовательно, обеспечивают определенный результат анализа коагуляции, в то время как чувствительные участки 6'а нижнего ряда подложки 49 полотна, который представляет собой первую поверхность тест-элемента коагуляции, покрыты коагуляционными составами, содержащими тканевой тромбопластин для инициации реакции коагуляции. В особых случаях другие соединения помимо тканевого тромбопластина наносят в виде покрытия на чувствительные к пробе участки 6'а, которые запускают и активируют канал коагуляции в различных положениях для определения функциональных возможностей других факторов коагуляции.

После этого дополнительный слой накладывается на одну из поверхностей, например поверхность 2а нижнего слоя 2, представляющую собой центральный слой 52 тест-элемента коагуляции, как показано на фиг.14б. Центральный слой 52 может быть изготовлен из двухсторонней клейкой ленты или клея-адгезива, который обеспечивает прорывы 5, раскрывающие систему 6 распределения пробы для создания полостей для систем распределения пробы в тест-элементах коагуляции после заключительного этапа сборки.

Тест-элемент коагуляции по настоящему изобретению затем собирают посредством сгибания двух боковых сторон вдоль зеркальной линии 51, например, с помощью отгибающего аппарата или другого соответствующего оборудования, как показано на фиг.14в, создающего согнутое и ламинированное полотно 53, как показано на фиг.14г. Следовательно, можно прижимным валиком плотно соединить центральный слой, нижний и верхний слои.

Наконец, ламинированное полотно 53 вырезают или высекают в изделие нужной формы, тогда как линия 50 переносит примерную форму окончательной тест-полоски коагуляции на полотно 53 перед разделением. При способе изготовления, показанном на фиг.14, верхняя часть подложки может быть отогнута на нижнюю часть без риска ухудшения фиксации в x-направлении полотна и обеспечивает более простой способ добиться правильной установки первой и второй поверхностей, образующих систему распределения пробы, по сравнению со способом с одним слоем.

Для специалистов в данной области будет очевидно, что нижний и верхний слои являются взаимозаменяемыми в описанных вариантах осуществления, что не влияет на принцип настоящего изобретения.

Настоящее изобретение обеспечивает тест-систему для определения характеристик коагуляции проб плазмы и цельной крови, состоящую из тест-элемента коагуляции и небольшого простого переносного измерительного устройства, пригодного для установки дома и в лечебном учреждении. Тест-элемент коагуляции снабжен встроенной системой контроля качества для формата тест-полоски с сухими реагентами с очень малым объемом пробы, примерно 0,5 мкл. Изготовление тест-элемента коагуляции по настоящему изобретению не требует выполнения множества технологически сложных операций и позволяет изготавливать недорогие тест-элементы.

Группа изобретений относится к медицинской технике и предназначена для определения коагуляции крови. Тест-элемент содержит первую и вторую поверхности, расположенные на заданном расстоянии напротив друг друга. Обе поверхности содержат две по существу одинаковые структуры, образующие конгруэнтные участки с высокой и низкой поверхностной энергией. Участки с высокой поверхностной энергией образуют систему распределения пробы с чувствительными к коагуляции участками. По меньшей мере, один чувствительный участок снабжен, по меньшей мере, одним вызывающим коагуляцию реагентом. Тест-система коагуляции содержит тест-элемент, устройство регистрации, обрабатывающее устройство и устройство отображения. Способ изготовления тест-элемента включает формирование структуры участков с высокой и низкой поверхностной энергией, покрытие, по меньшей мере, одного заранее определенного чувствительного участка, по меньшей мере, одним вызывающим коагуляцию реагентом, наложение слоев первой и второй поверхностей на противоположные участки центрального слоя. Способ определения коагуляции в сыворотке или жидкости пробы цельной крови включает нанесение сыворотки или жидкости пробы цельной крови на тест-элемент коагуляции, введение тест-элемента коагуляции в измерительное устройство, считывание выходных значений с устройства отображения. Устройства и способы позволяют достичь повышения эффективности определения коагуляции цельной крови за счет минимальных этапов: нанесение крови на полоску, автоматический расчет точного результата, включая средство для контроля качества "на полоске"; удешевления способа изготовления тест-элемента коагуляции за счет уменьшения числа сложных этапов. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 14 ил.

1. Тест-элемент для определения коагуляции в пробе плазмы или цельной крови, имеющий первую (2а) и вторую (4а) поверхности, расположенные на заданном расстоянии напротив друг друга и обе содержащие две по существу одинаковые структуры, образующие участки с высокой и низкой поверхностной энергией, выровненные в основном конгруэнтно относительно друг друга, так что участки с высокой поверхностной энергией образуют систему (6) распределения пробы с, по меньшей мере, двумя чувствительными к коагуляции участками (6а1, 6а2), причем, по меньшей мере, один чувствительный участок (6а, 6'а) на первой и второй поверхностях (2а, 4а) снабжен, по меньшей мере, одним вызывающим коагуляцию реагентом.

2. Тест-элемент по п.1, в котором, по меньшей мере, один чувствительный к коагуляции участок снабжен составом, содержащим ускоритель коагуляции, который способствует быстрой и полной коагуляции жидкости пробы.

3. Тест-элемент по п.1, в котором, по меньшей мере, один чувствительный к коагуляции участок снабжен составом, содержащим ингибитор коагуляции, который подавляет коагуляцию в жидкости пробы.

4. Тест-элемент по п.1, в котором система (6) распределения пробы содержит, по меньшей мере, три чувствительных к коагуляции участка, по меньшей мере, один из которых снабжен составом, ускоряющим коагуляцию жидкости пробы, и, по меньшей мере, один снабжен составом, подавляющим коагуляцию в жидкости пробы.

5. Тест-элемент по одному из предшествующих пунктов, в котором вызывающим коагуляцию реагентом(ами) являются тромбопластин и(или) ионы кальция.

6. Тест-элемент по п.2, в котором состав, ускоряющий коагуляцию жидкости пробы, содержит гелеобразующее средство.

7. Тест-элемент по одному из пп.1, 4 или 6, в котором состав, подавляющий коагуляцию в жидкости пробы, содержит гепарин лития и (или) этилендиаминотетрауксусную кислоту.

8. Тест-элемент по одному из пп.1-4 или 6, в котором первая и(или) вторая поверхности (2а, 4а) чувствительного участка(ов) (6а, 6'а) снабжены соединением, позволяющим определить реакцию коагуляции по фотометрии пропускания или поглощения.

9. Тест-элемент по одному из пп.1-4 или 6, в котором первая и(или) вторая поверхности (2а, 4а) чувствительного участка(ов) (6а, 6'а) снабжены(а) соединением(ями), позволяющими определить реакцию коагуляции посредством флуоресценции.

10. Тест-элемент по п.9, в котором соединение(я), позволяющее(ие) определить реакцию коагуляции посредством флуоресценции, является флуоресцентным молекулярным ротором.

11. Способ изготовления тест-элемента коагуляции, включающий следующие шаги:
формирование участков с высокой и низкой поверхностной энергией на нижнем слое (2) с первой поверхностью (2а), причем участки с высокой поверхностной энергией образуют гидрофильную систему (6) распределения пробы с, по меньшей мере, двумя заранее определенными чувствительными участками (6а1, 6а2),
формирование соответствующей структуры участков с высокой и низкой поверхностной энергией на верхнем слое (4) со второй поверхностью (4а), покрытие, по меньшей мере, одного заранее определенного чувствительного участка(ов) (6а, 6'а) первой поверхности (2а) и(или) второй поверхности (4а), по меньшей мере, одним вызывающим коагуляцию реагентом,
наложение слоев первой и второй поверхностей на противоположные участки центрального слоя (3) с вырезом (5), обеспечивающим полость для системы (6) распределения пробы, образованную участками с высокой поверхностной энергий на первой и второй поверхностях (2а, 4а) первого и второго слоев (2, 4).

12. Способ по п.11, включающий следующие дополнительные шаги:
покрытие первой и(или) второй поверхностей (2а, 4а) дополнительного чувствительного к коагуляции участка (6а2) составом, содержащим ускоритель коагуляции, способствующий быстрой и полной коагуляции жидкости пробы,
покрытие первой и(или) второй поверхности (2а, 4а) другого чувствительного к коагуляции участка (6а3) составом, содержащим ингибитор коагуляции, подавляющим коагуляцию в жидкости пробы.

13. Способ по п.11 или 12, включающий дополнительный шаг покрытия первой и(или) второй поверхностей (2а, 4а) чувствительного к коагуляции участка(ов) соединением, позволяющим определить реакцию коагуляции посредством флуоресценции.

14. Способ по п.11 или 12, в котором указанные участки с высокой поверхностной энергией создают посредством нанесения нерастворимого в воде гидрофильного состава на первую и вторую поверхности (2а, 4а).

15. Способ по п.11 или 12, в котором указанные участки с низкой поверхностной энергией создают посредством нанесения гидрофобных составов на первую и вторую поверхности (2а, 4а).

16. Способ по п.14, в котором указанные гидрофильный и(или) гидрофобный состав(ы) наносят печатью на первую и вторую поверхности (2а, 4а) посредством флексографии, литографии, глубокой печати, переноса твердого красителя или струйной печати.

17. Способ по п.15, в котором указанные гидрофильный и(или) гидрофобный состав(ы) наносят печатью на первую и вторую поверхности (2а, 4а) посредством флексографии, литографии, глубокой печати, переноса твердого красителя или струйной печати.

18. Способ по п.11 или 12, в котором на чувствительные участки (6а, 6'а) первой и(или) второй поверхностей (2а, 4а) посредством микроконтактной печати или напыления микрочастиц наносят покрытие указанного вызывающего коагуляцию реагента(ов) и(или) контрольного состава(ов), и(или) вспомогательной добавки(ок) для регистрации флуоресценции.

19. Способ по п.13, в котором на чувствительные участки (6а, 6'а) первой и(или) второй поверхностей (2а, 4а) посредством микроконтактной печати или напыления микрочастиц наносят покрытие указанного вызывающего коагуляцию реагента(ов) и(или) контрольного состава(ов), и(или) вспомогательной добавки(ок) для регистрации флуоресценции.

20. Способ по п.14, в котором на чувствительные участки (6а, 6'а) первой и(или) второй поверхностей (2а, 4а) посредством микроконтактной печати или напыления микрочастиц наносят покрытие указанного вызывающего коагуляцию реагента(ов) и(или) контрольного состава(ов), и(или) вспомогательной добавки(ок) для регистрации флуоресценции.

21. Способ по п.15, в котором на чувствительные участки (6а, 6'а) первой и(или) второй поверхностей (2а, 4а) посредством микроконтактной печати или напыления микрочастиц наносят покрытие указанного вызывающего коагуляцию реагента(ов) и(или) контрольного состава(ов), и(или) вспомогательной добавки(ок) для регистрации флуоресценции.

22. Тест-система коагуляции для определения коагуляции в пробе плазмы или цельной крови, содержащая
тест-элемент коагуляции по одному из пп.1-10,
устройство регистрации для регистрации изменений поглощения света или флуоресценции в сыворотке или жидкости пробы цельной крови, расположенное на заранее определенном чувствительном участке(ах), обрабатывающее устройство для обработки данных от указанного устройства регистрации и расчета времени коагуляции и(или) значения международного нормализованного отношения (MHO), и
устройство отображения для индикации выходных значений пользователю.

23. Способ определения коагуляции в сыворотке или жидкости пробы цельной крови, в котором:
наносят сыворотку или жидкость пробы цельной крови на тест-элемент коагуляции по одному из пп.1-10,
вводят тест-элемент коагуляции в измерительное устройство, содержащее устройства регистрации и обработки,
считывают выходные значения с устройства отображения.