УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИЕ КАТИОННЫЕ АМФИФИЛЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ СПОСОБНОСТЬЮ ДОСТАВЛЯТЬ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2010 года по МПК C07H15/04 A61K9/127 C07C235/38 

Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к новым соединениям, способным доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих.

За последние несколько лет в связи с увеличением количества генетических заболеваний возрос интерес к такой области медицины, как генная терапия. Среди методов доставки генетического материала в эукариотические клетки заметное место занимает липофекция - перенос ДНК с помощью катионных амфифилов или липосом [1]. Катионные амфифилы и липосомы на их основе образуют с молекулами нуклеиновых кислот электростатические комплексы, которые защищают нуклеиновые кислоты от деградации под действием клеточных ферментов, а их проникновение в клетку происходит по механизму эндоцитоза. Доставка нуклеиновых кислот с помощью катионных амфифилов in vitro является обыденной рутинной процедурой, однако применение этого метода in vivo ограничено низкой эффективностью переноса, что связано с наличием различных типов биологических барьеров (например, взаимодействием ДНК-липидных частиц с белками плазмы крови и их захватом ретикуло-эндотелиальной системой, а также низкой специфичностью попадания в целевые органы и ткани) [2]. Для увеличения эффективности доставки нуклеиновых кислот в молекулы катионных амфифилов вводят специальные структурные элементы, которые помогают им преодолевать биологические барьеры [3]. Например, для нацеливания на определенные типы клеток молекулу катионного амфифила модифицируют адресными лигандами пептидной или углеводной природы [4].

К катионным амфифилам относят обширный круг химических веществ, имеющих общие структурные черты: наличие положительно заряженного и гидрофобного доменов, связанных спейсером различной длины [5-7]. Гидрофильный положительно заряженный домен необходим для связывания с молекулой нуклеиновой кислоты, а гидрофобный - для ее инкапсулирования. В последнее время в структуру катионных амфифилов все чаще включают остатки углеводов, которые выступают в качестве адресных маркеров для доставки нуклеиновых кислот в специальные клетки и ядро [8-14]. Кроме того, остаток углевода может служить базисом для размещения одной или нескольких катионных групп [15-17]. Амфифилы, содержащие углеводные остатки, способны вызывать рН-зависимый переход агрегатов амфифилов из ламеллярной фазы в мицеллярную, увеличивая и тем самым эффективность доставки генетического материала [18]. Кроме того, наличие углеводных фрагментов повышает коллоидную стабильность ДНК-липидных частиц в сыворотке крови [19, 20] и уменьшает токсичность [21].

Наиболее близким по структуре к заявляемым соединениям - прототипом является катионный амфифил N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N-[2-(6-спермилкарбамоил)этил]-N,N-диметиламмоний трифторацетат (DOSPA) [22]. В структуру данного липида входит остаток 1,2-ди-О-олеоил-rac-глицерина, который формирует гидрофобный домен, остаток природного поликатиона - спермина - формирует катионный домен, который связывается с фосфатными группами нуклеиновых кислот. Недостатком известного соединения является низкая трансфицирующая активность при использовании в виде индивидуального соединения.

Технической задачей изобретения является получение новых эффективных синтетических соединений, обладающих высокой трансфицирующей активностью, низкой токсичностью и способных доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих.

Поставленная техническая задача решается предлагаемыми соединениями, представляющими собой углеводсодержащие катионные амфифилы общей формулы:

где А - остаток 1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерина, B - остаток галактозы (для (1)), лактозы (для (2)) и маннозы (для (3)), C - остаток спермина, n=6, m=2.

На фигуре 1 представлены структурные формулы соединений (1), (2) и (3). В структуру амфифилов (1), (2) и (3) входят остаток спермина для связывания и компактизации молекулы нуклеиновой кислоты, остаток 1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерина для формирования гидрофобного окружения. Для связывания гидрофобной и сперминовой частей используют биодеградируемый линкер сукцинильного типа. Для придания углеводным остаткам пространственной подвижности моносахариды присоединены к липидным составляющим через гексаметиленовые мостики.

Новые соединения (1), (2) и (3) были получены по общей схеме, представленной на фигуре 2. Исходным соединением в синтезе являлся 1-бром-1-дезокси-2,3-ди-О-тетрадецил-rac-глицерин (4), который вводили во взаимодействие с N-(6-гидроксигексил)-4-нитробензолсульфонамидом (5), получая бифункциональное соединение (6). Ключевым этапом синтеза соединений (7a-b) явилось гликозилирование соединения (6) 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-α-D-галактопиранозилбромидом, 2,2',3,3',4',6,6'-гепта-O-ацетил-β-лактопиранозилбромидом или 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-α-D-маннопиранозилбромидом [23]. Для получения удобного узла связывания нитрогруппу ароматического ядра восстанавливали до аминогруппы, используя в качестве катализатора Pd/C. Далее в молекулы амфифилов (8a-b) вводили сукцинильный спейсер обработкой янтарным ангидридом, получая карбоксилаты (9а-с). Связывание соединений (9а-с) с N⁴,N⁹,N¹²-три-трет-бутоксикарбонил-1,12-диамино-4,9-диазадодеканом проводили в присутствии O-(1Н-бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний гексафторфосфата при 4°С. На завершающем этапе синтеза в соединениях (10а-с) проводили деблокирование аминогрупп действием трифторуксусной кислоты, а удаление ацетильных защит - 0.04 н. раствором метилата натрия в метаноле.

В синтезе использовались очищенные растворители, реагенты отечественного (Химмед, Реахим) и зарубежного производства (Merck, Fluka, Aldrich, Acros). Контроль за ходом реакций осуществляли с помощью ТСХ. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck), RP -18 F_254S (Merck), Сорбфил (Россия). Обнаружение пятен на хроматограммах проводили раствором фосформолибденовая кислота - церий (IV) сульфат с последующим прогреванием, реактивом Драгендорфа, раствором перманганата калия и с помощью УФ-лампы (254 нм). Колоночную хроматографию проводили на силикагеле Kieselgel 60 (0.040-0.063 mm); Kieselgel 60 (0.063-0.200 mm), LiChroprep® RP-18 (0.040-0.063 mm, Merck). Спектры ¹H- и ¹³С-ЯМР регистрировали на импульсном фурье-спектрометре «Bruker DPX-300» и «Bruker АМХ-400» в CDCl₃, смеси CDCl₃-CD₃OD и Py-d5 (внутренний стандарт тетраметилсилан). Значения химических сдвигов (δ) приведены в миллионных долях (м.д.), константы спин-спинового взаимодействия (J) в герцах (Гц). Масс-спектры получали на время-пролетном масс-спектрометре «Bruker Ultraflex» (Германия) методом матриксной лазерно-десорбционной ионизации на матрице с использованием в качестве матрицы 2,5-дигидроксибензойной кислоты. Углы оптического вращения измеряли на фотоэлектрическом спектрополяриметре «Digytor Yasco DIP 360» (Япония).

Для изучения способности предлагаемых соединений доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих использовали 25-звенный олигодезоксирибонуклеотид 5'-dTACAGTGGAATTGTATGCCTATTA-3', модифицированный флуоресцеинизотиоционатом (FITC) по 3'-концу, плазмидную ДНК (pEGFP-C2, «Clontech» (Германия)) и 21-звенную двуцепочечную РНК (siPHK, ИХБФМ СО РАН) (последовательность смысловой цепи 5'-GCGCCGAGGUGAAGUUCGATT-3', антисмысловой цепи - 5'-UCGAACUUCACCUCGGCGCGG-3'). FITC-ON был синтезирован фосфитамидным методом [24] и очищен ионообменной и обращенно-фазовой хроматографией. Чистоту олигонуклеотида проверяли с помощью электрофореза в 15% ПААГ в денатурирующих условиях, визуализацию олигонуклеотида в геле проводили с помощью окраски Stains-Аll.

Эффективность проникновения нуклеиновых кислот с использованием катионных амфифилов в клетки млекопитающих in vitro была исследована в экспериментах по трансфекции клеток FITC-меченным олигонуклеотидом, плазмидной ДНК, кодирующей зеленый флуоресцирующий белок (EGFP) и короткой интерферирующей РНК, направленной против матричной РНК гена, кодирующего EGFP.

Сопоставительный анализ заявляемых соединений с известными и широко используемыми соединениями, такими как Lipofectamine®2000 и Oligofectamine показал, что предлагаемые соединения обладают следующими преимуществами.

1) Благодаря наличию природных структурных модулей, в том числе углеводных остатков, заявляемые соединения обладают низким токсическим воздействием на клетки млекопитающих.

2) Заявляемые соединения обладают способностью доставлять в клетки млекопитающих нуклеиновые кислоты как короткие, так и протяженные, что позволяет рассматривать их как перспективные агенты для трансфекции клеток млекопитающих.

3) Заявляемые соединения доставляют нуклеиновые кислоты в клетки в индивидуальном состоянии в виде водных растворов и не требуют использования дополнительных вспомогательных липидов.

Заявляемые соединения не требуют сложной процедуры приготовления, свойственной липосомальным композициям, для них характерна легкость приготовления рабочего раствора, для получения которого достаточно растворить заявляемое соединение в воде или спирте. Кроме того, заявляемые соединения стабильны при хранении как в сухом виде, так и в виде концентрированного водного или спиртового растворов.

Поиск по источникам научно-технической и патентной литературы показал, что заявляемые соединения (1), (2), (3), способные доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих, в известных источниках не описаны.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение rac-N-(6-гидроксигексил)-N-[2,3-ди(тетрадецил-окси)проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (промежуточное соединение 6).

К раствору 0.995 г (1.816 ммоль) rac-1-бром-1-дезокси-2,3-ди-О-тетрадецилглицерина (4) в 10 мл диметилформамида добавили 0.571 г (1.888 ммоль) N-(6-гидроксигексил)-4-нитробензолсульфонамида (5), карбоната цезия (0.355 г, 1.090 ммоль) и тетрабутиламмоний йодида (0.067 г, 0.181 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 2 дня при нагревании, экстрагировали петролейным эфиром. Органический экстракт упаривали и хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход соединения (6) составил 1.397 г (60%).

Пример 2. Получение rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (промежуточное соединение 7а).

К раствору 1.028 г (1.336 ммоль) rac-N-(6-гидроксигексил)-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (6) в 40 мл безводного бензола добавили 0.691 г (4.009 ммоль) прокаленного карбоната кадмия и кипятили в аппарате Сокслета. В реакционную смесь вносили раствор 1.648 г (4.009 ммоль) 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-α-D-галактопиранозилбромида. Через 2.5 ч реакционную массу фильтровали, растворитель удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход соединения (7а) составил 1.152 г (78%).

Промежуточные соединения (7b) и (7с) были получены, как описано для получения соединения (7а), исходя из rac-N-(6-гидроксигексил)-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (6), 2,2',3,3',4',6,6'-гепта-O-ацетил-β-лактопиранозилбромида и 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-α-D-маннопиранозилбромида, соответственно. Физико-химические характеристики соединений (7b) и (7с) соответствуют их химической структуре.

Пример 3. Получение rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-аминобензолсульфонамида (промежуточное соединение 8а).

К раствору 1.126 г (1.024 ммоль) rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-[β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (7а) в 14 мл смеси метанол:тетрагидрофуран (2.5:2) добавили 0.258 г (4.096 ммоль) формиата аммония и нагревали до 60°С, вносили каталитическое количество Pd/C. Через 30 мин реакционную смесь фильтровали, растворители удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход соединения (8а) составил 0.933 г (85%).

Промежуточные соединения (8b) и (8с) были получены, как описано для получения соединения (8а), исходя из rac-N-[6-(2,2',3,3',4',6,6'-гепта-O-ацетил-β-лактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (7b) и rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-маннопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)-проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (7с), соответственно. Физико-химические характеристики соединений (8b) и (8с) соответствуют их химической структуре.

Пример 4. Получение rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-(3-карбоксипропаноиламино)бензолсульфонамида (промежуточное соединение 9а).

К раствору 0.932 г (0.872 ммоль) rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-аминобензолсульфонамида (8а) в дихлорметане добавили 1.025 г (10.23 ммоль) янтарного ангидрида, 0.024 г (0.201 ммоль) диметиламинопиридина и 287 мкл (2.046 ммоль) триэтиламина. Через 36 ч реакционную смесь промывали водным раствором HCl. Органическую фазу сушили, фильтровали, растворители удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход соединения (9а) составил 0.747 г (73%).

Промежуточные соединения (9b) и (9с) были получены, как описано для получения соединения (9а), исходя из rac-N-[6-(2,2',3,3',4',6,6'-гепта-O-ацетил-β-лактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-аминобензолсульфонамида (8b) и rас-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-маннопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-аминобензолсульфонамида (8с), соответственно. Физико-химические характеристики соединений (9b) и (9с) соответствуют их химической структуре.

Пример 5. Получение rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(N⁴,N⁹,N¹²-три-трет-бутоксикарбонил-12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)аминосукциниламино]бензолсульфонамида (промежуточное соединение 10а).

К раствору 0.642 г (0.549 ммоль) соединения (9а) и 0.552 г (1.098 ммоль) N⁴,N⁹,N¹²-три-трет-бутоксикарбонил-1,12-диамино-4,9-диазадодекана в диметилформамида внесли 191 мкл (1.098 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и по каплям раствор 0.416 г (1.098 ммоль) О-(1Н-бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний гексафторфосфата в ДМФА. Через 5.5 ч к реакционной массе добавили хлороформ и экстрагировали водным раствором HCl. Органическую фазу сушили, фильтровали, остаток хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход соединения (10а) составил 0.563 г (62%).

Промежуточные соединения (10b) и (10с) были получены, как описано для получения соединения (10а), исходя из соединений (9b) и (9 с), соответственно. Физико-химические характеристики соединений (10b) и (10с) соответствуют химической структуре.

Пример 6. Получение трис(трифторацетата) rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)аминосукциниламино]бензолсульфонамида (промежуточное соединение 11а).

К раствору 0.669 г (0.404 ммоль) соединения (10а) в дихлорметане добавили 4.416 мл (19.8 ммоль) трифторуксусной кислоты. Через 3.5 ч растворители удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход соединения (11а) составил 0.472 г (76%).

Промежуточные соединения (11b) и (11с) были получены, как описано для получения соединения (11а), исходя из (10b) и (10с), соответственно. Физико-химические характеристики соединений (11b) и (11c) соответствуют их химической структуре.

Пример 7. Получение тригидрохлорида rac-N-[6-(β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)-аминосукциниламино]бензолсульфонамида (1).

К 0.472 г (0.278 ммоль) соединения (11а) добавили 0.04 н. раствор метилата натрия в метаноле. Через 1 ч к реакционной массе добавляли раствор 4 н. HCl в диоксане, пока pH не станет равным 5. Растворитель удаляли в вакууме, остаток хроматографировали на колонке. Полученный продукт растворяли в 7 мл дистиллированной воды и проводили диализ против воды в мембране. После лиофилизации выход соединения (1) составил 0.199 г (55%). ¹Н-ЯМР (δ, м.д.): 0.65 (т, 6Н, J=6.5, 2СН₂СН ₃), 1.05 (уш.с, 44Н, 2(СН₂)₁₁), 1.13-1.26 (м, 4Н, СН₂СН₂), 1.31-1.49 (м, 8Н, 3CH ₂CH₂O, CH ₂CH₂N), 1.68-1.95 (м, 6Н, протоны спермина), 2.28-2.40 (м, 2Н) и 2.58-2.69 (м, 2Н, NCOCH₂CH₂COO), 2.81-3.55 (м, 24Н, CHH_aO, OCH₂CH, 2CH₂N, 2CH₂O, протоны спермина), 3.74-3.95 m, 4Н, H5-Gal, H_ab6-Gal, CHH_bO), 4.11-4.20 (м, 2Н, H2-Gal, H3-Gal), 4.35-4.31 (м, 1Н, H4-Gal), 4.31-4.49 (д, 1Н, J=7.6, H1-Gal), 7.78-7.86 (м, 2Н) и 8.01-8.09 (м, 2Н, Ar), 8.95-9.02 (уш.с, 1Н, NH). ¹³С-ЯМР (δ, м.д.): 14.21, 22.87, 23.94, 24.21, 25.56, 25.97, 26.49, 26.81, 27.18, 28.34, 29.55, 29.76, 29.92, 30.11, 30.61, 30.96, 32.06, 32.60, 36.24, 37.78, 39.00, 45.19, 45.54, 47.26, 50.11, 62.19, 69.52, 70.13, 70.55, 71.39, 71.69, 72.46, 75.13, 76.67, 78.75, 105.08, 128.78, 172.23, 174.08. Масс-спектр (MALDI-TOF), m/z: 1185.864 [M-3HCl+H]⁺, 1207.847 [M-3HCl+Na]⁺, 1223.825 [M-3HCl+K]⁺ вычислено для C₆₃H₁₂₀N₆O₁₂S: 1184.8685.

Соединения (2) и (3) были получены, как описано для получения соединения (1), исходя из (11b) и (11с), соответственно. Физико-химические характеристики соединений (2) и (3) соответствуют их химической структуре.

Тригидрохлорид rac-N-[6-(β-лактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)аминосукциниламино]бензолсульфонамид (2).

Выход соединения (2) составил 64%. [α]_D ³³ -3.07 (с0.8, CHCl₃-СН₃ОН, 1:5). ¹Н-ЯМР (δ, м.д.): 0.81 (т, 6Н, J=6.8, 2CH₂CH ₃), 1.16-1.28 (м, 48Н, 2(CH₂)₁₁, (CH₂)₂); 1.36-1.66 (м, 20Н, 3CH ₂CH₂O, 5CH ₂CH₂N, CH₂CH₂), 3.18-3.57 (м, 12Н, 2NCH ₂, 2OCH₂CH ₂, CH₂O, CHH_aO, CH₂CHCH₂), 3.65-3.75 (м, 2Н, CHH_bO, H5-Lac), 3.78-3.86 (м, 1Н, H5'-Lac), 3.91-4.12 (м, 4Н, H_ab6-Lac, H_ab6'-Lac), 4.37 (д, 1Н, J=7.8, Н-1' Lac), 4.41 (м, 1Н, Н-4 Lac), 4.43 (д, 1Н, J=7.8, Н-1 Lac), 4.79 (дд, 1Н, J=7.8, 9.4, Н-2 Lac), 4.89 (дд, 1Н, J=3.4, 10.3, Н-3' Lac), 5.03 (дд, 1Н, J=7.8, 10.3, Н-2' Lac), 5.12 (т, 1Н, J=9.4, Н-3 Lac), 5.29 (м, 1Н, Н-4' Lac), 7.75-7.92 (м, 4Н, Ar). ¹³С-ЯМР (δ, м.д.): 14.84, 23.48, 24.28, 25.50, 26.40, 27.29, 28.54, 30.16, 30.55, 30.72, 30.72, 31.23, 33.63, 38.47, 46.04, 46.47, 48.05, 50.46, 62.32, 62.49, 70.27, 70.40, 71.24, 72.28, 72.88, 75.25, 76.79, 77.49, 78.72, 79.52, 82.04, 104.51, 105.80, 120.28, 129.27, 134.58, 144.82, 172.96, 174.35. Масс-спектр (MALDI-TOF), m/z: 1347.700 [M-3HCl+H], вычислено для C₆₉H₁₁₃₀N₆O₁₇S: 1346.9213.

Тригидрохлорид rac-N-[6-(β-D-маннопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)аминосукциниламино]бензолсульфонамид (3).

Выход соединения (3) составил 55%. [α]_D ²³ 6.48 (c1, CH₃OH). ¹Н-ЯМР (δ, м.д.): 0.67 (т, 6Н, J=6.7, 2 СН₂СН ₃), 1.10 (уш.с, 44Н, 2(СН₂)₁₁), 1.15-1.25 (м, 4Н, CH₂CH₂), 1.34-1.45 (м, 8Н, 3CH ₂CH₂O, CH ₂CH₂N, 1.68-1.95 (м, 6Н, протоны спермина), 2.28-2.40 (м, 2Н) и 2.58-2.69 (м, 2Н, NCOCH₂CH₂COO), 2.81-3.55 (м, 24Н, CHH_aO, OCH₂CH, 2CH₂N, 2CH₂O, протоны спермина), 3.61 (дт, J=9.6, 6.4, 1Н, CHH_bO), 3.81-3.85 (м, 2Н, Н5-Man), 4.04 (дд, 1Н, J=2.4, 12.2, H_a6-Man), 4.23 (дд, 1Н, J=5.2, 12.2, H_b6-Man), 4.73 (д, 1Н, J=1.6, H1-Man), 5.16 (дд, 1Н, J=1.6, 3.1, Н2-Man), 5.19 (дд, 1Н, J=9.2, 9.8, H4-Man), 5.28 (дд, 1Н, J=3.1, 9.8, H3-Man), 7.75-7.91 (м, 2Н) и 8.05-8.15 (м, 2Н, Ar), 8.95-9.02 (м, 1Н, NH), 11.05-11.45 (м, 1Н, NH). ¹³С-ЯМР (δ, м.д.): 24.67, 25.75, 26.33, 27.65, 29.39, 29.62, 29.71, 29.77, 30.46, 31.24, 31.89, 45.32, 46.75, 47.19, 61.93, 66.91, 67.11, 67.99, 70.46, 71.50, 71.78, 72.32, 78.81, 100.77, 119.43, 122.56, 123.92, 128.50, 134.00, 135.98, 143.97, 148.84, 172.21, 173.78. Масс-спектр (MALDI-TOF), m/z: 1185.499 [M-3HCl+H]⁺, 1207.483 [M-3HCl+Na], 1223.451 [M-3HCl+K]⁺ вычислено для C₆₃H₁₂₀N₆O₁₂S: 1184.8685.

Пример 8. Влияние углеводсодержащего катионного амфифила (1) на жизнеспособность клеток линии ВНK, ВНK IR-780, HeLa, НЕK 293.

Клетки линий ВНK (эмбриональные клетки почки сирийского хомячка), ВНK IR-780 (модифицированные эмбриональные клетки почки сирийского хомячка), НЕK 293 (эмбриональные клетки почки человека) культивировали в среде DMEM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, в атмосфере 5%-ного CO₂ при 37°С.

Жизнеспособность клеток после инкубации с катионным амфифилом (1) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (0.1×10⁵ клеток на лунку для клеток НЕK 293 и 0.03×10⁵ клеток на лунку для клеток ВНK, ВНK IR-780). Через 24 ч в лунках меняли среду и к клеткам добавляли раствор катионного амфифила (1) в среде DMEM до конечной концентрации в лунке от 1 до 80 мкМ. Клетки инкубировали в присутствии амфифила в течение 24 часов в тех же условиях. По окончании инкубации к клеткам без смены среды добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А₅₇₀ - поглощение формазана, а А₆₃₀ - фон клеток.

Из экспериментальных данных вычисляли значение IC₅₀, концентрацию соединения, при которой наблюдается гибель 50% клеток. Значения IC₅₀ катионного амфифила (1) для клеток приведены в таблице 1.

Таблица 1 Клетки Наличие 10% сыворотки в ростовой среде IC₅₀, мкМ НЕK 293 + >40 - 25 ВНK IR-780 + >40 - 18 ВНK + >40 - 17

Из приведенных данных видно, что обработка клеток катионным амфифилом (1) вызывает их эффективную гибель только при концентрациях соединений выше 17 мкМ в отсутствии сыворотки в ростовой среде, а при наличии сыворотки - выше 40 мкМ, что свидетельствует о низкой токсичности заявляемого соединения.

Пример 9. Проникновение в клетки FITC-меченного олигонуклеотида с использованием катионного амфифила (1).

Исследование проникновения FITC-меченного олигонуклеотида в клетки НЕK 293 проводили с помощью проточной цитофлуориметрии. Эффективность доставки оценивали по количеству трансфицированных клеток от общего количества клеток в образце. Клетки высаживали в 24-луночные планшеты (2×10⁵ клеток на лунку) и культивировали в течение суток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Перед проведением трансфекции для экспериментов в присутствии или в отсутствие сыворотки среду в лунках заменяли на 200 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS, или DMEM, не содержащей сыворотку, соответственно. Раствор катионного амфифила (1) (10 мкМ) в среде OptiMEM смешивали с раствором FITC-меченного олигонуклеотида (5 мкМ) в этой же среде, полученные комплексы добавляли к клеткам и инкубировали в течение 4 ч. По окончании инкубации клетки промывали PBS (300 мкл), добавляли 50 мкл раствора трипсина и инкубировали 1-2 мин (37°С, 5% CO₂). По окончании инкубации в лунки добавляли 200 мкл DMEM с 10% сыворотки, клетки суспендировали и переносили в пробирки. Полученную клеточную суспензию центрифугировали при 1000-1200 об/мин, 4°С, отбирали среду и промывали 1 мл PBS. Затем клетки фиксировали 500 мкл 2% раствора формальдегида в PBS. Анализ уровня трансфекции клеток проводили на флоуцитометре BD FACSAria (Becton Dickinson). В этих экспериментах определяли число клеток, трасфицированных FITC-меченным олигонуклеотидом, и средний уровень флуоресценции клеток, определяемый при длине волны возбуждения 488 нм (в приборе используется когерентный сапфировый лазер (20 мВ)).

Результаты доставки в клетки ВНK FITC-меченного олигонуклеотида (5 мкМ) с катионным амфифилом (1) (5, 10 мкМ) в присутствии или отсутствие сыворотки в ростовой среде приведены в таблице 2.

Таблица 2 Концентрация липида, мкМ Наличие 10% сыворотки в ростовой среде Количество трансфицированных клеток, % 5 - 61,4 + 94,6 10 - 63,3 + 94,6

Из приведенных данных видно, что в присутствии амфифила (1) FITC-меченный олигонуклеотид эффективно (количество трансфицированных клеток превышает 60%) проникает в клетки в отсутствие сыворотки в ростовой среде. Наличие в ростовой среде 10% сыворотки значительно увеличивает эффективность трансфекции: количество трансфицированных клеток при этом приближается к максимально возможному.

Пример 10. Трансфекция клеток НЕK 293 плазмидной ДНК с использованием катионного амфифила (1).

Доставку плазмидной ДНК в клетки НЕK 293 проводили с помощью проточной цитофлуориметрии. Эффективность трансфекции оценивали по количеству клеток, содержащих зеленый флуоресцентный белок (EGFP) от общего количества клеток в образце. Клетки высаживали в 24-луночные планшеты (2×10⁵ клеток на лунку для клеток НЕK 293) и культивировали в течение суток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Перед проведением трансфекции для экспериментов в присутствии или в отсутствие сыворотки среду в лунках заменяли на 200 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS, или DMEM, не содержащей сыворотку, соответственно. Раствор соединения (1) (10 мкМ) в среде OptiMEM смешивали с раствором pEGFP-C2 (0.3 мкг/мкл) в этой же среде, полученную смесь добавляли к клеткам и инкубировали в течение 24 ч. Через 4 часа в лунках со средой без сыворотки заменяли среду на DMEM с 10% сывороткой. По окончании инкубации клетки обрабатывали и анализировали, как описано в примере 9. В таблице 3 представлены результаты трансфекции клеток плазмидной ДНК pEGFP-C2 с катионным амфифилом (1).

Таблица 3 Клетки Наличие 10% сыворотки в ростовой среде Количество трансфицированных клеток, % НЕK 293 - 30,3 + 2,2

Из приведенных данных видно, что с использованием катионного амфифила (1) плазмидная ДНК проникает в клетки в заметном количестве в отсутствие сыворотки в ростовой среде.

Пример 11. Трансфекция клеток ВНK IR-780 короткой интерферирующей РНК с использованием катионного амфифила (1).

Исследование проникновения siPHK, направленной на подавление синтеза зеленого флуоресцирующего белка EGFP, проводили на клетках линии ВНK IR-780, стабильно экспрессирующих этот белок. В качестве мишени была выбрана мРНК, кодирующая белок EGFP, таким образом по уменьшению флуоресценции клеток, определяемой этим белком, можно судить об эффективности доставки siPHK в цитоплазму.

Клетки высаживали в 24-луночные планшеты (0.2×10⁵ клеток на лунку для клеток ВНK IR-780) и культивировали в течение суток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Перед проведением трансфекции для экспериментов в присутствии или в отсутствие сыворотки среду в лунках заменяли на 200 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS, или DMEM, не содержащей сыворотку, соответственно. Раствор катионного амфифила (1) (10 мкМ) в среде OptiMEM смешивали с раствором siPHK (50 нМ) в этой же среде, полученные комплексы добавляли к клеткам и инкубировали в течение 72 ч. Через 4 часа среду в лунках со средой без сыворотки заменяли на DMEM с 10% сывороткой. По окончании инкубации клетки обрабатывали, как описано в примере 9. В таблице 4 представлены результаты по трансфекции клеток короткой интерферирующей РНК с катионным амфифилом (1), определенные по уровню снижения экспрессии белка EGFP.

Таблица 4 Концентрация липида, мкМ Наличие 10% сыворотки в ростовой среде Подавление экспрессии EGFP, % 10 - 81.1 + 14,2

Из приведенных данных видно, что катионный амфифил (1) в количестве, малотоксичном для клеток, способствует высокоэффективному проникновению siRNA в клетки, о чем свидетельствует подавление экспрессии заданного белка в отсутствие сыворотки в ростовой среде на 80%.

Таким образом, приведенные примеры однозначно указывают на способность предлагаемых углеводсодержащих катионных амфифилов эффективно способствовать проникновению нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих, что позволяет использовать их в качестве агентов для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих.

Источники информации

1. Non-viral Vectors for Gene Therapy, Part 1, Eds L.Huang, M.-C.Hung, E.Wagner, Elsevier, Amsterdam, 2005.

2. I.S.Zuhorn, J.B.F.N.Engberts, and D.Hoekstra, Eur. Biophys. J., 2007, 36, 349.

3. M.Morille, C.Passirani, A.Vonarbourg, A.Clavreul, and J.-P.Benoit, Biomaterials, 2008, 29, 3477.

4. M.Molas, A.G.Gómez-Valadés, A.Vidal-Alabró, M.Miguel-Turu, J.Bermudez, R.Bartrons, and J.C.Perales, Curr. Gene Ther., 2003, 3, 468.

5. B.Martin, M.Sainlos, A.Aissaoui, N.Oudrhiri, M.Hauchecorne, J.-P.Vigneron, J.-M.Lehn, and P.Lehn, Curr. Pharm. Design, 2005, 11, 375.

6. M.A.Mintzer and E.E.Simanek, Chem. Rev., 2009, 109, 259.

7. K.Kostarelos and A.D.Miller, Chem. Soc. Rev., 2005, 34, 970.

8. A.Murao, M.Nishikawa, C.Managit, J.Wong, S.Kawakami, F.Yamashita, and M.Hashida, Pharm. Res., 2002, 19, 1808.

9. K.Fabio, J.Gaucheron, C.Di Giorgio, and P.Vierling, Bioconjugate Chem., 2003, 14, 358.

10. M.Hashimoto, M.Morimoto, H.Saimoto, Y.Shigemasa, and T.Sato, Bioconjugate Chem., 2006, 17, 309.

11. R.Mukthavaram, S.Marepally, M.Y.Venkata, G.N.Vegi, R.Sistla, and A.Chaudhuri, Biomaterials, 2009, 30, 2369.

12. A.Düffels, L.G.Green, S.V.Ley, and A.D.Miller, Chem. Eur. J., 2000, 6, 1416.

13. Y.Higuchi, S.Kawakami, F.Yamashita, and M.Hashida, Biomaterials, 2007, 28, 532.

14. T.Masuda, H.Akita, T.Nishio, K.Niikura, K.Kogure, K.Ijiro, and H.Harashima, Biomaterials, 2008, 29, 709.

15.3. Я.Аль Шоэйби, Т.В.Андрюшина, Н.Г.Морозова, Г.А.Серебренникова, Биоорган. химия, 2003, 29, 323.

16. J.Herscovici, M.J.Egron, A.Quenot, F.Leclercq, N.Leforestier, N.Mignet, B.Wetzer, and D.Scherman, Org. Lett., 2001, 3, 1893.

17. M.А.Маслов, З.Я.Аль Шоэйби, Т.В.Андрюшина, Н.Г.Морозова, Г. А. Серебренникова, Биоорган. химия, 2007, 33, 538.

18. L.Wasungu, М.С.A.Stuart, М.Scarzello, J.В.F.N.Engberts, and D.Hoekstra, Biochim. Biophys. Acta, 2006, 1758, 1677.

19. C.Jacopin, H.Hofland, D.Scherman, and J.Herscovici, Bioorg. Med. Chem. Left, 2001, 11, 419.

20. E.Perouzel, M.R.Jorgensen, M.Keller, and A.D.Miller, Bioconjugate Chem., 2003, 14, 884

21. S.Horiuchi, and Y.Aoyama, J.Controlled Release, 2006, 116, 107.

22. P.Hawley-Nelson, V.Ciccarone, G.Geleyehu, J.Jesse, and P. L.Feigner, Focus, 15, 73.

23. A.c. 1428755 СССР. Способ получения н-алкил-β-D-гликозидов/ Толкач A.M., Полоник С.Г., Уварова Н.И.; 1988, Бюл. №37.

24. D.Proudnikov, A.Mirzabekov, Nucleic Acids Res. 1996, 24, 4535-4542.

Изобретение относится к углеводсодержащим поликатионным амфифилам (1-3), представляющим собой тригидрохлориды rac-N-[6-(β-D-гликопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)амино-сукциниламино]бензолсульфонамида приведенной общей формулы, где А - остаток 1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерина, В - остаток галактозы (для (1)), лактозы (для (2)) и маннозы (для (3)), С - остаток спермина, n=6, m=2. Указанные соединения обладают способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих. 4 табл., 2 ил.

Углеводсодержащие поликатионные амфифилы, представляющие собой тригидрохлориды rac-N-[6-(β-D-гликопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)амино-сукциниламино]бензолсульфонамида общей формулы:

где А - остаток 1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерина, В - остаток галактозы (для (1)), лактозы (для (2)) и маннозы (для (3)), С - остаток спермина, n=6, m=2,
обладающие способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих.