Интраназальное противовирусное средство Российский патент 2025 года по МПК A61K38/21 A61K31/713 A61K47/20 A61K47/10 A61P31/12 

Изобретение относится к интраназальному противовирусному средству, содержащему рекомбинантный интерферон альфа - 2b и природный индуктор интерферона из дрожжей Saccharomyces cerevisiae в виде лиофилизата для приготовления раствора для интраназального применения, обладающего противовирусными и иммуномодулирующими свойствами для целей профилактики и лечения гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) и может быть использовано в медицине и фармацевтике.

Разработка эффективных противовирусных препаратов на основе веществ, стимулирующих систему естественной (неспецифической) противовирусной устойчивости, по-прежнему актуальна. Это связано с тем, что наряду с несомненными достоинствами применения специфических химиотерапевтических средств, к которым можно отнести направленность воздействия и как следствие, выраженность клинического эффекта, эти средства имеют и ряд недостатков, таких как разнообразные побочные эффекты, быстрое формирование толерантности к вирусным агентам. Поэтому понятен интерес к веществам-регуляторам неспецифической резистентности - интерферонам (ИФН) и их индукторам как потенциальным лекарственным средствам. Среди довольно разнородного класса индукторов ИФН особое место занимают полинуклеотидные комплексы - природные и синтетические двуспиральные РНК (дсРНК). Отличительной особенностью полинуклеотидных индукторов является усиление интерфероногенеза посредством запуска естественных, выработанных в процессе эволюции, механизмов. Эффект дсРНК на клетку осуществляется через Толл-лайк- подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLR) 3 типа, расположенные на мембране клетки и в ее цитоплазматическом пространстве [1]. Интерфероны, в свою очередь, запускают экспрессию генов, реализующих противовирусный ответ. К ним относятся гены системы 2'-5'-олигоаденилатсинтетаза (OAS)/PHKa3a L, продукты которых вызывают деградацию вновь синтезируемой в клетке матричной РНК, в том числе вирусной [2], ген протеинкиназы R, которая ингибирует синтез любых (включая вирусные) белков [3], а также гены белков МхА и МхВ, блокирующих транскрипцию вирусной мРНК в клеточном ядре [4, 5]. Вышеперечисленные ферменты являются дсРНК-зависимыми [6], то есть дсРНК являются не только индукторами синтеза ИФН, но и регуляторами его действия.

Встречаются сведения и о прямом воздействии дсРНК на активность противовирусных ферментов [7]. Установлено, что дсРНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae обладает способностью повышать экспрессию генов рецепторных (TLR3) и противовирусных белков (ИФН-α, ИФН-γ, OAS) в макрофагах мышей как в условиях in vitro, так и in vivo, а также доказано наличие у препарата дрожжевой дсРНК адъювантных свойств [8,9].

На основе природных дсРНК создано несколько препаратов для лечения инфекционных заболеваний, таких как Ридостин и его аналоги (Россия), Ларифан (Латвия). В настоящее время разработана интраназальная форма препарата Ридостин, которая позволяет не только увеличить стабильность и биодоступность активного компонента, но и получить препарат, обладающий выраженными противовирусными свойствами в отношении вирусов гриппа A (Aichi/2/68 (H3N2), Bishkek/01/2009 (H1N1pdm09)) [10,11].

Широким спектром действия среди противовирусных препаратов обладают интерфероны. ИФН представляют собой самостоятельную группу цитокинов, общим свойством которой является противовирусная активность. ИФН разных типов регулируют различные иммунные процессы, участвующие в формировании противовирусной защитной реакции: повышают активность естественных киллеров, экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости, стимулируют фагоцитоз и т.д. [12,13].

Отечественные и зарубежные препараты рекомбинантного интерферона альфа-2b (ИФН-α2b) прочно вошли в арсенал средств лечения инфекционных, онкологических и других заболеваний человека. При этом накоплен значительный клинический материал, свидетельствующий о том, что инъекционное введение ИФН вызывает ряд побочных эффектов: повышение температуры, озноб, головную боль, чувство разбитости, иногда диспептические расстройства, лейко- и тромбоцитопению. В то же время, как показывает клинический опыт, при пероральном и интраназальном применении ИФН можно избежать побочных реакций при сохранении выраженного лечебного эффекта [14].

Среди лекарственных препаратов ИФН, применяемых в клинической практике в нашей стране, можно выделить ряд лекарственных средств для местного применения. Среди них препараты природных ИФН, такие как ИФН человеческий лейкоцитарный, Лейкинферон (смесь подтипов природного ИФН-α в суппозиториях), а также рекомбинантные аналоги: Генферон (ИФН человеческий рекомбинантный альфа-2b в виде интраназальных капель, спрея и свечей); Виферон (ИФН-α2b, мазевая и суппозиторная формы); Реколин (ИФН-α2b, суппозитории); Гриппферон (ИФН-α2b, интраназальные капли); Инфагель (ИФН-α2b, гель для наружного и местного применения) и др. Препараты ИФН в интраназальной форме используют для лечения и профилактики гриппа и ОРВИ [15-17]. Подавляющее большинство лекарственных препаратов для введения в полость носа представлено в виде растворов (капли, спреи) или мягких лекарственных форм, что имеет некоторые недостатки, такие как низкая стабильность раствора при хранении, возможность контаминации и сложность дозировки в случае использования мягких лекарственных форм [18,19].

Известны аналоги [20-26], использующие в качестве основного компонента различные виды интерферонов:

- патент RU 2140285, опубл. 27.10.1999 г. - противовирусное средство-капли в нос на основе интерферона альфа, бета или гамма;

- патент RU 2108804, опубл. 20.04.1998 г. - препарат для лечения и профилактики вирусных заболеваний на основе человеческого лейкоцитарного интерферона;

- патент RU 2201212, опубл. 27.03.2003 г. - суппозитории, обладающие иммуномодулирующим, противовирусным, противобактериальным, регенерирующим, репаративным, мембрано- и гепатопротекторным действием на основе природного интерферона или рекомбинантного интерферона α-, илиβ- и/или γ-типов;

- патент RU 2381812, опубл. 20.02.2010 г. - стабилизированное иммунокорригирующее лекарственное средство для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний с высокой степенью биодоступности, характеризующееся тем, что выполнено в виде суппозиториев и содержит интерферон человеческий рекомбинантный альфа, и/или бета, и/или гамма типов;

- патент RU 2277904, опубл. 20.06.2006 г. - интерферонсодержащая аэрозольная композиция, содержащая интерферон, растворитель и вспомогательные вещества;

- патент RU 2523554, опубл. 20.07.2014 г. - способ защиты организма от инфекции, вызванной штаммами субтипа H1N1 вируса гриппа А, включающий введение в организм препарата альфа-2 интерферона человека, в качестве которого используют «Реаферон ЕС-Липинт»;

- патент RU 2444372, опубл. 10.03.2012 г. - способ лечения острого герпетического стоматита у детей, включающий пероральное введение в организм противовирусного средства и местное нанесение противовирусного препарата в мазевой форме, в качестве которого используют «Реаферон EC - Липинт», полученный включением рекомбинантного альфа-2b интерферона в липосомы.

Как было показано авторами работ [27,28], эффект индуктора интерферона может усиливаться при его сочетанном применении с интерферонами. Повышение интерферониндуцирующих и противовирусных свойств фаговой дсРНК в композиции с ИФН-α2b было продемонстрировано и в ходе исследования [29].

Наиболее близким аналогом (прототипом) данного изобретения по предлагаемой сущности и достигаемому результату является интраназальное средство (патент RU № 2437676, МПК А61К 38/21, опубл. 27.07.2011 г. [30]). Предложенное интраназальное средство представляет собой противовирусное средство, содержащее генно-инженерный интерферон, поливинилпирролидон, предварительно смешанный с гидроксипропилметилцеллюлозой при массовом соотношении 1:1-500, или полиэтиленоксид, предварительно смешанный с гидроксипропилметилцеллюлозой при массовом соотношении 1:1-100, 2%-ный водный раствор L-лизин гидрохлорида, глицерин, антиоксидант и буферную смесь, при следующем содержании компонентов в 1 мл буферной смеси, г: генно-инженерный интерферон, 500-1000000 ME; смесь гидроксипропилметилцеллюлозы с поливинилпирролидоном или с полиэтиленоксидом 0,006-0,17; антиоксидант 0,0001-0,02; 2%-ный водный раствор L-лизин гидрохлорида 0,001-0,2; глицерин 0,001-0,09; буферная смесь - остальное. Кроме того, средство дополнительно содержит антигистаминные препараты, иммуномодуляторы, нестероидные или стероидные противовоспалительные препараты, противоотечные средства, бактерицидные препараты, антимикробные средства, антибиотики, антивирусные препараты, обезболивающие средства и витамины.

Следует отметить, что предложенные в данном патенте композиции имеют ряд недостатков. Каждая описанная композиция представляет собой вязкую смесь сложного состава, которая состоит из смеси интерферонов, индукторов интерферонов в виде готовых лекарственных форм, а не субстанций, с добавлением препаратов с разным фармакологическим действием - противоаллергических, антибактериальных, противовоспалительных, обезболивающих и др.

В составе композиций отсутствуют вещества, способные предотвращать гидролиз индукторов интерферона рибонуклеазами мукозальных поверхностей и обеспечивать ускоренное проникновение действующих веществ через слизистую, что важно для проявления максимального синергидного действия дсРНК и интерферонов [11].

Наличие водой фазы в составе гелей, суспензий вязких растворов для интраназального применения, в том числе, содержащих интерферон, при длительном хранении может приводить к автолизу биологических компонентов противовирусного средства [31].

Сложный состав требует углубленного исследования безопасности композиций. При этом в патенте не приводятся данные о результатах таких исследований, в частности, изучения аллергизирующих свойств; нет данных о побочных эффектах препаратов при их совместном применении. Изучение эффективности противовирусного средства проводились на очень маленькой группе лиц (5 человек) молодого возраста (20-30 лет). Для достижения лечебного эффекта представленных композиций при гриппе и других инфекционных заболеваниях, в соответствии с патентом, требуется его длительное применение (3-4 раза в день по 3 - 4 капли в каждый носовой ход в течение 10 дней).

Технический результат заявляемого изобретения состоит в создании такого интраназального противовирусного средства, которое обеспечивает усиление синтеза интерферона и противовирусного действия препарата за счет синергидного действия индуктора интерферона дсРНК и интерферона в определенном соотношении, а также усиления пенетрации активных компонентов через клеточные мембраны за счет введения в состав средства активатора всасывания.

Указанный технический результат достигается тем, что создана композиция для получения интраназального противовирусного средства в виде лиофилизата, характеризующаяся тем, что содержит диметилсульфоксид (ДМСО), индуктор интерферона, представляющий собой натриевую соль двуспиральной рибонуклеиновой кислоты в виде субстанции, рекомбинантный интерферон альфа-2Ь человека, Трилон Б (ЭДТА), полиэтиленоксид, изотонический раствор натрия хлорида, при соотношении диметилсульфоксида и двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) 1:4,52, при следующим количественном содержании компонентов в 1 мл раствора:

рекомбинантный интерферон альфа-2b 500-000 ME натриевая соль двуспиральной рибонуклеиновой кислоты в количестве, 0,0088-0,0113 г обеспечивающем содержание дсРНК 0,00226 г диметилсульфоксид 0,0005 г Трилон Б (ЭДТА) 0,0005 г полиэтиленоксид 0,0005 г изотонический раствор натрия хлоридадо хлоридадо 1 мл

Оптимальное содержание генно-инженерного интерферона составляет 2500 ME в 1 мл восстановленного раствора.

Средство выполнено в лиофильно высушенном виде.

Интерферон в противовирусном средстве представлен рекомбинантным интерфероном альфа-2b человека, отличающимся высоким уровнем противовирусной активности в отношении широкого спектра вирусов. В качестве индуктора интерферона выбрана субстанция - натриевая соль двуспиральной рибонуклеиновой кислоты киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, характеризующаяся выраженной способностью усиливать синтез интерферонов первого и второго типов, а также активность ряда других факторов неспецифической устойчивости [32]. Количество субстанции в составе препарата выбрано таким образом, чтобы содержание активного компонента дсРНК составляло 0,00226 г на дозу с учетом содержания дсРНК в субстанции (18-22% в соответствии с ФСП Р № 002021/01-07 04 20090769-08).

В качестве активатора всасывания противовирусное средство содержит диметилсульфоксид (ДМСО), который способен к пенетрации через клеточные мембраны и усиливает действие других, совместно апплицируемых лекарств, что позволяет снизить их концентрацию без потери эффективности. ДМСО обладает также анальгетическим и противовоспалительным действием, умеренным антисептическим и фибринолитическим эффектом, что позволяет заменить в составе лекарственного препарата несколько компонентов симптоматического действия [31,33]. Соотношение ДМСО и дсРНК (1:4,5) определено на основании литературных [34] и собственных экспериментальных данных как оптимальное для получения качественного продукта при лиофилизации.

В качестве антиоксиданта противовирусное средство содержит этилендиаминтетрауксусную кислоту динатриевую соль, которая способна связывать следовые количества ионов двухвалентных металлов, в присутствии которых ускоряются процессы окисления, и тормозить процессы распада дсРНК [31].

В качестве биологически совместимого полимера противовирусное средство содержит полиэтиленоксид, который за счет гидрофильных свойств способствует увеличению контакта лекарственного вещества со слизистой носовой полости и тем самым приводит к увеличению биодоступности и улучшению растворимости лекарства [31].

В качестве стабилизатора средство содержит натрия хлорид 0,9%, который обеспечивает изотоничность раствора для предотвращения нарушения физиологического водно-солевого гомеостаза.

Противовирусное средство обладает пролонгированным действием, за счет чего сокращаются сроки лечения. Кроме того, средство не требует ежедневного приема, как в прототипе, и применяется по 2-3 капли в каждый носовой ход 1 раз в сутки в течение 4-х дней по схеме: в первый, второй и четвертый дни.

Изобретение поясняется следующими графическими материалами, представленными на фиг. 1-3. На фиг. 1 представлена электрофореграмма интраназальной формы препарата, содержащего дсРНК и ИФН-α2b до закладки на хранение (А) и после хранения в течение года при 4-8°С (Б). Электрофорез в 1% геле агарозы, окрашивание этидиум бромидом. Дорожки: 1 - ДНК маркер 1 Kb (ООО «СибЭнзим»); 2 - дсРНК- ИФН-α2b (2500 ME); 3 - субстанция дсРНК (контроль). На фиг. 2 представлены ИК-спектры интраназальной формы препарата, содержащего дсРНК и ИФН-α2b (2500 ME), в сравнении с компонентами препарата, записанные до закладки на хранение (А) и после хранения в течение года при 4-8°С (Б). Обозначения: 1 -композиция дсРНК- ИФН-α2b (2500 ME); 2 - ИФН-α2b; 3 - дсРНК. На фиг. 3 представлены экспериментальные данные, полученные в ходе изучения противовирусной активности препарата на экспериментальной модели гриппозной инфекции у мышей. Приведены графики выживаемости животных, построенные по методу Каплана-Мейера, при заражении штаммом ВГ A/Aichi/2/68 (H3N2) в дозе 10 ЛД₅₀ в контрольной группе и при введении препаратов дсРНК-ИФНα2b (2,5 мг дсРНК и 2500 МЕ/кг) или препарата сравнения Тамифлю.

Сущность изобретения поясняется, но не ограничивается, следующими примерами 1-4.

Пример 1. Получение интраназальной формы препарата.

Интраназальную форму противовирусного средства, содержащего дсРНК и ИФН-α2b, получают смешиванием водного раствора субстанции - натриевой соли дсРНК (ФСП Р № 002021/01-07 04 20090769-08), активатора всасывания ДМСО с раствором рекомбинантного ИФН-α2b человека и вспомогательными компонентами в ламинарной системе КОЧ «Ламинар «С» с соблюдением правил асептики. Раствор композиции стерилизуют фильтрацией, разливают по 1 мл во флаконы из медицинского стекла марки НС-3 по ТУ 64-2-10-87, замораживают при минус 72°С и лиофилизируют в течение 16 ч при (22±2)°С в камере лиофильной сушки «FreeZone» в автоматическом режиме с опцией пневматической укупорки.

Для проведения исследования противовирусной эффективности получают композиции аналогичного состава, содержащие рекомбинантный ИФН-α2b в количестве 500 ME, или 2500МЕ, или 5000 ME на 1 мл.

Пример 1.1. Предлагаемый состав заявляемого препарата при содержании рекомбинантного интерферона альфа - 2b 500 ME на 1 мл буферной смеси:

Рекомбинантный интерферон альфа-2b, ME - 500

Натриевая соль двуспиральной

рибонуклеиновой кислоты, г - 0,0113 (дсРНК, г - 0,00226 г)

Диметилсульфоксид, г - 0,0005

Трилон Б (ЭДТА), г - 0,0005

Полиэтиленоксид, г - 0,0005

Изотонический раствор натрия хлорида - до 1 мл.

Пример 1.2. Предлагаемый состав противовирусного средства при содержании рекомбинантного интерферона альфа - 2b 2500 ME на 1 мл буферной смеси:

Рекомбинантный интерферон альфа-2b, ME - 2500

Натриевая соль двуспиральной

рибонуклеиновой кислоты, г - 0,0113 (дсРНК, г - 0,00226 г)

Диметилсульфоксид, г - 0,0005

Трилон Б (ЭДТА), г - 0,0005

Полиэтиленоксид, г - 0,0005

Изотонический раствор натрия хлорида - до 1 мл.

Пример 1.3. Предлагаемый состав заявляемого препарата при содержании рекомбинантного интерферона альфа - 2b 5000 ME на 1 мл буферной смеси:

Рекомбинантный интерферон альфа-2b, ME - 5000

Натриевая соль двуспиральной

рибонуклеиновой кислоты, г - 0,0113 (дсРНК, г - 0,00226 г)

Диметилсульфоксид, г - 0,0005

Трилон Б (ЭДТА), г - 0,0005

Полиэтиленоксид, г - 0,0005

Изотонический раствор натрия хлорида - до 1 мл.

Пример 2. Оценка физико-химических свойств и стабильности препарата

Подлинность и стабильность структуры дсРНК (наличие индивидуальных L- и М- форм) в композиционном препарате оценивают методом электрофореза в 1%-ном геле агарозы с окрашиванием этидиум бромидом в сравнении с исходным препаратом дсРНК.

ИК-спектры регистрируют на Фурье-спектрофотометре Infralum FT-801 в диапазоне длин волн 4000-500 см^-1. Для этого тонкоизмельченный образец тщательно перемешивают в агатовой ступке с порошком KBr (смесь 1% образца и 99% KBr), далее прессуют смеси в пресс-форме. В качестве контроля используют исходные компоненты: Na соль дсРНК, субстанцию ИФН-α2b.

На электрофореграммах, представленных на фиг. 1, на дорожках, соответствующих композиционному препарату (2) и контрольной субстанции (3), ясно визуализируются индивидуальные формы дсРНК (L-форма длиной 4500 п. н., М-форма-1500 п. н.), что подтверждает наличие в составе композиции активного компонента и его интактность. Сравнение электрофореграмм на фиг. 1.А и фиг. 1.Б показывает, что дсРНК в составе лиофилизированной интраназальной формы стабильна при хранении, по меньшей мере, в течение года.

ИК-анализ композиционного препарата в сравнении с его компонентами показал, что спектр композиции имеет те же максимумы поглощения, что и исходные компоненты в области 500-4000 см^-1 (фиг. 2А). Спектральные характеристики сохранялись после хранения препарата при 4-8°С в течение года (фиг. 2Б).

Пример 3. Исследование противовирусной активности образцов композиций в культурах клеток

Противовирусную активность заявляемого интраназального средства определяют биологическим микрометодом в 96-луночных планшетах в культуре клеток мышиных фибробластов L-929 и в культуре диплоидных клеток эмбриона легкого человека L-68 по подавлению цитопатического действия тест-вируса в соответствии с ГФ РФ XIV и [35].

Клеточные культуры получены из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. В качестве тест-вируса используют вирус энцефаломиокардита мышей штамм «Колумбия» (вирус ЕМС) в дозе 100 ЦПД₅₀. В качестве испытуемых препаратов используют: композиции, содержащие субстанцию дсРНК в количестве 0,0113 г (0,00226 г дсРНК) и ИФН-α2b в количестве 500 ME (противовирусное средство 1.1), либо 2500МЕ (противовирусное средство 1.2), либо 5000 ME (противовирусное средство 1.3), а также субстанцию Na соли дсРНК (производства ИМБТ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия) и ИФН-α2b с активностью 6,6×10⁶ МЕ/мл восстановленного раствора (АО «Вектор-Медика», Россия).

Для определения противовирусной активности ИФН на клетках линии L-68 готовят двукратные разведения исследуемых препаратов в среде 199 или Игла MEM, содержащей 2% по объему сыворотки крови плодов коров с добавлением антибиотиков. На каждое разведение используют не менее 4 лунок с клеточным монослоем. Из лунок удаляют среду и вносят по 0,1 мл приготовленных разведенных препаратов, 4 лунки с клеточным монослоем оставляют в качестве контрольных. Кроме того, 16 лунок оставляют для контроля дозы индикаторного вируса (вируса ЕМС). Содержимое лунок инкубируют в течение 1 суток при (37,0±1,0)°С в атмосфере (5,0±0,5) % СО₂, после чего в каждую лунку с испытуемыми материалами вносят определенную заранее дозу вируса, соответствующую 100 ТЦД₅₀ в 0,1 мл.

Д ля контроля дозы вируса используют по 4 лунки на каждое разведение вируса, начиная с разведения, соответствующего 100 ТЦД₅₀, до разведения, соответствующего 0,1 ТЦД₅₀, с коэффициентом разведения, равным 10. После внесения индикаторного вируса и титрования его дозы культуру клеток инкубируют при температуре (37,0±1,0)°С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂ на протяжении 1 или 2 суток (срок, когда определена доза вируса для тестирования).

Учет результатов определения противовирусной активности препарата проводят, когда доза внесенного вируса соответствует 100 ТЦД₅₀/0,1 мл. За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточный монослой в 50% лунок оказался полностью защищенным от цитопатического действия вируса.

Противовирусную (интерферониндуцирующую) активность дсРНК определяют в сыворотке крови мышей, полученной через 5 часов после введения композиционного препарата, титрованием на культуре клеток L929.

В каждую лунку 96-луночных полистироловых планшетов с плоским дном вносят по 0,1 мл суспензии клеток в среде 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота в концентрации 300 000 клеток в 1 мл и инкубируют в СО₂-инкубаторе при температуре 37°С в течение 24 ч. По завершении инкубации культуральную жидкость удаляют, а образовавшийся монослой клеток используют для определения цитопатической дозы (ЦПД₅₀) вируса и титра интерферона. ЦПД₅₀ соответствует дозе вируса, вызывающей деструкцию клеточных культур в 50% лунок. Для определения титра интерферона в лунки с клетками вносят двукратные разведения сывороток мышей. Планшеты инкубируют в течение 18 - 24 ч при температуре 37°С в CO₂-инкубаторе. Затем сыворотки удаляют и в каждую лунку вносят по 100 ЦПД₅₀ тест-вируса в 0,1 мл среды 199. Цитопатическое действие вируса на монослой клеток определяют спустя 24 ч инкубации при температуре 37°С в CO₂-инкубаторе. За титр интерферона принимают величину, обратную наибольшему разведению сыворотки, обеспечивающему 50% защиту клеточных культур от цитопатического действия 100 ЦПД₅₀ тест-вируса.

Экспериментальные данные, полученные на культуре клеток L929, свидетельствуют о том, что все исследованные композиции проявляли способность индуцировать синтез интерферона, более выраженную, чем у препарата сравнения дсРНК. При этом активность композиций дозозависимо возрастала при увеличении в препарате дозы ИФН-α2b (таблица 1).

В ходе исследования, проведенного на культуре клеток L-68, показано зависимое от дозы повышение противовирусной активности ИФН-α2b в составе композиций с дсРНК (таблица 1).

Полученные данные подтверждают сохранность противовирусных свойств дсРНК и ИФН-α2b в составе интраназальных композиций, а также свидетельствуют о синергидном действии компонентов в составе композиционного препарата.

Пример 4. Исследование противовирусной активности композиций на экспериментальной гриппозной модели

Противовирусную активность in vivo оценивают на мышах аутбредной популяции ICR обоего пола, 5-недельного возраста, массой 14-17 г. Адаптированный к мышам вирус гриппа (ВГ) A/Aichi/2/68 (H3N2) вводят анестезированным мышам интраназально в дозе 10 ЛД₅₀ в объеме 40 мкл суммарно в обе ноздри.

Для оценки противовирусной активности препаратов животных распределяют на 9 экспериментальных групп случайным образом, по 10 особей в группе.

Животным первой, второй и третьей опытных групп интраназально вводят заявляемое противовирусное средство 1 (пример 1.1), противовирусное средство 2 (пример 1.2), противовирусное средство 3 (пример 1.3), соответственно. Доза индуктора интерферона в составе заявляемых противовирусных средств составляет 2,5 мг/кг (50 мкг на мышь) по дсРНК; доза ИФН-α2b при введении в составе противовирусного средства 1 - 500 МЕ/кг, противовирусного средства 2 - 2500 МЕ/кг, противовирусного средства 3 - 5000 МЕ/кг (10 ME; 50 ME и 500 ME на мышь, соответственно). Животные четвертой группы (группа сравнения) получают интраназально раствор субстанции дсРНК в дозе 2,5 мг/кг (по дсРНК). Субстанцию ИФН-α2b вводят мышам пятой, шестой и седьмой групп сравнения в дозах 500 МЕ/кг, 2500 МЕ/кг или 5000 МЕ/кг, соответственно. Заявляемые противовирусные средства и препараты сравнения вводят интраназально за 3 ч до заражения ВГ, через 1 и 3 сут после заражения в объеме 20 мкл/мышь суммарно.

Положительным контролем является противовирусный препарат Тамифлю (Ля Рош Лтд., Швейцария), который вводят мышам восьмой группы перорально в дозе 15 мг/кг через 1 ч после заражения ВГ и далее дважды в сутки в течение 4 сут после заражения. Животные, инфицированные ВГ и не получавшие препаратов, составляют группу отрицательного контроля (группа 9).

Противовирусную активность препаратов оценивают по показателю гибели животных в течение 16 суток наблюдения после заражения ВГ, рассчитывают коэффициент защиты (КЗ) и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей. За максимальное значение продолжительности жизни для выживших животных принимают 16 суток после заражения ВГ, то есть гарантированное время прекращения гибели инфицированных мышей.

Статистическую обработку и сравнение данных, полученных при изучении противовирусной активности препаратов, осуществляют с помощью пакета компьютерных программ анализа данных «Statistica 12». Для проверки статистических гипотез о виде распределения показателей применяют критерий Колмогорова-Смирнова при вероятности ошибки р>0,10. СПЖ представляют в виде M±Sm, где М - среднее арифметическое значение и Sm -стандартное отклонение. Сравнение СПЖ мышей в разных группах проводят с использованием U-критерия Манна-Уитни. Для оценки межгрупповых различий доли выживших животных используют критерий χ² с учетом поправки Йетса для малых выборок. Различия показателей выживаемости животных оценивают с помощью кривых Каплана-Мейера по логранговому критерию в компьютерной программе анализа данных «Statistica 12». Отличия считаются статистически значимыми при р≤0,05.

Примечание: ^λ - доза индуктора интерферона представлена в дозе по двуспиральной РНК (дсРНК); n - число животных в каждой группе; и/н -интраназально; п/о - перорально; д/з - до заражения; п/з - после заражения; н/в - препараты не вводят; н/о - показатель не определяют; К3-коэффициент защиты (рассчитывают по формуле: К3 = % гибели в контроле - % гибели в опыте); СПЖ - средняя продолжительность жизни (за максимальный срок жизни выживших животных принимают 16 сут, эмпирически установленное, гарантированное время прекращения гибели инфицированных ВГ мышей); * - отличие от контроля по критерию χ² при р≤0,05; 2 - отличие от Тамифлю по критерию χ² при р≤0,05; ** - отличие от контроля по U-критерию Манна-Уитни при р≤0,05; ^## - отличие от Тамифлю по U-критерию Манна-Уитни при р≤0,05; М - среднее арифметическое значение, Sm -стандартное отклонение.

Введение мышам заявляемого противовирусного средства 2 по примеру 1.2 по лечебно-профилактической схеме обеспечивало защиту 50% инфицированных животных при увеличении средней продолжительности жизни в 2 раза по сравнению с контрольной группой (таблица 2). Показатели выживаемости мышей этой группы статистически не отличались от показателей животных группы сравнения «Тамифлю».

Количество выживших животных, которым вводили противовирусное средство 1, значимо не отличалось от показателей мышей с введением Тамифлю, однако средняя продолжительность жизни мышей этой группы была в 1,58 раза меньше, чем в группе «Тамифлю» (различия статистически значимы, р≤0,05) (таблица 2).

В группе мышей, которым вводили противовирусное средство 3 к концу срока наблюдения выжило всего 1 животное из 10. Введение субстанции дсРНК или ИФН-альфа-2b не обеспечивало защиты инфицированных мышей.

Анализ графиков выживаемости, построенных по методу Каплана-Мейера, представленных на фиг. 3, выявляет значимые отличия между контрольной группой мышей, инфицированных штаммом ВГ A/Aichi/2/68 (H3N2) в дозе 10 ЛД₅₀, и группами инфицированных мышей, получавших Тамифлю (р=0,00039) и противовирусное средство 2 (пример 1.2) (р=0,00326).

Таким образом, в результате экспериментального изучения на мышах показано, что противовирусное средство, содержащее индуктор интерферона дсРНК в виде субстанции в количестве 0,0113 г (0,00226 г по дсРНК) и ИФН-α2b в количестве 2500 ME на дозу, при трехкратном интраназальном введении мышам в дозе (2,5 мг дсРНК и 2500 ME ИФН-α2b)/кг проявляет выраженную противовирусную активность в отношении ВГ A/Aichi/2/68 (H3N2), чего не наблюдается после введения других противовирусных средств и компонентов композиции.

Источники научно-технической и патентной информации

1. Matsumoto М., Takeda Y., Tatematsu М., Seya Т. Toll-like receptor 3 signal in dendritic cells benefits cancer immunotherapy // Front. Immunol. - 2017. - Vol.8.-Article: 1897. doi: 10.3389/fimmu.2017.01897

2. Silverman R.H. Viral encounters with 2', 5'-oligoadenylate synthetase and RNase L during the interferon antiviral response // J. Virol. - 2007. - Vol. 81, No. 23. - P. 12720-12729. doi: 10.1128/JVI.01471-07

3. Zhang P., Samuel CE. The RNA-activated protein kinase enhances the induction of interferon-P and apoptosis mediated by cytoplasmic RNA sensors // J. Virol. - 2007. - Vol. 81. - P. 8192-8200. doi: 10.1074/jbc.M807888200

4. Saxena A., Belwal K., Chauhan A., Pande A. Interferon induced Mx protein from Indian snow trout Schizothorax richardsonii (Gray) lacks critical functional features unlike its mammalian homologues // Comput. Biol. Chem. - 2018. - Vol. 73. - P. 31-40. doi: 10.1016/j.compbiolchem.2017.12.011

5. Sasaki K., Yoneda A., Ninomiya A., Kawahara M., Watanabe T. Both antiviral activity and intracellular localization of chicken Mx protein depend on a polymorphism at amino acid position 631 // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2013.-Vol.430, No. 1. - P. 161-166. doi: 10.1016/j.bbrc.2012.11.053 6. Gantier M.P., Williams B.R. The response of mammalian cells to double-stranded RNA // Cytokine Growth Factor Rev. - 2007. - Vol. 18, No. 5-6. - P. 363-371. doi: 10.1016/j. cytogfr. 2007.06.016

7. Calderon B.M., Conn G.L. A human cellular noncoding RNA activates the antiviral protein 2-5-oligoadenylate synthetase 1 // J. Biol. Chem. - 2018. - Vol. 293, No. 41. - P. 16115-16124. doi: 10.1074/jbc.RA1 18.004747

8. Батенева A.B., Гамалей С.Г., Лебедев Л.Р. Даниленко Е.Д. Стимулирующее влияние дрожжевой двуспиральной РНК на активность генов белков системы интерферона // Медицинская иммунология. - 2020. - Т. 22, № 6. - С. 11555-1162. doi: 10.15789/1563-0625-SEO-2082

9. Каплина О.Н., Гамалей С.Г., Иванова О.С., Даниленко Е.Д. Двуспиральные РНК - перспективные адъюванты для повышения иммуногенности вакцин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2022. - Т. 99, №6. - С. 661-668. doi: 10.36233/0372-9311-342

10. Иванова О.С., Левагина Г.М., Батенева А.В., Гамалей С.Г., Богрянцева М.П., Даниленко Е.Д. Получение и исследование физико-химических и биологических свойств интраназальных форм аналога интерферона гамма человека // Цитокины и воспаление. - 2019. - Т. 18. №1-4. - С. 97-103.

11. Иванова О.С., Левагина Г.М., Скарнович М.О., Скарнович М.А., Шишкина Л.Н., Гамалей С.Г., Даниленко Е.Д. Получение и характеристика препарата двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae для интраназального применения // Биофарм. журн. - 2019. - Т. 11 №4. - С. 29-33. EDN: BZIJHI

12. Казмирчук Е.В., Ковальчук Л.В., Мальцев Д.В. Клиническая иммунология и аллергология с возрастными особенностями. - Киев: ВСИ «Медицина», 2012. -519 с.

13. Ярилин А.А. Иммунология. - М.: ГЭОТАР - Медиа, 2010. - 749 с.

14. Шумилов В.И., Шевцов В.А., Лобов СП. // Лечащий врач. - 2000. - № 9. - С. 20-21.

15. Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н. // Вопр. вирусол. - 2018. - Т. 63, № 1. - С. 10-18.

16. Рафальский В.В. Клиническое применение препаратов интерферона. - Смоленск, 2002. - 245 с.

17. Киселев О.И., Ершов Ф.И., Деева Э.Г. Интерферон-гамма: новый цитокин в клинической практике. ИНГ АРОН. - М.: Димитрэйд График Групп, 2007. -348 с.

18. Ищенко, В.И. Промышленная технология лекарственных средств: [учебное пособие] / В.И. Ищенко; Министерство здравоохранения Республики Беларусь, Витебский государственный медицинский университет.- 2-е изд. - Витебск: [ВГМУ], 2012. - 567 с.

19. Nakamura F., Ohta R., Machida Y., Nagai T. In vitro and in vivo nasal mucoadhesion of some water-soluble polymers // Int. J.Pharm. - 1996. - Vol. 134. - P. 17-81.

20. Патент RU 2140285 C1, 1999.10.27.

21. Патент RU 2108804 C1, 1998.04.20.

22. Патент RU 2201212 C1, 2003.03.27.

23. Патент RU 2381812 С1, 2010.02.20.

24. Патент RU 2277904 C1, 2004.05.05.

25. Патент RU 2 523 554 CI, 2013.03.27.

26. Патент RU 2444372 C1, 2010.02.10.

27. Pantelic L., Sivakumaran H., Urosevic N. Differential induction of antiviral effects against West Nile virus in primary mouse macrophages derived from flavivirus-susceptible and congenic resistant mice by alpha/beta interferon and poly(i-c) // J. Virol. - 2005. - Vol. 79, No. 3. - P. 1753-1764. doi: 10.1128/JVI.79.3.1753-1764.2005

28. Morrey J.D., Day C.W., Julander J.G., Wang H., Smee D.F., Christensen A.J., Furuta Y. Effect of interferon-alpha and interferon-inducers on West Nile virus in mouse and hamster animal models // Antivir. Chem. Chemother. - 2004. - Vol. 15, No. 2. - P. 101-109. doi: 10.1177/095632020401500202

29. Сысоева Г.М., Батенева A.B., Гамалей С.Г., Лебедев Л.Р., Даниленко Е.Д. Исследование иммуномодулирующих свойств композиционного препарата дсРНК фага ϕ6 и ИФН-альфа-2b // Рос. иммунол. журн. - 2016. - Т. 10 (19), № 2(1).-С. 454-456.

30. Патент RU 2437676 С1, 2011.07.27 (прототип).

31.Мурашкина И.А, Гордеева В.В. / Вспомогательные вещества в фармацевтической технологии. - Иркутск: ИГМУ, 2018. - 64 с.

32. Даниленко Е.Д., Белкина А.О., Сысоева Г.М. Создание лекарственных препаратов на основе высокополимерных двуспиральных РНК для противовирусной и противоопухолевой терапии // Биомед. химия. - 2019. - Т. 65, № 4. - С. 277-293. doi: 10.18097/РВМС20196504277

33. Абрамова С.Принципы выбора назальных деконгестантов // Фармацевтический вестник. - 2015. - № 27. - [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://pharmvestnik.ru/articles/printsipy-vybora-nazaljnyx-dekongestantov.html

34. Кукушкин Ю.Н. Диметилсульфоксид - важнейший апротонный растворитель // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - Т. 3, № 9. - С. 54-59.

35. Порываев В.Д., Рыжиков А.Б., Булычев Л.Е., Гончарова Е.П., Плясунов И.В., Алексеева А.Г., Карпышев Н.Н. Усиление катионными липосомами противовирусного и интерфероногенного действия индуктора интерферона ридостина in vitro и при интраназальном применении // Вопр. вирусологии. - 2003, № 4. - С. 45-47. EDN: OIWCYT.

Изобретение относится к интраназальному противовирусному средству, содержащему рекомбинантный интерферон альфа-2b и природный индуктор интерферона из дрожжей Saccharomyces cerevisiae в виде лиофилизата для приготовления раствора для интраназального применения, и может быть использовано в медицине и фармацевтике. Интраназальное противовирусное средство включает интерферон, индуктор интерферона, активатор всасывания диметилсульфоксид (ДМСО), выбранный из класса биполярных апротонных растворителей и обладающий противовоспалительным, антисептическим, анальгезирующим действием и криопротекторными свойствами, полиэтиленоксид, антиоксидант и стабилизатор. В качестве индуктора интерферона - натриевую соль двуспиральной рибонуклеиновой кислоты в виде субстанции, в качестве интерферона - рекомбинантный интерферон альфа-2b человека, в качестве антиоксиданта - Трилон Б (ЭДТА), в качестве стабилизатора - изотонический раствор натрия хлорида, а соотношение диметилсульфоксида и двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) составляет 1:4,5. Технический результат заявляемого изобретения состоит в создании такого интраназального противовирусного средства, которое обеспечивает усиление синтеза интерферона и противовирусного действия препарата за счет синергидного действия индуктора интерферона дсРНК и интерферона в определенном соотношении, а также усиления пенетрации активных компонентов через клеточные мембраны за счет введения в состав средства активатора всасывания. 3 ил., 2 табл., 4 пр.

Композиция для получения интраназального противовирусного средства в виде лиофилизата, характеризующаяся тем, что содержит диметилсульфоксид (ДМСО), индуктор интерферона, представляющий собой натриевую соль двуспиральной рибонуклеиновой кислоты в виде субстанции, рекомбинантный интерферон альфа-2b человека, Трилон Б (ЭДТА), полиэтиленоксид, изотонический раствор натрия хлорида, при соотношении диметилсульфоксида и двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) 1:4,52, при следующим количественном содержании компонентов в 1 мл раствора:

рекомбинантный интерферон альфа-2b 500-5000 ME натриевая соль двуспиральной рибонуклеиновой кислоты в количестве, обеспечивающем содержание дсРНК 0,00226 г диметилсульфоксид 0,0005 г Трилон Б (ЭДТА) 0,0005 г полиэтиленоксид 0,0005 г изотонический раствор натрия хлорида до 1 мл